肖宏華 ，馬長(zhǎng)華 ，馬秉智 ，孫 磊

（1.北京市朝陽(yáng)區(qū)食品藥品安全監(jiān)控中心，北京 100023；2.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 102488；3.中日友好醫(yī)院 藥學(xué)部，北京 100029；4.中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京 100050）

平肺口服液為中日友好醫(yī)院制劑，清肺化痰止咳、解毒散結(jié)、止血，用于肺部腫瘤引起的胸痛、咳痰、咳血等癥。處方由浙貝母、魚腥草、五味子、白及等十味藥組成。其中五味子為該處方中主要藥味，五味子醇甲為五味子中主要有效成分。為更好的控制產(chǎn)品質(zhì)量，保證臨床療效，本文參照《中國(guó)藥典》[1]及相關(guān)文獻(xiàn)[2～6]，建立了高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)器法（HPLC-DAD）測(cè)定平肺口服液中五味子醇甲的含量，為其質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

Agilent 1260型高效液相色譜儀 （DAD檢測(cè)器，二元泵，OpenLAB色譜數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)）；Waters Sunfire C18色譜柱（4.6mm×250mm，5μm）；XS-205 DU 型 1/10 萬(wàn)電子天平（METTLER-TOLEDO）；明澈 TM-D 24 UV 純水/超純水系統(tǒng)（Merck Millipore）。

五味子醇甲（批號(hào)110857-201714，含量以99.9%計(jì)）購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；乙腈、甲醇、磷酸均為色譜純（Fisher Chemical）；水為超純水（自制）；平肺口服液（中日友好醫(yī)院中藥制劑室生產(chǎn)，批號(hào)分別為20160509、20170412、20170628、20170818）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Waters Sunfire C18 色譜柱 （4.6mm×250mm，5μm）；乙腈-0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相，按表1進(jìn)行梯度洗脫，流速1.0ml/min，檢測(cè)波長(zhǎng) 216nm，光譜范圍：190.0～400.0nm，步進(jìn)值1.0nm，柱溫35℃，進(jìn)樣量：對(duì)照品溶液5μl、供試品溶液 20μl、陰性對(duì)照溶液 20μl。

2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取五味子醇甲對(duì)照品11.52mg，置100 ml量瓶中，加甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液（115.08mg/L）。精密量取2ml，置10ml量瓶中，加甲醇使溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對(duì)照品溶液（23.02mg/L）。

表1 流動(dòng)相梯度條件

2.3 供試品溶液的制備

取本品5支，將內(nèi)容物倒入同一具塞錐形瓶中，搖勻。精密量取2ml，置10ml量瓶中，加水使溶解并稀釋至刻度，搖勻，用0.45μm濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.4 陰性對(duì)照溶液的制備

依據(jù)平肺口服液的處方及制法，制備缺五味子的陰性樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法制備陰性對(duì)照溶液。

2.5 專屬性考察

圖1 平肺口服液HPLC色譜圖

圖2 對(duì)照品色譜峰與供試品色譜峰光譜圖

分別取對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照溶液按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果顯示在五味子醇甲對(duì)照品色譜峰相應(yīng)保留時(shí)間處，陰性對(duì)照溶液色譜中沒(méi)有對(duì)應(yīng)的色譜峰，說(shuō)明陰性樣品對(duì)待測(cè)組分無(wú)干擾。在供試品色譜中待測(cè)組分與其他組分分離度＞1.5，得到很好的分離，色譜圖見(jiàn)圖1。利用OpenLAB色譜數(shù)據(jù)處理軟件的光譜功能，分析供試品色譜中在與對(duì)照品色譜峰相應(yīng)保留時(shí)間處的色譜峰的光譜圖，結(jié)果與對(duì)照品色譜峰的光譜圖一致，并對(duì)該色譜峰進(jìn)行純度檢測(cè)，純度因子為999.6，表明該方法專屬性良好，光譜圖見(jiàn)圖2。

2.6 線性關(guān)系考察

精 密 量 取 對(duì) 照 品 儲(chǔ) 備 液 （115.08mg/L）1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml、6.0ml分別置 10ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以峰面積積分值為縱坐標(biāo)（Y），對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)（X），進(jìn)行線性回歸，回歸方程為 Y=30.43X+3.873，r=1（n=5）。結(jié)果表明，五味子醇甲濃度在11.51～69.11mg/L范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

