杜 娟, 張莉莉,王 晶,商 旋,常世民

(廊坊師范學院，河北 廊坊 065000)

【研究意義】鎘是常見的金屬污染物，也是環(huán)境中毒性最強的5種(汞、鉛、鎘、砷、鉻)元素之一[1]，是動植物體的非必需元素，在冶金、塑料和電子等行業(yè)應用廣泛。【前人研究進展】近年來，工生產、農業(yè)活動和直接或間接排放鎘的人為活動，是造成土壤鎘污染主要原因[2]，如工業(yè)廢氣中的鎘沉降[3]、長期施用含鎘肥料[4]和農用塑料薄膜[5]、使用工礦企業(yè)排放的污水灌溉、污泥施肥[6]以及金屬礦山酸性廢水污染[2]等。土壤中的鎘有多種存在形態(tài)，如水溶態(tài)、可交換態(tài)或碳酸鹽態(tài)，其中，前兩種鎘可被植物或農作物吸收，并通過食物鏈富集與人體內，嚴重危害人體健康[6-7]。目前，國內對鎘的毒性研究主要集中于神經組織[8-9]、腎[10]、皮膚[11]和肺[12]等領域。【本研究切入點】本實驗利用小鼠肝細胞的體外培養(yǎng)體系，研究氯化鎘對肝細胞的存活及凋亡的影響，進而推測鎘的對肝細胞生長和存活的短期影響作用?！緮M解決的關鍵問題】本實驗利用組織塊法啟動了小鼠肝細胞的體外培養(yǎng)，利用其體外培養(yǎng)體系，研究不同濃度氯化鎘處理對其存活的影響作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

BALB/C小鼠(雌雄數量比為3∶1)購自中國醫(yī)學科學院實驗動物研究所；Hoechst 33342和DNA Ladder抽提試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；胰蛋白酶和四甲基偶氮唑藍購自美國Amresco公司；DMEM/F12培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國Gibco公司；實驗所用其他試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 小鼠肝細胞的原代培養(yǎng) 參考王晶等方法啟動原代培養(yǎng)[11 ]。將懷孕15 d的雌鼠頸部脫臼處死后，70 %醫(yī)用乙酒精浸泡處理1～2min，重復1次，無菌取出胚胎，酒精處理1～2 min，磷酸鹽緩沖溶液漂洗2～3次后，用含5 % FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液()漂洗1次，無菌取出胚胎肝臟，燒杯中剪碎(約1 mm3)至，離心后去上清，組織塊或細胞沉淀用DMEM/F12培養(yǎng)液(含5 % FBS)懸浮后均勻鋪在培養(yǎng)瓶底部，翻轉倒置，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h后，補加含20 % FBS 的DMEM/F12培養(yǎng)液至5 mL/瓶，置37 ℃培養(yǎng)箱中正置培養(yǎng)。

1.2.2 小鼠肝細胞的傳代培養(yǎng) 參考王晶等方法，采用酶消化法進行傳代培養(yǎng)[11 ]。待細胞匯合率達90 %時，吸棄舊培養(yǎng)液，D-Hanks漂洗1次，0.25 %(質量體積比)胰蛋白酶溶液處理30 s～1 min，吹下細胞，用含20 % FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液重懸，接種至2個底面積為25 cm2的細胞培養(yǎng)瓶中，37 ℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。

1.2.3 小鼠肝細胞的凍存 選擇5～6瓶匯合率達80 %～ 90 %的肝細胞，按上述傳代方法制備細胞懸液，轉入離心管中，1000 r/min離心10 min后棄上層液體，加入1 mL細胞凍存液，懸浮細胞轉入無菌細胞凍存管中。4 ℃冰箱中放置30 min，-20 ℃冰箱中放置1 h，-80 ℃冰箱中過夜后轉入液氮罐中長期保存。

1.2.4 細胞接種和氯化鎘處理 按傳代方法制備細胞懸液，并接種至24孔細胞培養(yǎng)板中，細胞密度約1×105個/mL，待細胞貼瓶后，添加終濃度分別為0、5、10、20、40、80和160 μmol/mL的氯化鎘，每個濃度設置3個重復。37 ℃、5 % CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，顯微鏡觀察并拍照。

