沈大航, 喬文君, 劉 智, 童華榮, 陳應(yīng)娟(西南大學(xué),食品科學(xué)學(xué)院茶學(xué)系,食品科學(xué)與工程國家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心,重慶 400715)

【研究意義】炭疽菌屬(Colletotrichum)是子囊菌的一大類，種類復(fù)雜，一直以來對(duì)許多重要的農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)和園藝作物均造成了嚴(yán)重危害，為害范圍廣，在植物病原真菌中占有非常重要的地位[1]，其中以C.gloeosporioides(有性型為Glomerellacingulata)[2-4]和C.acutatum(有性型為G.acutata)[5]最為常見。茶云紋葉枯病就是由Colletotrichum真菌引起的茶樹葉部病害，是茶樹的主要病害之一，在中國、日本、印度、斯里蘭卡等茶樹種植國均有相關(guān)報(bào)道，嚴(yán)重影響茶樹的產(chǎn)量和茶葉品質(zhì)[6-7]。為有效防治炭疽菌所引發(fā)的病害，必須對(duì)炭疽菌的進(jìn)化與種類、生物學(xué)特性及致病機(jī)制有充分了解，才能有針對(duì)性地控制病害的發(fā)生?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】已報(bào)道的能侵染茶樹葉片的炭疽菌屬致病菌種類不多，有3個(gè)種的記錄，分別為C.camelliae、C.crassipes和C.gloeosporioides[8]。近年來，隨著分子診斷技術(shù)在植物病原菌鑒定中應(yīng)用，越來越多新記錄種不斷被鑒定出來。劉威等[9]在福建茶樹上發(fā)現(xiàn)并證實(shí)C.fructicola可侵染茶樹并引發(fā)病癥。王玉春等(2015)[10]采用系統(tǒng)發(fā)育學(xué)和形態(tài)學(xué)相結(jié)合的方法對(duì)中國 15 省(市、自治區(qū))部分茶區(qū)茶樹病葉進(jìn)行病原菌鑒定，基本明確C.siamense為中國茶樹病原菌。【本研究切入點(diǎn)】本實(shí)驗(yàn)室從重慶地區(qū)感病茶樹葉片上分離到了多種炭疽菌，經(jīng)形態(tài)學(xué)方法、rDNA-ITS序列比對(duì)以及致病性分析，其中1種被鑒定為C.acutatum，是茶樹上的新致病種[11-12]，而C.gloeosporioides為重慶地區(qū)茶園的優(yōu)勢(shì)種?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本文對(duì)炭疽菌C.acutatum和C.gloeosporioides進(jìn)行了生物學(xué)特性比較和毒素活性初探，以了解茶樹炭疽菌的發(fā)生規(guī)律及致病機(jī)制，為茶樹病害的有效防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

供試菌株來自2014-2015年從重慶永川、萬盛、二圣鎮(zhèn)等茶葉種植區(qū)采集的感病樣本，經(jīng)常規(guī)組織分離法和單孢分離法獲得了純培養(yǎng)菌，采用形態(tài)學(xué)鑒定和多基因遺傳進(jìn)化分析鑒定為C.acutatum和C.gloeosporioides，其中C.acutatum為茶樹上的新致病種[11-12]。

1.2 方法

1.2.1 不同培養(yǎng)基對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響 將在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)5 d 的炭疽菌菌落用內(nèi)徑為5 mm打孔器打成菌塊，分別接種在PDA(馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基)、PSA(馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基)、OA(燕麥培養(yǎng)基)、TLA(茶樹葉片浸汁培養(yǎng)基)和YMMA(霉菌培養(yǎng)基)5種培養(yǎng)基中，(25±2) ℃，12 h/d 光照培養(yǎng)7 d后用十字交叉法測(cè)量菌落直徑并觀察菌落形態(tài)，每個(gè)處理5個(gè)重復(fù)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)3次。

PDA：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂粉20 g、水1000 mL；PSA：馬鈴薯200 g、蔗糖20 g、瓊脂粉20 g、水1000 mL；OA：燕麥片30 g、瓊脂粉20 g、水1000 mL；TLA：茶樹葉片20 g、瓊脂粉20 g、水1000 mL；YMMA：蛋白胨5 g、葡萄糖10 g、瓊脂粉20 g、水1000 mL。

1.2.2 溫度對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響 把用內(nèi)徑為5 mm打孔器在活化后的炭疽菌菌落邊緣打取菌絲塊，接種到PDA平板中央，每個(gè)處理5次重復(fù)，分別放置于10、15、20、25、28、30、35、40 ℃培養(yǎng)箱下培養(yǎng)，7 d后用十字交叉法測(cè)量不同溫度培養(yǎng)下菌落的生長(zhǎng)直徑。