表2 平肺口服液加樣回收率試驗(yàn)（n=9）

圖3 不同儀器的供試品HPLC色譜圖

取對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積，結(jié)果峰面積RSD為 0.13%，表明儀器重復(fù)性良好。取供試品按“2.3”項(xiàng)下方法平行制備6份，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算五味子醇甲含量，結(jié)果平均含量為23.88mg/L，RSD為1.18%，表明方法的重復(fù)性良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取供試品溶液，室溫下分別于 0，2h、4，8h、12h、24h 按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果 RSD為 1.20%（n=6），表明供試品溶液在室溫下24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.9 加樣回收率試驗(yàn)

精密量取已知含量的供試品2ml，置10ml量瓶中。制備9份，3份一組，分別加入含量50%、100%、150%的五味子醇甲對(duì)照品溶液，再加水稀釋至刻度，搖勻，用0.45μm濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，進(jìn)樣10μl測(cè)定，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見(jiàn)表2。

2.10 樣品測(cè)定

取4批平肺口服液樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，進(jìn)樣10μl測(cè)定，五味子醇甲含量（mg/L）分別為 23.88、29.70、16.38 和 14.57。

2.11 耐用性考察

取同一供試品溶液，分別采用Agilent-1260-DAD型、Waters-e2695-2498UV型、SHIMADZU-2010AHT型 3臺(tái)高效液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定，色譜圖見(jiàn)圖3。并且分別比較了Waters Sunfire C18色譜柱、Supleco Discovery C18色譜柱、Agilent ZORBAX Eclipse C18色譜柱，考察了不同柱溫（30℃、35℃、40℃），除五味子醇甲保留時(shí)間略有變動(dòng)外，其余均無(wú)明顯差異。

3 討論

3.1 提取溶劑與提取方法的選擇

供試品溶液制備時(shí)，考察了水、甲醇、50%甲醇作為溶劑，甲醇、50%甲醇可以使樣品溶液產(chǎn)生沉淀，去除一些雜質(zhì)，但稀釋過(guò)程中會(huì)放熱，這就給定容造成誤差。另外，比較了直接稀釋法、乙酸乙酯萃取法、中性氧化鋁吸附法的處理效果，結(jié)果表明采用水作為溶劑直接稀釋，簡(jiǎn)便易行，可以達(dá)到很好的效果。

3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

通過(guò)DAD檢測(cè)器，在190.0～400.0nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)對(duì)五味子醇甲進(jìn)行掃描，發(fā)現(xiàn)其在216nm和250nm波長(zhǎng)處有最大吸收，且供試品色譜圖在這兩處波長(zhǎng)下均無(wú)其他組分干擾，基線平穩(wěn)，但是，在216nm波長(zhǎng)處五味子醇甲有較高的響應(yīng)值，故選擇216nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.3 流動(dòng)相的選擇

考察了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸溶液3種流動(dòng)相系統(tǒng)的分離效果，結(jié)果表明當(dāng)乙腈-0.1%磷酸溶液作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫時(shí)，所得色譜峰保留時(shí)間和峰面積最穩(wěn)定，峰形最好，分離效果最佳。

3.4 平肺口服液含測(cè)成分的選取

平肺口服液處方中含有預(yù)知子、浙貝母、魚腥草等眾多藥味，經(jīng)過(guò)前期研究發(fā)現(xiàn)，五味子醇甲為《中國(guó)藥典》中五味子質(zhì)量控制指標(biāo)[1]，在該制劑中含量較高，且化學(xué)性質(zhì)相對(duì)穩(wěn)定，故選擇測(cè)定平肺口服液中五味子醇甲的含量，后續(xù)還將對(duì)其他成分進(jìn)行含量測(cè)定研究，從而建立平肺口服液的質(zhì)量控制方法。

3.5 樣品測(cè)定結(jié)果分析

由樣品測(cè)定結(jié)果可知，4批次平肺口服液中五味子醇甲含量存在明顯的差異。究其原因，一方面可能與五味子藥材質(zhì)量有關(guān)，不同產(chǎn)地、不同的采收時(shí)間，五味子中五味子醇甲的含量有較大區(qū)別，五味子采收后，隨著存儲(chǔ)時(shí)間的延長(zhǎng)，五味子中五味子醇甲的含量有降低的趨勢(shì)[3]。另一方面可能與生產(chǎn)工藝、提取過(guò)程等環(huán)節(jié)有關(guān)，有待于進(jìn)一步研究。

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