張俊波，印雙紅

(1.銅仁學院 農(nóng)林工程與規(guī)劃學院，貴州 銅仁 554300； 2.銅仁學院 大健康學院，貴州 銅仁 554300)

山羊傳染性胸膜肺炎是以纖維素性胸膜肺炎為主要特征的山羊的一種呼吸道傳染病，感染羊群無年齡和性別差異，發(fā)病率和死亡率都很高，被世界動物衛(wèi)生組織(OIE) 列入通報疫病名錄，我國將其列為二類傳染病[1-4]，該病以高熱、卡他性鼻液、纖維素性胸膜炎等癥狀為主要臨床特點。山羊傳染性胸膜肺炎在我國流行已久，1947年流行于甘肅，隨后，內(nèi)蒙古、四川、山東等地都有臨床病例報道[5]。萬一元等[6]于貴州羅甸等地分離到絲狀支原體山羊亞種(Mycoplasmamycoidessubsp.capri，Mmc)，張雙翔等[7]首次分離到綿羊肺炎支原體。銅仁沿河縣為貴州白山羊的原產(chǎn)地和主產(chǎn)區(qū)，山羊傳染性胸膜肺炎發(fā)生頻繁，2歲內(nèi)山羊最易感染，發(fā)病率為37.7%，病死率為36.4%[8]。山羊傳染性胸膜肺炎已成為嚴重危害貴州省養(yǎng)羊業(yè)健康發(fā)展的主要傳染病。

細胞核轉(zhuǎn)錄因子κB(NF-κB)存在于幾乎所有類型細胞的胞質(zhì)，一般以同源或異源二聚體p50/p65非活性形式存在，p65可提高調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄活性[9]。p50/p65二聚體在靜態(tài)細胞與血漿中的I-κBα、I-κBβ和I-κBγ等NF-κB抑制家族蛋白結(jié)合，抑制NF-κB與靶DNA調(diào)節(jié)區(qū)的結(jié)合。前炎性因子TNF-α、IL-1β及脂多糖等在炎癥反應(yīng)中可誘導(dǎo)細胞NF-κB活化。NF-κB-IκBs復(fù)合物中突起的IκBs氨基末端第32、36位絲氨酸殘基，易被IκBs蛋白激酶磷酸化，然后被蛋白酶降解，使NF-κB從復(fù)合物中解離出并轉(zhuǎn)位于細胞核，與靶基因結(jié)合共同調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄。NF-κB是一種具有轉(zhuǎn)錄激活功能的蛋白質(zhì)，可在炎癥部位高度表達[10]，在調(diào)控炎癥反應(yīng)的基因表達方面NF-κB起關(guān)鍵性作用，是啟動中性粒細胞炎癥的關(guān)鍵因子[11]，調(diào)節(jié)NF-κB的活性將影響炎癥細胞因子的表達。

NF-κB存在于各種細胞中，是具有多項轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用的轉(zhuǎn)錄因子。NF-κB不但參與介導(dǎo)免疫應(yīng)答、炎癥反應(yīng)、細胞凋亡等多種基因的表達調(diào)控，而且與很多炎性疾病的發(fā)病機制關(guān)系密切。研究表明，受NF-κB調(diào)節(jié)的基因有200多種，其激活因子不少于150種[12]。近年來，通過利用siRNA技術(shù)干擾沉默NF-κB相應(yīng)基因改變其對靶基因的調(diào)控以及對其炎性調(diào)控機制進行探索，使得一些疾病有望得以治療[13]。盡管NF-κB與炎性反應(yīng)關(guān)系密切，可提高多種炎性介質(zhì)(TNF-α、IL-1β、IL-8以及黏附因子)轉(zhuǎn)錄，且可被TNF-α、IL-1β所激活，但利用NF-κB的干擾沉默來控制和治療肺炎的研究較少。目前，NF-κBp65在Mmc感染山羊肺泡上皮細胞中的具體作用機制仍不清晰。為此，探討了NF-κB抑制劑BAY11-7082對Mmc介導(dǎo)的山羊肺泡上皮細胞中凋亡因子和炎癥因子的影響，研究抑制劑BAY11-7082在Mmc感染山羊肺泡上皮細胞中發(fā)揮的作用，旨在為抗山羊傳染性胸膜肺炎新型藥物和疫苗的研發(fā)提供科學依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 支原體與細胞

