竇毅鵬

摘 要：細(xì)胞培養(yǎng)是研究體內(nèi)細(xì)胞在體外生物學(xué)行為的重要的研究手段。傳統(tǒng)的細(xì)胞培養(yǎng)是在培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶的二維平面上進(jìn)行的，這與細(xì)胞在體內(nèi)所處的三維生長環(huán)境有著很大的區(qū)別。三維（3D）培養(yǎng)則是一種可以使細(xì)胞在體外條件下在進(jìn)行三維生長的培養(yǎng)方法，可以更好地模擬細(xì)胞在體內(nèi)的生長狀況及環(huán)境。在三維培養(yǎng)條件下細(xì)胞的許多生物學(xué)行為與傳統(tǒng)的二維培養(yǎng)有著很大的不同，其應(yīng)用領(lǐng)域也有更廣泛的擴(kuò)張，具有重要的研究意義。本文將對三維細(xì)胞培養(yǎng)的發(fā)展、特點(diǎn)及應(yīng)用進(jìn)行簡要的綜述。

關(guān)鍵詞：3D 細(xì)胞培養(yǎng) 體外培養(yǎng) 支架技術(shù)

中圖分類號：Q813 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號：1672-3791（2018）01（c）-0247-02

1 3D細(xì)胞培養(yǎng)的發(fā)展過程

自從四十多年前常規(guī)真核細(xì)胞培養(yǎng)出現(xiàn)以來，支持細(xì)胞生長的最常見的物質(zhì)為聚苯乙烯或玻璃，細(xì)胞在其平坦的二維表面可以進(jìn)行生長。應(yīng)用這種細(xì)胞貼壁培養(yǎng)的方法，已經(jīng)有成千上萬的關(guān)于腫瘤細(xì)胞或正常細(xì)胞生物行為的研究被發(fā)表。然而，對這些研究所基于的一個(gè)主要假設(shè)是，體外單層培養(yǎng)的細(xì)胞可以再現(xiàn)生物細(xì)胞在體內(nèi)的生理學(xué)行為。顯然，在二維的玻璃或聚苯乙烯底物上生長的真核細(xì)胞并不能準(zhǔn)確地反映出自然條件下組織中細(xì)胞的生長及與細(xì)胞外基質(zhì)的準(zhǔn)確的相互作用。

已經(jīng)有研究發(fā)現(xiàn)，在體外培養(yǎng)條件下所觀察到的許多復(fù)雜的生物學(xué)反應(yīng)如受體表達(dá)、RNA轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞遷移和細(xì)胞凋亡等與在體內(nèi)器官或組織中所觀察到的并不相同。從正常的細(xì)胞分裂、細(xì)胞增殖到細(xì)胞遷移及細(xì)胞凋亡等細(xì)胞生物學(xué)行為都是需要依賴于空間和時(shí)間的精確調(diào)控。相比之下二維的細(xì)胞的培養(yǎng)方法則相對簡單，忽略了這些已知的對細(xì)胞生長和組織生理學(xué)的精確調(diào)控有重要意義的參數(shù)。這其中包括機(jī)械力的信號、細(xì)胞與細(xì)胞基質(zhì)之間的信號傳遞以及相鄰細(xì)胞微環(huán)境之間的信號溝通。特別是在細(xì)胞間信號傳遞方面，許多二維培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)未考慮不同細(xì)胞類型之間的相互作用，絕大多數(shù)培養(yǎng)物是單一細(xì)胞類型。雖然隨著研究方法的發(fā)展，二維培養(yǎng)部分程度地克服了這些缺陷中的一些，但在準(zhǔn)確再現(xiàn)組織內(nèi)觀察到的細(xì)胞功能方面還有一些欠缺。

針對這些問題，為了更好的模擬體內(nèi)的細(xì)胞生長模式，研究者們通過各種努力，開發(fā)出了許多方法使得細(xì)胞可以在體外進(jìn)行三維條件下的生長，也就是3D培養(yǎng)。最初的一個(gè)簡單的出發(fā)點(diǎn)是將細(xì)胞引入多孔生物相容性支架，是細(xì)胞在支架中進(jìn)行生長。然而，3D系統(tǒng)的復(fù)雜性隨著許多參數(shù)的考慮而變得明顯。其中就包括對不同材料支架的選擇、細(xì)胞的來源以及實(shí)際的培養(yǎng)方法等，根據(jù)這些因素的不同，對于不同組織來源的細(xì)胞所進(jìn)行的3D培養(yǎng)方法也具有很大差異。隨著研究的不斷深入目前已經(jīng)有根據(jù)特定細(xì)胞所設(shè)計(jì)的不同的3D培養(yǎng)條件。并且在不同的細(xì)胞生物學(xué)行為實(shí)驗(yàn)中有著不同的應(yīng)用。

2 3D細(xì)胞培養(yǎng)的分類

一般來說，三維培養(yǎng)可分為有支架技術(shù)和無支架技術(shù)兩種。這兩種培養(yǎng)模式在不同的研究中具有應(yīng)用。

2.1 支架技術(shù)

細(xì)胞支架技術(shù)又可根據(jù)使用的支架材料的不同分為用固體支架，水凝膠和其他材料。其中水凝膠技術(shù)是應(yīng)用的最為廣泛的一種。因?yàn)樘烊坏募?xì)胞外基質(zhì)在細(xì)胞的存活、增殖、分化以及遷移中均扮演著重要的角色，而不同成分的水凝膠被認(rèn)為是用來模擬不同天然細(xì)胞外基質(zhì)的較為理想的材料。3D培養(yǎng)所用的水凝膠由具有高保水性的相互連接的孔組成，其中包含了各種細(xì)胞生長所需的營養(yǎng)素和氣體。來自天然和合成材料的幾種不同類型的水凝膠均可用于3D細(xì)胞培養(yǎng)，例如動(dòng)物細(xì)胞外基質(zhì)提取物水凝膠、蛋白質(zhì)水凝膠、肽水凝膠、聚合物水凝膠及木基納米纖維素水凝膠等。

