高進(jìn)勇，余洪濤，徐永杰，馬超鋒，何書海，葉叢華

(1.信陽學(xué)院 理工學(xué)院，河南 信陽 464000； 2.淮濱縣畜產(chǎn)品檢驗檢測中心，河南 淮濱 464400； 3.信陽師范學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，河南 信陽 464000； 4.信陽市動物疫病預(yù)防控制中心，河南 信陽 464000；5.信陽農(nóng)林學(xué)院 牧醫(yī)工程學(xué)院，河南 信陽 464000； 6.固始縣動物疫病預(yù)防控制中心，河南 固始 465200)

禽白血病(Avian leukosis，AL)是由禽C型反轉(zhuǎn)錄病毒群病毒引起的禽類多種腫瘤性疾病的統(tǒng)稱，是致雞腫瘤的主要疾病，以淋巴白血病最為常見，其次是成紅細(xì)胞性白血病、成髓細(xì)胞性白血病等，對養(yǎng)雞業(yè)危害巨大[1-3]。根據(jù)病毒囊膜糖蛋白抗原差異，禽白血病病毒(ALV)被分為A、B、C、D、E、和J等亞群。自然條件下，由ALV導(dǎo)致的腫瘤病例主要是由A、B亞群引起的；C、D亞群引起的腫瘤鮮有報道；E亞群屬于內(nèi)源性禽白血病病毒，沒有致瘤性和致病性；J亞群于1989年在商品肉雞中發(fā)現(xiàn)，與雞的髓細(xì)胞性白血病有關(guān)，現(xiàn)在是最常分離到的禽白血病病毒亞群。禽白血病可以引起患病雞生長受阻、免疫抑制，或與其他疾病混合感染而導(dǎo)致大批禽只死亡或淘汰[4-9]。目前，禽白血病造成機(jī)體免疫抑制或免疫耐受的分子機(jī)制仍未明確，也無有效的疫苗可以使用。鑒于禽白血病對雞群的危害，《國家中長期動物疫病防治規(guī)劃(2012—2020年)》提出要求，國內(nèi)所有種雞場在2020年底前完成禽白血病的凈化工作。由于禽白血病既可垂直傳播又可水平傳播，凈化和防控難度較大。信陽地區(qū)以丘陵為主，近年來林地經(jīng)濟(jì)發(fā)展迅速，林下土雞養(yǎng)殖蓬勃發(fā)展，部分雞場有禽白血病發(fā)生，并混合感染其他病毒性或細(xì)菌性疾病，造成雞只死亡，給土雞養(yǎng)殖戶帶來較大的經(jīng)濟(jì)損失。為了解信陽地區(qū)土雞群禽白血病A-B亞群帶毒情況，采用美國IDEXX公司生產(chǎn)的禽白血病病毒抗體檢測試劑盒(ALV-Ab)對土雞群進(jìn)行檢測調(diào)查，以期為信陽地區(qū)禽白血病的凈化防控提供參考。

1 材料和方法

1.1 血清樣品采集及處理

2016年3月—2017年7月，對信陽地區(qū)77個不同規(guī)模肉蛋兼用型土雞場的雞只采血，每只雞通過翅靜脈無菌采集全血不少于2 mL，共采集不同日齡血樣1 351份，冷藏條件下送達(dá)實驗室。血樣3 500 r/min離心3 min，取上清液于2.0 mL滅菌離心管中，統(tǒng)一登記編號。處理好的血清均置于-20 ℃冰箱保存，備用待檢。

1.2 主要試劑及儀器

禽白血病病毒抗體檢測試劑盒(ALV-Ab)購自美國IDEXX公司。Eppendorf 10～1 000 μL單道移液器及25～300 μL多道移液器，購自德國Eppendorf公司；ELX-800全自動定量繪圖酶標(biāo)儀購自美國Thermo公司；LC-800低速離心機(jī)購自科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司；303系列電熱恒溫培養(yǎng)箱購自上海樹立儀器儀表有限公司。