Mmc、山羊肺泡上皮細胞為銅仁學院梵凈山特色動植物資源重點實驗室保存。

1.2 主要試劑

胎牛血清和DMEM細胞培養(yǎng)液購自GIBCO公司；酵母提取物、蛋白胨購自上海生工生物技術(shù)有限公司；Triton X-100細胞裂解液購自北京索萊寶科技有限公司；Caspase-3活性檢測試劑盒、NO檢測試劑盒、H2O2檢測試劑盒和BAY11-7082抑制劑購自碧云天公司；SYBR Green Ⅰ熒光染料購自羅氏公司。

1.3 細胞處理

(1)NF-κBp65 mRNA檢測組：將細胞傳代于六孔板中培養(yǎng)，當單層細胞生長至80%覆蓋度時，更換無雙抗的細胞培養(yǎng)液，Mmc與細胞比例按10∶1感染細胞，在5%CO2、37 ℃環(huán)境中孵育。于4 h、8 h、12 h和24 h收集細胞；(2)TNF-αmRNA、IL-8 mRNA、Caspase-3活性、H2O2濃度及NO濃度檢測組：將細胞傳代于六孔板中培養(yǎng)，當單層細胞生長至80%覆蓋度時，更換無雙抗的細胞培養(yǎng)液，不同濃度的抑制劑BAY11-7082與細胞提前孵育1 h后，將Mmc與細胞按10∶1感染細胞，在5%CO2、37 ℃環(huán)境中孵育，于24 h收集細胞；(3)Mmc致病力檢測組：將細胞傳代于六孔板中培養(yǎng)，當單層細胞生長至80%覆蓋度時，更換無雙抗的細胞培養(yǎng)液，不同濃度的抑制劑BAY11-7082與細胞提前孵育1 h后，將Mmc與細胞按10∶1感染細胞，在5%CO2、37 ℃環(huán)境中孵育40 min，PBS漂洗后將50 μg/mL慶大霉素與感染細胞共同孵育60 min，PBS漂洗后在含有25 μg/mL的慶大霉素的培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，于24 h收集細胞。不同的細胞處理組分別用以下字母表示，A：PBS對照組，B：支原體感染組，C：Mmc+抑制劑BAY11-7082(1 μmol/L)組，D：Mmc+抑制劑BAY11-7082(5 μmol/L)組，E：Mmc+抑制劑BAY11-7082(10 μmol/L)組。

1.4 實時定量PCR檢測NF-κBp65、TNF-α、IL-8 mRNA

NF-κBp65 mRNA實時定量PCR檢測細胞樣品包括4 h、8 h、12 h和24 h Mmc感染組細胞及PBS對照組細胞。

TNF-α、IL-8 mRNA實時定量PCR檢測細胞樣品包括24 h Mmc感染組細胞、Mmc-抑制劑BAY11-7082 1 μmol/L組細胞、Mmc-抑制劑BAY11-7082 5 μmol/L組細胞、Mmc-抑制劑BAY11-7082 10 μmol/L組細胞及PBS對照組細胞。

從NCBI網(wǎng)站GenBank查找NF-κBp65、TNF-α、IL-8和β-actin公布的基因序列，采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計特異性引物(表1)，引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成。

表1 目的基因擴增引物序列

用Trizol一步法提取細胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。內(nèi)參β-actin為對照，在羅氏Light Cycler 480熒光定量PCR儀上進行相對定量PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系為2×SYBR Green Master Mix 10 μL，cDNA模板2 μL，上、下游引物各1 μL，雙蒸水6 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃變性5 min；95 ℃ 15 s，59 ℃(NF-κBp65、IL-8)或61 ℃(TNF-α、β-actin)30 s，72 ℃ 30 s，40個循環(huán)。每組細胞每個時間點分別做3個重復(fù)，樣本基因NF-κBp65、TNF-α、IL-8的表達強度用其對應(yīng)的β-actin的量進行校正，即ΔCt=Ct(NF-κBp65/TNF-α/IL-8)-Ct(β-actin)，相對表達量用2-ΔΔCt法進行分析。