1.2.3 菌絲致死溫度測(cè)定 將用以上方法打取的菌絲塊放入滅過菌的5 mL EP管中，加入4 mL無菌水，40、45、50、55、60、65 ℃恒溫水浴中加熱處理15 min，每處理5次重復(fù)。然后將菌塊取出移至PDA平板培養(yǎng)基上，25 ℃培養(yǎng)7 d，觀察各菌株菌落生長(zhǎng)情況。

1.2.4 茶樹炭疽菌毒素濾液的制備 將在PDA上培養(yǎng)5 d的供試菌株，采用直徑5 mm的打孔器取菌餅圓片，然后將菌餅圓片接種于盛有50 mL Czapek-Dox培養(yǎng)液的三角瓶中，每個(gè)三角瓶接種5個(gè)菌餅后，放入25 ℃震蕩培養(yǎng)箱中，每個(gè)處理各取振蕩培養(yǎng)0、3、6、9、12和15 d的培養(yǎng)液。選用4層滅菌紗布過濾培養(yǎng)液，濾液在5000 r/min離心機(jī)中低速離心15 min，取上清，顯微鏡鏡檢無病原菌分生孢子和菌絲即獲得病原菌毒素培養(yǎng)液，4 ℃保存?zhèn)溆谩＿^濾出的菌絲在60 ℃烘箱中烘干，稱量干重。

1.2.5 茶樹炭疽菌毒素的毒性檢測(cè) 參照張衛(wèi)民(1995)[13]和劉守安等(2007)[14]的活體浸梢法進(jìn)行茶樹炭疽菌毒素的致病性檢測(cè)。將制備好的茶樹炭疽菌毒素濾液各取20 mL分別加入50 mL小燒杯中，以盛有等體積無菌水和純培養(yǎng)液的處理為對(duì)照。取一芽三葉的福鼎大白茶樹新梢，先用自來水沖洗干凈，再用75 %乙醇處理30 s，無菌水沖洗3次后將其新梢基部浸入各燒杯中，每燒杯放入3枝茶樹新梢，置于(25±2)℃恒溫光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，觀察記錄茶樹新梢的感病狀況，設(shè)置3次重復(fù)試驗(yàn)。茶樹新梢感病狀況分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)見表1。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用IBM SPS 20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，Turkey HSD進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

表1茶樹炭疽菌毒素濾液對(duì)茶樹新梢的傷害程度標(biāo)準(zhǔn)

Table 1 Standard for disease level ofColletotrichumspecies toxins on tea shoots

病情分級(jí)Disease level癥狀Symptom0級(jí)正常1級(jí)出現(xiàn)1^2個(gè)輕微壞死斑,葉片輕度萎蔫2級(jí)1/3葉片邊緣壞死,葉片卷曲萎蔫3級(jí)1/2葉片邊緣壞死,葉片卷曲萎蔫、失綠,其中1^2片葉壞死 4級(jí)葉片萎蔫至茶梢枯死

表2 不同培養(yǎng)基對(duì)茶炭疽菌生長(zhǎng)的影響Table 2 Effect of various culture mediums on growth of Colletotrichum species

注：表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，同列數(shù)據(jù)后不同字母表示經(jīng)Tukey HSD法檢驗(yàn)P<0. 05 水平差異顯著。

Note：Data are mean±SD．Different letters on the same column indicate significant difference atP<0. 05 level by Tukey HSD.

2 結(jié)果與分析

2.1 茶樹炭疽菌的生物學(xué)特性

2.1.1 不同培養(yǎng)基對(duì)茶樹炭疽菌菌落生長(zhǎng)的影響C.gloeosporioides和C.acutatum在5種不同培養(yǎng)基上生長(zhǎng)7 d后的培養(yǎng)結(jié)果表明，2種炭疽菌在不同培養(yǎng)基上的菌落生長(zhǎng)情況比較相似，均能進(jìn)行生長(zhǎng)，總體上講，C.gloeosporioides的生長(zhǎng)速度快于C.acutatum。如表2所示，2種菌的菌落生長(zhǎng)速度以及菌落形態(tài)因培養(yǎng)基不同差異顯著，其中以在PDA和PSA上生長(zhǎng)最好，且與在其他培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落存在顯著性差異，可視為是炭疽菌生長(zhǎng)的最適培養(yǎng)基。其次是OA培養(yǎng)基，然后是YMMA培養(yǎng)基，而在TLA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最差，2種菌的菌落大小僅分別為3.93和3.23 cm，且菌落疏松、菌絲少，不利于炭疽菌的生長(zhǎng)。

