白亭亭，楊佩文，李向東，楊子林，林興華，畢云青，裴衛(wèi)華，楊群輝，彭榮珍，楊明英 *

(1.云南省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)環(huán)境資源研究所，云南 昆明 650205；2. 臨滄市植保植檢站，云南 臨滄 677000)

【研究意義】掌握有效控制十字花科根腫病的防控措施，對保障中國油料和蔬菜產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要的意義。十字花科根腫病是由蕓薹根腫菌(PlasmodiophorabrassicaeWoron)侵染引起的一種重要的土傳病害，分布廣泛，危害嚴重，可侵染大白菜、小白菜、油菜、甘藍、蘿卜等100多種十字花科植物[1-5]。根腫病病原菌侵染后會導致寄主植物根部細胞異常增殖，形成膨大的腫瘤，影響水分和營養(yǎng)物質(zhì)的運輸，造成植株地上部分營養(yǎng)不良和萎蔫，植物表現(xiàn)不同程度的萎黃；若幼苗感染病菌，則嚴重危害生長發(fā)育，甚至未成熟而死亡[6-8]，該病在生產(chǎn)上可導致寄主植物產(chǎn)量嚴重下降，甚至絕收，連茬種植情況越來越突出，極大地制約了油料和蔬菜產(chǎn)業(yè)的持續(xù)穩(wěn)定發(fā)展，因此，尋找安全高效的防治措施迫在眉睫?！厩叭搜芯窟M展】 目前，防控十字花科根腫病的方法主要有抗病品種、輪作、無病土育苗移栽、土壤調(diào)理和關(guān)鍵化學防控等措施?；瘜W農(nóng)藥在推薦劑量下相對安全，幼苗期施用對作物和人類更是影響甚小，尤其是一些新型低毒高效殺菌劑對環(huán)境也較安全，而且防治效果穩(wěn)定，增產(chǎn)作用明顯，楊佩文等和費維新等研究了福帥得、百菌清、多菌靈等對根腫病的防治效果[9-10]。土傳病菌在土壤中居主導地位，致使土壤微生物多樣性降低、結(jié)構(gòu)和功能失調(diào)[11-12]，造成防治困難。土壤改良劑富含有益微生物和大量微量元素，具有提高土壤微生物多樣性，促進土壤微生物生態(tài)系統(tǒng)恢復的作用[13]；輪作對土壤微生物群落也具有一定影響，每種植物的根際土壤微生物群落的種類和數(shù)量均不相同[14]，因此，能夠增強土壤微生物多樣性[15]，土壤微生物多樣性豐富、有益微生物群落數(shù)量大能有效抑制病原菌防治土傳病害[16]?！颈狙芯壳腥朦c】十字花科根腫病化學農(nóng)藥防治研究雖有報道，但近年新研發(fā)的低毒高效農(nóng)藥明迪對十字花科根腫病的防治效果還未有研究；過去生物防治方面對于有益微生物防治十字花科根腫病的研究主要集中在放線菌和枯草芽孢桿菌等單一菌種[17-18]，含有復合微生物的土壤改良劑和有機硅肥對十字花科根腫病的防效研究仍屬空白。【擬解決的關(guān)鍵問題】為了尋找安全高效防控措施，控制十字花科根腫病的發(fā)生和流行，提高十字花科蔬菜和油料的產(chǎn)量品質(zhì)，本研究對4種化學農(nóng)藥、3種土壤改良劑和4種輪作方式進行田間防效試驗，通過qPCR測定土壤中十字花科根腫病病原菌含量，結(jié)合田間發(fā)病株率調(diào)查，比較其不同防控措施的抑菌作用和對該病害的防控效果。

1 材料與方法

1.1 試驗地情況

試驗田選擇在臨滄市臨翔區(qū)博尚鎮(zhèn)永泉辦事處訊房村張寶華戶責任田中進行，海拔1810 m，經(jīng)度100°2′26″，緯度23°42′4″，年平均溫度17.5 ℃，土質(zhì)砂壤土，澆灌方便。多年采用烤煙-油菜種植模式，油菜根腫病發(fā)生嚴重。

1.2 不同化學藥劑試驗

供試農(nóng)藥：明迪懸浮劑(有效成分含量：40 %氟啶胺·異菌脲)、福帥得懸浮劑(有效成分含量：40 %氟啶胺)、百菌清可濕性粉劑(有效成分含量：75 %百菌清)、多菌靈可濕性粉劑(有效成分含量：50 %多菌靈)，清水(CK)為空白對照。