1.5 H2O2濃度檢測

把H2O2檢測試劑在冰上融化，在檢測孔加入50 μL樣品或標準品。在每個孔內(nèi)加入100 μL H2O2檢測試劑。輕輕振蕩混勻，室溫放置30 min，然后立即測定A560。計算出樣品中H2O2的濃度，具體操作按照試劑盒說明書進行。

1.6 NO濃度檢測

取細胞上清液，4 ℃、12 000 r/min離心7 min，按照試劑盒說明書檢測NO濃度。

1.7 Caspase-3活性檢測

取細胞上清液，4 ℃、12 000 r/min離心8 min，按照試劑盒說明書檢測Caspase-3活性。

1.8 Mmc對細胞的致病力檢測

用Triton X-100裂解細胞10 min，釋放出細胞內(nèi)Mmc，梯度稀釋后涂布固體平板進行計數(shù)。

1.9 數(shù)據(jù)處理與分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件進行分析，用平均數(shù)±標準差描述，多組樣本間平均數(shù)進行方差分析，2組間比較采用兩樣本平均數(shù)的t檢驗或q檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 Mmc對NF-κBp65 mRNA表達的影響

Mmc感染肺泡上皮細胞后，PBS作用組細胞作為對照組，于4 h、8 h、12 h和24 h收集細胞，提取細胞的總RNA，用實時定量PCR檢測NF-κBp65mRNA水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，4 h時Mmc感染組細胞與PBS對照組相比NF-κBp65 mRNA表達水平無明顯變化，而在8 h、12 h和24 h時，Mmc可以顯著提高NF-κBp65 mRNA表達水平(P<0.01)(圖1)。結(jié)果表明，Mmc感染可以提高NF-kBp65 mRNA表達水平。

**表示與對照組相比差異極顯著(P<0.01)

2.2 BAY11-7082對Mmc介導(dǎo)的IL-8 mRNA水平的影響

將不同濃度的抑制劑BAY11-7082與細胞提前孵育1 h，然后，用Mmc感染細胞，將Mmc感染組細胞和PBS作用組細胞作為對照組，于24 h收集細胞，利用實時定量PCR檢測胞內(nèi)IL-8 mRNA的相對表達量。結(jié)果顯示，Mmc可顯著提高IL-8 mRNA表達水平(P<0.01)，而抑制劑BAY11-7082在抑制5 μmol/L和10 μmol/L濃度條件下可顯著降低Mmc介導(dǎo)的IL-8 mRNA表達量(P<0.05)(圖2)。結(jié)果表明，BAY11-7082可以抑制Mmc介導(dǎo)的IL-8 mRNA表達水平。

*、**分別表示B組與其他組相比差異顯著(P<0.05)、極顯著(P<0.01)，下同

2.3 BAY11-7082對Mmc介導(dǎo)的TNF-α mRNA水平的影響

將不同濃度的抑制劑BAY11-7082與細胞提前孵育1 h，然后，用Mmc感染細胞，將Mmc感染組細胞和PBS作用組細胞作為對照組，于24 h收集細胞，利用實時定量PCR檢測胞內(nèi)TNF-αmRNA的相對表達量。結(jié)果顯示，Mmc可顯著提高TNF-αmRNA表達水平(P<0.01)，而抑制劑在5 μmol/L和10 μmol/L濃度下可以顯著降低Mmc介導(dǎo)的TNF-αmRNA相對表達量(P<0.05)(圖3)。結(jié)果表明，BAY11-7082可抑制Mmc介導(dǎo)的TNF-αmRNA表達水平。可見，NF-κB與細胞凋亡有一定的關(guān)系。