2.1.2 溫度對(duì)茶炭疽菌生長(zhǎng)的影響 如圖1所示，茶樹2種炭疽菌在10～40 ℃的溫度范圍內(nèi)培養(yǎng)7 d均能進(jìn)行生長(zhǎng)，10～25 ℃內(nèi)，隨溫度的升高，菌落生長(zhǎng)速度均顯著加快，且C.gloeosporioides的生長(zhǎng)較C.acutatum快；28 ℃時(shí)，C.gloeosporioides和C.acutatum的菌落生長(zhǎng)速度均最快，在第7天時(shí)菌落直徑可分別擴(kuò)展到8.53和7.93 cm, 這與25 ℃時(shí)菌落生長(zhǎng)速度差異并不顯著，但與其它溫度下培養(yǎng)的菌落直徑存在顯著性差異(P<0. 05)，因此認(rèn)為25～28 ℃為2種茶樹炭疽菌的最適生長(zhǎng)溫度；從28到40 ℃，2種炭疽菌的生長(zhǎng)速度隨溫度的升高而急劇下降，到40 ℃時(shí)，菌落培養(yǎng)7 d僅擴(kuò)展不到2 cm，但在較高溫度下C.acutatum的生長(zhǎng)快于C.gloeosporioides。

2.1.3 菌絲致死溫度 如表3所示，經(jīng)40～55 ℃水浴處理15 min后，2種茶炭疽菌C.gloeosporioides和C.acutatum菌塊均能進(jìn)行正常生長(zhǎng)，以后隨著溫度的升高，菌塊在60 ℃水浴處理后，C.gloeosporioides完全停止生長(zhǎng)，而C.acutatum5個(gè)重復(fù)中尚有2個(gè)菌塊能進(jìn)行生長(zhǎng)，65 ℃水浴處理后的菌塊則能完全停止生長(zhǎng)，說明C.gloeosporioides的菌絲致死溫度為60 ℃，而C.acutatum的致死溫度可以認(rèn)為是60～65 ℃。

2.2 茶樹炭疽菌毒素活性分析

本研究參考劉守安等(2007)[14]的方法比較了茶樹炭疽菌在Czapek-Dox培養(yǎng)液、馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)液(PDB)和茶樹葉片浸汁培養(yǎng)液中的菌絲生長(zhǎng)情況，確定了最適合炭疽菌生長(zhǎng)的培養(yǎng)液為Czapek-Dox培養(yǎng)液，并以Czapek-Dox培養(yǎng)液進(jìn)行茶樹炭疽菌的培養(yǎng)。采用茶枝活體浸梢法對(duì)2種炭疽菌C.gloeosporioides和C.acutatum的毒素活性進(jìn)行初步分析，結(jié)果表明，在振蕩培養(yǎng)3和6 d的2種炭疽菌毒素濾液中茶枝浸枝處理9 d后仍未觀察到明顯的毒素癥狀；在培養(yǎng)9 d的毒素濾液中則只觀察到輕微的萎焉癥狀；在培養(yǎng)12和15 d的毒素濾液中癥狀出現(xiàn)最快，如表4所示，在培養(yǎng)15 d的C.gloeosporioides毒素濾液中，茶枝在浸枝處理3 d后最先出現(xiàn)輕微的局部組織壞死癥狀，受害等級(jí)參考表1描述為1級(jí)，隨后壞死病斑逐漸擴(kuò)大，葉片萎蔫、卷曲癥狀逐漸加重，直至枝梢干褐枯死，受害等級(jí)描述為4級(jí)，相比之下，C.acutatum毒素濾液處理的茶枝，癥狀稍弱，在浸枝處理4 d后才可見明顯癥狀，12 d才能全部萎焉枯死。圖2為在培養(yǎng)15 d的毒素濾液中茶枝浸枝6 d后的新梢癥狀，清水處理的茶枝仍能正常生長(zhǎng)，C.gloeosporioides毒素濾液處理的茶枝葉片則出現(xiàn)壞死病斑及萎焉癥狀，而C.acutatum毒素濾液處理的茶枝癥狀較弱。以上結(jié)果表明，C.acutatum的毒素活性弱于C.gloeosporioides。

圖中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，同種菌數(shù)據(jù)上方的不同字母表示經(jīng)Turkey HSD法檢驗(yàn)P<0. 05 水平差異顯著Data are mean±SD．Different letters on the same column indicate significant difference at P<0. 05 level by Tukey HSD圖1 不同溫度對(duì)茶炭疽菌生長(zhǎng)的影響Fig.1 Effect of various temperature on growth of Colletotrichum species

表3 不同溫度處理下茶炭疽菌菌落的生長(zhǎng)情況Table 3 Growth of Colletotrichum species under different temperatures

注: +表示“生長(zhǎng)”；-表示“不生長(zhǎng)”。

Note：+ represents ‘growth’；- represents ‘no growth’.