試驗設計：試驗地為根腫病發(fā)生區(qū)，小區(qū)面積20 m2，共設6個化學農(nóng)藥處理和1個清水空白對照。分別為 A：40 %明迪(氟啶胺·異菌脲SC)1000倍液；B：50 %福帥得(氟啶胺SC)1500倍液；C：75 %百菌清800倍液；D：50 %多菌靈800倍液；E：福帥得+百菌清+多菌靈；F：明迪+多菌靈+明迪。每個處理設3個小區(qū)重復。除按試驗要求施用藥劑外，其它常規(guī)管理。

施藥方法：明迪、福帥得、百菌清和多菌靈藥劑，分別用單劑在油菜苗移栽后藥液噴淋根部，之后每隔10 d施用1次，共施用3次；“明迪+多菌靈+明迪”組合指在油菜苗移栽實施明迪藥液噴淋根部，10 d后施用多菌靈，再10 d后施用明迪；“福帥得+百菌清+多菌靈”組合指在油菜苗移栽后實施福帥得藥液噴淋根部，10 d后施用百菌清，再10 d后施用多菌靈。油菜收獲時采集土壤樣品測定土壤中病原菌含量并調(diào)查油菜的發(fā)病株率。

1.3 土壤改良劑

供試土壤改良劑：抗重茬菌劑(有效活菌數(shù)≥2.0億/g，有機質(zhì)>40 %)、復合微生物菌劑(含芽孢桿菌和放線菌，有效活菌數(shù)≥20億/g)和有機硅肥(SiO2≥27 %)。

施肥方法：抗重茬菌劑(30～60 kg/hm2)、復合微生物菌劑(45 kg/hm2)和有機硅肥(45 kg/hm2)在油菜移栽前取適量與常規(guī)用肥混拌均勻施于塘內(nèi)后再移栽油菜，之后每隔1月結(jié)合追肥施用1次，共施用3次。油菜收獲時采集土壤樣品測定土壤中病原菌含量，并調(diào)查油菜的發(fā)病株率。

1.4 不同作物輪作

輪作試驗設置4種作物：大蒜、大麥、蠶豆和馬鈴薯，對照地塊繼續(xù)種植油菜，每種作物輪作處理設3個重復小區(qū)，輪作1茬后采集土壤樣品并測定土壤中病原菌含量。

1.5 發(fā)病株率調(diào)查

油菜收獲時對不同處理、不同重復小區(qū)油菜進行拔根調(diào)查，記載總株數(shù)、發(fā)病株數(shù)，計算發(fā)病株率。

根腫病發(fā)病株率( %)=(發(fā)病株數(shù)/調(diào)查總株數(shù))× 100

1.6 土壤樣本采集

在油菜收獲時，每個處理的不同小區(qū)采用對角線5點采樣法，采集5份油菜根圍10～30 cm深的土壤樣品，5份土壤樣品混勻為一份土壤樣品裝入密封袋。

1.7 土壤總DNA抽提方法及實時熒光定量PCR

土壤樣品采用MoBio Power Soil DNA Isolation Kit(Catalog No.12888-50)抽提總DNA，然后進行實時熒光定量PCR分析土壤中十字花科根腫病病原菌含量，實時熒光定量PCR采用Takara SYBR Premix ExTaqTM (Tli RHaseH Plus)試劑盒(Code No. RR820)。

引物和具體程序均參照李淼等[19]，擴增的目的片段大小為158 bp，標準曲線的建立采用含有158 bp目的片段的重組質(zhì)粒pMD18-T-158，測定抽提的質(zhì)粒DNA的濃度，根據(jù)以下公式將質(zhì)粒DNA的濃度換算成拷貝數(shù)，設置108、107、106、105、104、103copy number/μl 6個濃度梯度標準樣品制作標準曲線，標準曲線要求R2>0.99，90

公式：{基因拷貝數(shù)=(6.02×1023copies/mol×質(zhì)粒濃度g/μl)/MW g/mol，MW(雙鏈DNA的平均分子量)= 堿基數(shù)×660/堿基}。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計和分析

先使用SPSS 17.0統(tǒng)計分析軟件對不同處理土壤病原菌含量進行差異顯著性分析，差異顯著性水平為P≤0.05，再用Excel 2007進行作圖，獲得不同處理的土壤中病原菌含量和油菜發(fā)病株率圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同藥劑及組合對根腫病影響分析