處理水凝膠支架外許多其他的材料也都在被嘗試用于細(xì)胞的3D培養(yǎng)，例如，使用天然來源或合成材料作為支架，使用自體或成體干細(xì)胞作為支架，以及使用精確的納米結(jié)構(gòu)材料作為支架，更有研究應(yīng)用具有近似幾何形狀的微結(jié)構(gòu)支架以維持細(xì)胞生長。

2.2 無支架技術(shù)

無支架技術(shù)是另一種獨(dú)立于支架技術(shù)的3D細(xì)胞培養(yǎng)方法。無支架的培養(yǎng)方法包括使用低粘附細(xì)胞培養(yǎng)板、懸滴培養(yǎng)板、微圖案表面和旋轉(zhuǎn)生物反應(yīng)器以及磁懸浮和磁性3D生物打印等。其中生物反應(yīng)器是較新也較為復(fù)雜的一種培養(yǎng)裝置。用于三維細(xì)胞培養(yǎng)的生物反應(yīng)器是小型塑料圓柱形腔室，專門設(shè)計(jì)用于三維培養(yǎng)細(xì)胞。生物反應(yīng)器使用生物活性合成材料，如聚對苯二甲酸乙二醇酯膜，在維持高水平營養(yǎng)的環(huán)境中包圍球狀細(xì)胞。這一裝置可以很容易打開和關(guān)閉，使細(xì)胞球體可以用于實(shí)驗(yàn)測試，但同時(shí)細(xì)胞培養(yǎng)的環(huán)境能夠保持100%的濕度，這個(gè)濕度對于獲得最佳的細(xì)胞生長狀態(tài)和完整的細(xì)胞功能具有重要意義。單個(gè)的生物反應(yīng)器室被組裝入更大的裝置中，可以使其旋轉(zhuǎn)，從而確保在三個(gè)維度上的每個(gè)方向上的細(xì)胞生長狀況相同。

3 3D細(xì)胞培養(yǎng)的應(yīng)用

在活體組織中，細(xì)胞存在于三維微環(huán)境中，具有復(fù)雜的細(xì)胞-細(xì)胞和細(xì)胞-基質(zhì)相互作用以及復(fù)雜的營養(yǎng)物質(zhì)和細(xì)胞的運(yùn)輸動(dòng)力學(xué)。常規(guī)的二維或單層細(xì)胞培養(yǎng)不足以代表這種環(huán)境，這往往使得它們不能作為體內(nèi)藥物療效和毒性預(yù)測指標(biāo)篩選的實(shí)驗(yàn)方法。因此3D細(xì)胞培養(yǎng)越來越多地被用于藥物毒理學(xué)篩選。另外，3D細(xì)胞培養(yǎng)具有比二維細(xì)胞培養(yǎng)更高的穩(wěn)定性和更長的壽命。在2D中，細(xì)胞必須定期進(jìn)行胰蛋白酶消化，以便為細(xì)胞正常生長提供充足的營養(yǎng)，而3D環(huán)境還可以使細(xì)胞不受干擾地生長，三維球體已經(jīng)在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中養(yǎng)殖長達(dá)302d，同時(shí)仍然保持健康的非癌性生長。這意味著他們更適合長期研究和證明藥物的長期效應(yīng)。

在研究細(xì)胞間信號傳遞以及細(xì)胞外基質(zhì)與細(xì)胞的相互作用方面，3D球狀體更接近體內(nèi)組織。3D培養(yǎng)基質(zhì)可以幫助細(xì)胞能夠在其球體內(nèi)移動(dòng)，類似于細(xì)胞在活組織中移動(dòng)的方式。因此，3D培養(yǎng)也是研究細(xì)胞遷移、分化以及存活和生長的理想模型。此外，三維細(xì)胞培養(yǎng)可以提供更精確的細(xì)胞極化描述，而在2D中，細(xì)胞只能部分極化。并且，3D培養(yǎng)可以實(shí)現(xiàn)對細(xì)胞外機(jī)械力信號傳遞的研究。而在細(xì)胞基因功能研究方面，在3D中生長的細(xì)胞表現(xiàn)出與在2D中生長的細(xì)胞不同的基因表達(dá)，在3D中生長的體外細(xì)胞的基因表達(dá)比2D更具有應(yīng)用價(jià)值，因?yàn)?D球狀體的基因表達(dá)將更接近于體內(nèi)的基因表達(dá)。

綜上所述，3D細(xì)胞培養(yǎng)與傳統(tǒng)二維培養(yǎng)具有很多優(yōu)勢，是一種能夠更好模擬體內(nèi)環(huán)境的培養(yǎng)方法，并且正處在快速的方法革新過程之中。同時(shí)，這一方法的建立也需要相對復(fù)雜的條件及技術(shù)。目前，3D培養(yǎng)技術(shù)在腫瘤藥物的研發(fā)、細(xì)胞生物學(xué)行為以及基因功能的研究方面均表現(xiàn)出重要的價(jià)值，因此，掌握這一方法對今后細(xì)胞生物學(xué)行為的研究具有重要的意義。

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