1.2.5 細胞存活率測定 采用MTT法[11]。氯化鎘處理一定時間后，棄上層培養(yǎng)液，D-Hanks漂洗后，每孔加入180 μl DMEM/F12培養(yǎng)液(含10 %FBS)和20 μl的5 mg/mL MTT溶液，37 ℃、5 % CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，棄上層液體， D-Hanks漂洗1次，每孔加入150 μl二甲基亞砜，酶標儀測定490 nm光吸收值，計算氯化鎘對肝細胞的抑制率和半致死濃度(IC50)[11]，抑制率=(1-實驗組平均光吸收值/對照組平均光吸收值)×100 %。

1.2.6 Hoechst 33342染色 將無菌蓋玻片放于培養(yǎng)皿中，制備細胞懸液并接種，細胞密度約2×103個/cm2，補加一定量含10 % FBS DMEM/F12培養(yǎng)液， 24 h后，添加氯化鎘處理一定時間，棄上層培養(yǎng)液，D-Hanks漂洗2～3次，多聚甲醛低溫固定，D-Hanks漂洗，Hoechst33342染液標記30 min，D-Hanks漂洗后，熒光顯微鏡觀察、拍照。

1.2.7 DNA瓊脂糖凝膠電泳 按上述方法制備細胞懸液并接種，靜置培養(yǎng)24 h后，氯化鎘分別處理24～96 h。參考DNA Ladder抽提試劑盒說明[11]，收集細胞，離心，棄上層液體，PBS重懸，加入RNaseA處理3～5 min，蛋白酶K 70 ℃孵育10 min后，添加樣品裂解液B，混勻并轉入DNA純化柱內，6500 r/min離心，收集管內液體，加洗滌液I，6500 r/min離心；收集管內液體，加洗滌液II，18 000 r/min離心后，收集管內液體，重復離心1次。將洗脫液加入DNA純化柱中，，室溫放置3 min，12 000 r/min離心，得純化總DNA。取適量DNA進行瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，凝膠成像系統(tǒng)觀察、拍照。

1.2.8 數據處理 實驗結果用SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計分析，組間差異性比較采用單因素ANOVA，P<0.05，表示差異顯著，P<0.01，表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 小鼠肝細胞的體外培養(yǎng)

原代啟動后第3天，有較多細胞從肝組織塊邊緣遷出，細胞貼附于培養(yǎng)瓶底部，呈扁平不規(guī)則多角形(圖1A)，生長分裂旺盛。原代培養(yǎng)啟動后第8～10天，組織塊周圍的細胞匯合成單層(圖1B)，說明培養(yǎng)條件適合肝細胞的遷出和增殖。

采用胰蛋白酶消化法傳代后第2天，絕大多數細胞能貼瓶生長，且多為不規(guī)則形，透光性較好，一周左右可再次長滿單層(圖1C)，說明胰酶消化法比較適合小鼠肝細胞的傳代培養(yǎng)。

2.2 氯化鎘對小鼠肝細胞形態(tài)的影響

光學顯微鏡觀察小鼠肝細胞的結果顯示， 5～20 μmol/L 氯化鎘處理24 h對小鼠肝細胞的形態(tài)無顯著性影響(圖2B～D)，40～160 μmol/L氯化鎘處理24 h，可不同程度引起細胞變圓或脫離培養(yǎng)瓶底部(圖2E～G)，且隨著處理濃度的增加，變圓脫落的細胞數量逐漸增加(圖2 E ～G)。5～160 μmol/L 氯化鎘處理48 h，則均可不同程度引起小鼠皮膚細胞變圓脫落，具有濃度依賴性(圖3B～G)。

A. 原代培養(yǎng)啟動第3天; B. 原代培養(yǎng)肝細胞長成單層; C. 傳代后小鼠肝細胞; D. 長滿單層的第2代小鼠肝細胞A. 3 days after primary culture; B. Primary cultured murine hepatocytes monolayer; C.Subcultured murine hepatocytes; D. Cultured murine hepatocytes monolayer at passage 2 圖1 體外培養(yǎng)的小鼠肝細胞(200×)Fig.1 Cultured murine hepatocytes in vitro

A～G：氯化鎘添加濃度分別為0、5、10、20、40、80、160 μmol/L。下同 A-G: treated group by CdCl2: 0,5,10,20,40,80,160 μmol/L. The same as below圖2 氯化鎘處理24 h的小鼠肝細胞(200×)Fig.2 Murine hepatocytes treated with CdCl2 for 24 hours