檢測不同化學農(nóng)藥及組合處理后土壤中十字花科根腫病菌含量，結(jié)果(圖1)顯示，施用3次明迪的土壤中病原菌含量最低，為1.7×107copy number/g，與對照、福帥得、百菌清及“福帥得+百菌清+多菌靈”處理的土壤中病原菌含量之間差異顯著；“明迪+多菌靈+明迪”處理的土壤中病原菌含量為2.6×107copy number/g，與對照土壤、百菌清處理的土壤中病原菌含量之間差異顯著；“福帥得+百菌清+多菌靈”處理的土壤中病原菌含量為2.8×107copy number/g，與對照土壤、百菌清處理的土壤中病原菌含量之間差異顯著；而百菌清、多菌靈和福帥得處理的土壤中病原菌含量較高，與對照之間無顯著差異。表明明迪對十字花科根腫病菌具有最好的滅殺效果。

收獲期調(diào)查不同化學農(nóng)藥處理的油菜發(fā)病株率，結(jié)果(圖1)表明，明迪和福帥得處理的油菜根腫病發(fā)病株率較低，分別為73.33 %和77.42 %，遠低于對照；多菌靈和百菌清處理的油菜根腫病發(fā)病株率較高，分別為90.62 %和96.77 %，略低于對照；“明迪+多菌靈+明迪”處理的油菜發(fā)病株率為80%，“福帥得+百菌清+多菌靈”組合處理的油菜發(fā)病株率最低為63.33 %。表明“福帥得+百菌清+多菌靈”處理對十字花科根腫病具有最好的防控效果，其次為明迪和福帥得。

A: 明迪；B: 福帥得；C: 百菌淸；D: 多菌靈；E: 明迪+多菌靈+明迪；F: 福帥得+百菌淸+多菌靈A: Mingdi, B: Fushuaide, C: Baijunqing, D: Duojunling, E: Mingdi+Duojunling+Mingdi, F: Fushuaide+Baijunqing+Duojunling圖1 不同藥劑及組合對根腫病防控效果Fig.1 Control effect of different fungicides and combinations on clubroot of crucifers

2.2 土壤改良劑對根腫病影響分析

土壤改良劑能改善土壤性質(zhì)，提高有機質(zhì)含量，對土壤微生物產(chǎn)生積極的影響。本研究測定抗重茬菌劑、復合微生物菌劑和有機硅肥對病田土壤中根腫病的影響，結(jié)果顯示，施用3種土壤改良劑后油菜發(fā)病株率均有所降低，其中抗重茬菌劑處理的油菜發(fā)病株率最低，為80.64 %；其次復合微生物菌劑處理的油菜發(fā)病株率為83.87 %，有機硅肥處理油菜的發(fā)病株率為90 %。土壤中病原菌含量測定結(jié)果顯示，3種處理土壤中病原菌含量比對照均顯著降低，但處理之間無顯著差異，說明3種土壤改良劑在防控十字花科根腫病方面均具有顯著效果(圖2)。

2.3 輪作對土壤中根腫病病菌含量影響分析

輪作能減少土傳病菌在土壤中的數(shù)量，減輕危害。文章研究了輪作大蒜、大麥、蠶豆和馬鈴薯4種作物對土壤中十字花科根腫病菌的影響。結(jié)果顯示，輪作大蒜1茬后，土壤中病原菌含量明顯降低，為2.2×107copy number/g，與對照、輪作大麥、蠶豆、馬鈴薯的土壤中病原菌含量有顯著差異；而輪作大麥、蠶豆和馬鈴薯的土壤中病原菌含量與對照均無顯著性差異，表明輪作大蒜對十字花科根腫病具有較好的控病效果(圖3)。

2.4 不同防控措施對土壤中根腫病菌含量影響差異

通過檢測，對照土壤中病原菌含量高達4.36 ×107copy number/g，文章分別使用不同化學農(nóng)藥、土壤改良劑和輪作等農(nóng)業(yè)措施防治根腫病。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雖然這些防控措施能降低土壤中根腫病病原菌含量，但土壤中病原菌含量仍在107copy number/g 以上，主要原因是不同防控措施是在油菜移栽期和采用塘施方法，處理的土壤范圍偏窄，加之病害調(diào)查和土壤取樣在油菜收獲期進行，因此土壤中病菌有一定的擴散，造成整體根腫病菌含量偏高。表明十字花科根腫病防治難度較大，單一的防控措施或土壤局部處理，不能在短時間內(nèi)快速地減少土壤中的根腫病病原菌(表1)。

A: 抗重茬菌劑；B: 復合菌劑；C: 有機硅肥A: Anti-continuous cropping agent, B: Complex microbial community, C: Organic silicon fertilizer圖2 不同土壤改良劑對根腫病菌抑制效果Fig.2 Suppression effects of different soil amendments on clubroot of crucifers

3 討 論

3.1 化學藥劑及組合控病作用

李妍等報道，1.6 ×105個休眠孢子/g 滅菌土是根腫病接種的發(fā)病閾值，應采取相應的防控措施減少土壤中孢子濃度[20]，本研究測定的土壤中病原菌含量均在107copy number/g 以上，表明屬于根腫病重病田。