表4 茶樹炭疽菌毒素濾液對(duì)茶樹新梢的傷害程度Table 4 Disease level of Colletotrichum species toxins on tea shoots

注：圖中數(shù)值表示茶枝在振蕩培養(yǎng)15 d后的茶樹炭疽菌毒素濾液中浸梢處理0、3、6、9和12 d后的傷害情況。

Note：The data in Table 4 indicate the disease level ofColletotrichumspecies toxins cultured on culture media for 15 days on tea shoots at 0, 3, 6, 9 and 12 days.

A. CK(純培養(yǎng)液處理);B. C. gloeosporioides毒素濾液處理的茶枝;C. C. acutatum毒素濾液處理的茶枝A. CK1 (tea shoots treated with culture media only); B. Tea shoots treated with C. gloeosporioides toxins; C. Tea shoots treated with C. acutatum toxins圖2 茶樹炭疽菌毒素處理茶樹新梢后的癥狀Fig.2 Symptoms of tea shoots caused by Colletotrichum species toxins

3 討 論

C.acutatumJ.H. Simmonds ex J.H. Simmonds是1965年由Simmond[15]所發(fā)現(xiàn)的能引起水果腐爛的病原菌，近年來隨著分子標(biāo)記技術(shù)和PCR診斷技術(shù)在植物病害鑒定中的應(yīng)用，C.acutatum在各種寄主植物中被廣泛報(bào)道，能侵染包括草本和木本農(nóng)作物、觀賞植物、水果以及松柏類植物在內(nèi)的多種植物，并與C.gloeosporioides一起，被認(rèn)為是世界內(nèi)廣泛存在的病原菌[16-20]。但一直以來未見有C.acutatum侵染茶樹的報(bào)道，直到2015年在重慶采集的感病茶樹葉片中分離到了該種炭疽菌[11]。C.gloeosporioides是茶樹上一種常見炭疽菌種，在中國[7]、印度[6]等國茶樹上均有相關(guān)報(bào)道，能侵染茶樹導(dǎo)致茶樹葉片出現(xiàn)壞死癥狀，嚴(yán)重時(shí)葉片萎焉脫落，影響茶樹的產(chǎn)量及茶葉品質(zhì)。為有效地了解此病害的發(fā)生規(guī)律，本研究對(duì)此2種炭疽菌的生物學(xué)特性進(jìn)行了進(jìn)一步分析，結(jié)果表明C.gloeosporioides和C.acutatum該2種炭疽菌均最適宜在PDA和PSA培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，而生長(zhǎng)的適宜溫度均在25～28 ℃之間，高溫和低溫均不利于菌落生長(zhǎng)，但菌在40 ℃時(shí)仍能進(jìn)行生長(zhǎng)，菌絲致死溫度則在60～65 ℃之間，這可能與重慶地區(qū)茶云紋葉枯病發(fā)病高峰期夏秋季的氣溫偏高有關(guān)，了解病原菌的生物學(xué)特性對(duì)探討病害的發(fā)生規(guī)律及原因具有重要意義。

4 結(jié) 論

植物病原真菌分泌的致病外毒素是病程相關(guān)的一類重要致病因子，能使寄主植物出現(xiàn)特定病癥反應(yīng)，在植物病害的發(fā)生、發(fā)展過程中具有明顯的致病作用[21]?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的植物產(chǎn)毒真菌種類較多，研究表明炭疽菌(Colletotrichum)能夠產(chǎn)生強(qiáng)致病性毒素，且在較低濃度下可誘發(fā)植物產(chǎn)生病狀[22-27]?，F(xiàn)有關(guān)茶樹病害中毒素物質(zhì)的研究在國內(nèi)僅有少量報(bào)道，只有少數(shù)關(guān)于茶炭疽病菌(Gloeosporiumtheae-sinensisMiyake)以及茶輪斑病菌(Pestalotiopsistheae)毒素物質(zhì)的研究報(bào)道，尚未見有茶樹不同炭疽菌種C.gloeosporioides和C.acutatum的毒素活性的研究報(bào)道。本研究通過茶枝活體浸梢法初步證實(shí)了這2種炭疽菌的產(chǎn)毒活性，為后續(xù)茶樹炭疽菌的致病性差異及其致病機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)，也為炭疽菌的的有效防治開辟了新的路徑。

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