1.3 抗體檢測方法

血清學(xué)檢測在信陽市動物疫病預(yù)防控制中心實驗室進(jìn)行，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)方法操作，按照試劑盒說明書進(jìn)行。具體步驟如下。

取出抗原包被板并在記錄表上標(biāo)記好被檢樣品的位置；取100 μL未稀釋的陰性對照加入A1孔和A2孔中，取100 μL未稀釋的陽性對照加入A3孔和A4孔中，取100 μL稀釋的被檢樣品液加入相應(yīng)的孔中，所有被檢樣品都進(jìn)行雙孔測定，室溫(18～25 ℃)下孵育30 min；吸取各孔的液體棄入廢液筒，每孔加約350 μL去離子水進(jìn)行洗板，洗3～5次；每孔加100 μL的酶標(biāo)羊抗雞抗體(HRPO)，室溫下孵育30 min；吸取各孔的液體棄入廢液筒，每孔加約350 μL去離子水進(jìn)行洗板，洗3～5次；每孔加100 μL的TMB底物液，室溫下孵育15 min；每孔加入100 μL終止液；測定并記錄各孔于650 nm波長的吸光值A(chǔ)650。

結(jié)果判定：檢測樣品中是否含有禽白血病病毒的抗體，主要由該樣品的測定值A(chǔ)650與陽性對照值的比值決定(S/P)。如果S/P值小于或等于0.40，樣品應(yīng)判定為抗體陰性；如果S/P值大于0.40，應(yīng)判定為抗體陽性。

1.4 數(shù)據(jù)處理

檢測結(jié)果采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行分析，不同縣區(qū)抗體陽性率和個體陽性率、不同月份抗體陽性率及不同場點類型抗體陽性率，進(jìn)行χ2檢驗分析差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同縣區(qū)土雞群A-B亞群禽白血病雞場陽性率和個體陽性率

土雞禽白血病A-B亞群血清學(xué)調(diào)查覆蓋信陽地區(qū)77個土雞場，調(diào)查結(jié)果顯示，26個雞場陽性，陽性率為33.8%；淮濱縣、潢川縣、商城縣的雞場陽性率均在50%以上，商城縣最高，為75.0%，息縣未發(fā)現(xiàn)陽性雞場(表1)；對不同縣區(qū)雞場陽性率進(jìn)行卡方檢驗，χ2=83.30>20.09,P<0.01，df=8，各縣區(qū)間雞場陽性率差異極顯著。 共調(diào)查檢測樣品1 351份，陽性75份，陽性率5.6%；商城縣陽性率最高，為20.9%，其次是光山縣，為12.5%，息縣未檢出陽性樣品；對不同縣區(qū)檢測樣品陽性率進(jìn)行卡方檢驗，χ2=10.22<15.507，P>0.05，df=9，差異不顯著。

表1 樣品來源及禽白血病A-B亞群抗體檢測情況

2.2 不同月份土雞群A-B亞群禽白血病雞場陽性率和個體陽性率

從表2可以看出，除8月、11月、12月未檢測外，全年有8個月檢出陽性樣品，其中1月雞場陽性率最高，為66.7%， 10月未檢出陽性樣品。對不同月份雞場陽性率進(jìn)行卡方檢驗，χ2=12.48<15.507，P>0.05，df=8，各個月份雞場陽性率差異不顯著。4月個體陽性率最高，為33.3%， 10月個體陽性率為0，對不同月份檢測樣品陽性率進(jìn)行卡方檢驗，χ2=124.45>20.09，P<0.01，df=8，各個月份個體陽性率差異極顯著。