圖3 輪作不同作物對病田中根腫病菌含量的影響Fig.3 Effect of different crop rotation on pathogen content of clubroot disease in soil

楊佩文等研究發(fā)現(xiàn)福帥得懸浮劑處理苗床及大田，能有效殺滅土壤中殘存的病菌，控制根腫病的發(fā)生[9]，陳坤榮等報道15 % 氟啶胺的包衣懸浮劑處理油菜種子防治根腫病[21]。因此，文章選用低毒高效農(nóng)藥明迪、福帥得、百菌清和多菌靈，比較不同化學農(nóng)藥及組合對根腫病的防控效果。明迪處理的油菜田土壤中十字花科根腫病病原菌含量最低，且油菜的發(fā)病株率也較低，表明明迪對該病原菌的滅殺效果較好。福帥得比明迪處理的土壤病原菌含量顯著的高，與對照無顯著差異，明迪有效成分為氟啶胺和異菌脲復配制劑，福帥得的有效成分為氟啶胺，兩種化學農(nóng)藥主成分相同，但含量和輔助成分不同，處理后土壤中病原菌含量有一定差異，表明含有兩種有效成分的農(nóng)藥混劑較單一有效成分的農(nóng)藥控病效果好。

百菌清、多菌靈對根腫病的防控效果比明迪、福帥得稍差，處理的土壤中病原菌含量與空白對照無顯著性差異，且油菜發(fā)病株率較高，這與楊佩文等研究結(jié)果一致[9]，但與費維新等的報道略有不同[10]，可能與施藥處理方式和選擇的試驗田土壤中病原菌含量不均勻有關(guān)?！懊鞯?多菌靈+明迪”和“福帥得+百菌清+多菌靈”兩個組合對根腫病有一定防效，幾種藥劑組合施用既可控病，還可以降低病原菌產(chǎn)生抗藥性的機率，延長藥劑的使用壽命。

3.2 土壤調(diào)理劑和輪作控病作用

土壤改良劑能夠調(diào)控土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，增強土壤微生物及生態(tài)系統(tǒng)的平衡，抑制土傳病原菌蔓延和危害的效果。研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)抗重茬菌劑、復合微生物菌劑和有機硅肥3種土壤改良劑處理的土壤病原菌含量與對照相比顯著降低，油菜根腫病發(fā)病株率均比對照低，表明這3種土壤改良劑對控制根腫病具有一定的效果。輪作試驗顯示在所選的4種作物中，輪作大蒜能有效降低土壤根腫病菌的含量，其他3種作物輪作一季，對抑制根腫病菌不明顯，可能需要輪作2～3年效果才會明顯。

表1 qPCR測定不同處理下土壤中病原菌含量

十字花科根腫病的發(fā)生危害程度與土壤中病原菌的含量直接相關(guān)，研究發(fā)現(xiàn)化學農(nóng)藥、土壤改良劑和輪作等措施均能減少土壤中病原菌含量，單一的防控措施對根腫病有一定控制作用，但油菜發(fā)病株率仍較高，達不到防控目標，必須采取綜合、持續(xù)有效的防控措施，才能達到控制根腫病發(fā)生危害的目的。

隨著社會的發(fā)展，人們越來越認識到使用化學農(nóng)藥對生態(tài)環(huán)境和人類健康的危害，迫切需要應用抗病品種、生物和生態(tài)防控等優(yōu)化的綜合治理措施和策略。通過研究初步提出：對于重病田，可輪作2茬大蒜，有條件地方進行水旱輪作，待土壤中病原菌侵染力減弱、數(shù)量減少后，恢復種植十字花科作物；移苗前15 d用明迪處理土壤中殘存的病原菌，移苗后連續(xù)施用土壤改良劑抑制土壤中病原菌侵染；對于輕病田，可直接在移苗前用明迪處理或連續(xù)施用土壤改良劑抑制土壤中病原菌。

4 結(jié) 論

采用實時熒光定量PCR檢測技術(shù)測定土壤中根腫病菌含量的方法可行，檢測結(jié)果可監(jiān)測土壤中根腫病菌的殘存量和分布特點，為預警監(jiān)測提供理論依據(jù)。結(jié)果顯示，明迪、福帥得、微生物菌劑及輪作大蒜控病效果較好。在生產(chǎn)中根據(jù)病害發(fā)生程度，建議采取“輪作+土壤調(diào)理+清理病根+化學藥劑防控”綜合防控措施，對減少化學農(nóng)藥的使用量，控制根腫病發(fā)生蔓延，具有較好的推廣前景。

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