圖3 氯化鎘處理48h的小鼠肝細胞(200×) Fig.3 Murine hepatocytes treated with CdCl2 for 48 hours

2.3 氯化鎘對小鼠肝細胞存活率的影響

與空白對照組(細胞存活率為100 %)相比，5～160 μmol/L氯化鎘處理小鼠肝細胞24和48 h均可極顯著降低細胞存活率(P<0.01)，且隨著添加濃度的增加，細胞存活率逐漸降低，具有濃度依賴性(圖3)；相同添加濃度時，5～160 μmol/L氯化鎘處理48 h組的細胞存活率顯著低于24 h組。經寇氏法計算[11]，氯化鎘處理24和48 h的的半致死率濃度分別為30.3和21.0 μmol/L。

圖4 氯化鎘處理24和48 h的小鼠肝細胞存活率Fig.4 Survival rate of murine hepatocytes treated with CdCl2 for 24 and 48 hours

凋亡細胞具有染色質凝集等形態(tài)學或生理生化特征[13]，如等。Hoechst33342 是一種可穿透細胞膜的特異性DNA熒光探針，入細胞核后在聚AT序列的富集區(qū)域的小溝處與DNA結合。經紫外光激發(fā)，Hoechst-DNA呈亮藍色熒光，與對照組非凋亡細胞(圖5A)相比，氯化鎘處理組的細胞染色質固縮，趨邊化(圖5B)，呈現凋亡細胞的染色質特征。

細胞凋亡晚期，核酸內切酶被活化，將核小體間的染色質DNA特異性切割成180～200 bp或其整數倍片段，經常規(guī)瓊脂糖凝膠電泳后，呈現出梯狀條帶(DNA ladder)[11,13]。DNA電泳時鑒定細胞凋亡最為簡便可靠的方法之一。電泳結果顯示，氯化鎘處理小鼠肝細胞48 h后，DNA出現梯狀條帶；處理72和96 h后，DNA出現明顯的梯狀條帶，其中，200、400、600和800 bp左右的DNA條帶清晰可見(圖6)，說明氯化鎘處理導致了小鼠肝細胞的凋亡[11]。

A. DNA marker; B. 空白對照組; C～E. 40 μmol/L CdCl2處理24, 48,和72 hA. DNA marker; B. Control; C-F. Treated group by 40 μmol/L CdCl2 for 24, 48 and 72 hours圖6 DNA 瓊脂糖電泳Fig.6 DNA agarose gel electrophoresis

3 討 論

本實驗建立的培養(yǎng)體系適合于小鼠肝細胞的體外存活和生長，所培養(yǎng)的細胞貼壁生長，呈不規(guī)則多角形，細胞透光性較好，細胞增殖速度較快；一定濃度氯化鎘短期處理即可導致細胞出現皺縮變圓，染色質凝縮和DNA片段化等特征，引起細胞凋亡。這與Jicang Wang等的研究結果一致[14]。研究表明，鎘誘導的細胞凋亡通路主要有：①未折疊蛋白質應答反應(UPR)途徑[15-16]；②線粒體介導的，caspase 依賴性[17]和非caspase依賴性途徑[18]；③活性氧和Ca+[14]途徑；④細胞自噬途徑等[19-20]。而氯化鎘通過上面哪種或者哪幾種信號轉導通路誘導體外培養(yǎng)的小鼠肝細胞的凋亡還有待進一步研究。

綜上，由于鎘(Cd)是一種生物體非必須的元素，通過肺臟呼吸和消化道吸收最終積累于人體肝臟和肝臟中長達15～20年，并對組織或細胞產生持續(xù)的毒性作用[21]。因此，積極開展切實有效的管控措施，嚴格限制土壤中重金屬鎘的輸入，保護未被污染的土地資源，修復已經被鎘等重金屬污染的土地，提高農產品質量安全，才能保護人體健康[2]。

A. 對照組; B. 40 μmol/L的氯化鎘處理48 h; “↙”示正常細胞核;“*”示致密濃染的凋亡細胞細胞核A. Control; B. Treated group by 40μmol/L CdCl2 for 48 hours;↙’ control; ‘*’ apoptotic cell nucleus 圖5 Hoechst33342染色后小鼠肝細胞細胞核(400×)Fig.5 Murine hepatocytes’ nucleus stained by Hoechst33342

4 結 論

本文利用組織塊法啟動了小鼠肝細胞的體外培養(yǎng)，利用其體外培養(yǎng)體系，研究不同濃度氯化鎘處理對其存活的影響作用。所建立的培養(yǎng)體系適合于小鼠肝細胞的體外存活和生長，同時證明了一定濃度氯化鎘短期處理即可導致細胞出現皺縮變圓，染色質凝縮和DNA片段化等特征，引起細胞凋亡。

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