表2 不同月份土雞群禽白血病A-B亞群抗體檢測情況

2.3 不同規(guī)模場點土雞群A-B亞群禽白血病雞場陽性率和個體陽性率

由表3可知，土雞群禽白血病A-B亞群抗體調(diào)查分規(guī)模場和散養(yǎng)戶，從雞場陽性率看，規(guī)模雞場陽性率為38.5%，高于散養(yǎng)戶(28.9%)；從個體陽性率看，規(guī)模場的個體陽性率為5.5%，與散養(yǎng)戶個體陽性率(5.6%)相近。對不同規(guī)模場點雞場陽性率進(jìn)行卡方檢驗，χ2=0.78<3.842，P>0.05，df=1，規(guī)模場和散養(yǎng)戶差異不顯著；對不同規(guī)模場點總樣品陽性率進(jìn)行卡方檢驗，χ2=0.02<3.842，P>0.05，df=1，差異不顯著。

表3 不同場點類型土雞群禽白血病A-B亞群抗體檢測情況

3 結(jié)論與討論

3.1 信陽地區(qū)土雞A-B亞群禽白血病整體感染狀況

禽白血病是目前國內(nèi)家禽需凈化的4種重要疫病之一，采用ELISA方法檢測禽白血病抗體，進(jìn)而淘汰陽性病例，是目前國內(nèi)雞群凈化禽白血病的重要手段。本次調(diào)查覆蓋信陽市所有縣區(qū)77個雞場，能夠較全面代表信陽地區(qū)禽白血病A-B亞群帶毒情況，發(fā)現(xiàn)陽性雞場26個，雞場陽性率為33.8%。國內(nèi)其他地區(qū)禽白血病A-B亞群檢測調(diào)查情況顯示，河南部分地區(qū)雞場陽性率為100%[10]，廣東省5個黃羽肉雞場陽性率為100%[11]，貴陽地區(qū)陽性率為55.5%[12]，這些地區(qū)陽性率均高于信陽地區(qū)；湖北、黑龍江、山東、遼寧、吉林、廣東、寧夏、安徽等8個省區(qū)的平均陽性率為12.8%[13]，遠(yuǎn)低于本次調(diào)查結(jié)果。個體陽性率方面，貴陽地區(qū)為25.8%[12]，河南部分地區(qū)為17.4%[10]，均高于信陽地區(qū)，但廣東省5個黃羽肉雞場陽性率較低，為0.31%[13]。可見，不同地區(qū)禽白血病流行廣泛，信陽地區(qū)比較嚴(yán)重。

3.2 信陽地區(qū)土雞A-B亞群禽白血病感染率季節(jié)性變化情況

通過檢測發(fā)現(xiàn)，信陽地區(qū)不同月份土雞禽白血病A-B亞群感染雞場陽性率及個體陽性率有差異，10月未檢出陽性樣品， 1月、3月、4月、7月雞場陽性率較高，均在50%以上；從個體陽性率來看，4月最高，為33.3%，5月、7月較高，分別為17.6%、21.2%。

3.3 信陽地區(qū)不同規(guī)模場點土雞A-B亞群禽白血病感染情況

信陽地區(qū)不同規(guī)模場點均有A-B亞群陽性檢出，規(guī)模場陽性率為38.5%、散養(yǎng)戶為28.9%；從檢測個體看，規(guī)模場的個體陽性率為5.5%，散養(yǎng)戶個體陽性率為5.6%。

病原凈化是禽白血病防控最根本的措施，開展檢測凈化工作勢在必行。以ELISA方法為主的抗體和抗原檢測是制定凈化方案的基礎(chǔ)。禽白血病以垂直傳播為主，疫苗防治作用不大，且當(dāng)前無有效疫苗，該病主要通過減少種群感染率、根據(jù)檢測結(jié)果淘汰陽性雞、建立無白血病的種群及綜合性防控等措施進(jìn)行防控。一是嚴(yán)格控制禽白血病的源頭和流行。通過對種源的檢疫和凈化實現(xiàn)對該病的有效防控。二是加強(qiáng)雞群日常管理，減少應(yīng)激因素?？刂坪侠淼娘曫B(yǎng)密度，做好場舍和器具消毒，減少水平傳播概率。三是提供營養(yǎng)合適的日糧配方，提高雞群抵抗力。

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