圖3 Mmc感染細胞后TNF-α mRNA表達變化

2.4 BAY11-7082對Mmc介導(dǎo)的H2O2分泌的影響

將不同濃度的抑制劑BAY11-7082(1 μmol/L、5 μmol/L和10 μmol/L)與細胞提前孵育1 h，然后，用Mmc感染細胞，將Mmc感染組細胞和PBS作用組細胞作為對照組，于24 h收集細胞，檢測Mmc對細胞內(nèi)H2O2分泌的影響。結(jié)果顯示，Mmc可顯著提高H2O2分泌水平(P<0.01)，而抑制劑BAY11-7082在5 μmol/L和10 μmol/L濃度下可以顯著降低Mmc介導(dǎo)的H2O2分泌(P<0.05)(圖4)。結(jié)果表明，抑制劑BAY11-7082可以降低Mmc引起的細胞損傷。

圖4 Mmc感染細胞后H2O2分泌變化

2.5 BAY11-7082對Mmc介導(dǎo)的NO的影響

將不同濃度的抑制劑BAY11-7082(1 μmol/L、5 μmol/L和10 μmol/L)與細胞提前孵育1 h，然后，用Mmc感染細胞，將Mmc感染組細胞和PBS作用組細胞作為對照組，于24 h收集細胞，檢測Mmc對細胞內(nèi)NO的影響。結(jié)果顯示，Mmc可顯著提高NO水平(P<0.01)，抑制劑BAY11-7082在5 μmol/L和10 μmol/L濃度下可以顯著降低Mmc介導(dǎo)的NO分泌水平(P<0.05)(圖5)。NO是一個非常關(guān)鍵的信號分子，在細胞凋亡過程中起著重要作用。結(jié)果表明，抑制劑BAY11-7082可以降低Mmc引起的細胞凋亡。

圖5 Mmc感染細胞后NO濃度變化

2.6 BAY11-7082對Mmc介導(dǎo)的Caspase-3活性的影響

將不同濃度的抑制劑BAY11-7082(1 μmol/L、5 μmol/L和10 μmol/L)與細胞提前孵育1 h，然后，用Mmc感染細胞，將Mmc感染組細胞和PBS作用組細胞作為對照組，于24 h收集細胞，檢測Caspase-3的活性。結(jié)果顯示，Mmc可顯著提高Caspase-3活性(P<0.01)，而BAY11-7082在5 μmol/L和10 μmol/L濃度下能夠顯著降低Mmc介導(dǎo)的Caspase-3的活性(P<0.05)(圖6)。結(jié)果表明，抑制劑BAY11-7082可顯著降低Mmc引起的凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3的活性。

圖6 Mmc感染細胞后Caspase-3活性變化

2.7 BAY11-7082可降低Mmc對細胞的致病力

將不同濃度的抑制劑BAY11-7082(1 μmol/L、5 μmol/L和10 μmol/L)與細胞提前孵育1 h，然后，用Mmc感染細胞，將Mmc感染組細胞和PBS作用組細胞作為對照組，于24 h收集細胞，檢測胞內(nèi)Mmc的數(shù)量。結(jié)果顯示，抑制劑BAY11-7082在5 μmol/L和10 μmol/L濃度下的細胞內(nèi)Mmc數(shù)量顯著低于未添加BAY11-7082的Mmc感染組(P<0.05)(圖7)。結(jié)果表明，抑制劑BAY11-7082可顯著降低Mmc在細胞內(nèi)的存活量。

圖7 Mmc感染細胞后存活量變化

3 結(jié)論與討論

天然免疫系統(tǒng)是機體抵抗病原微生物入侵的第一道防線。Toll樣受體(TLR)在其中發(fā)揮主導(dǎo)作用，綿羊肺炎支原體在山羊肺泡上皮細胞感染過程中，支原體激活宿主細胞Toll樣受體信號通路后，細胞會釋放大量促炎因子從而使IL-8、NF-κB等表達量均顯著上調(diào)，導(dǎo)致炎癥因子釋放進而激活機體的炎癥反應(yīng)，最終會導(dǎo)致組織損傷和疾病[14]?？赏ㄟ^抑制NF-κB活性，減少炎癥因子的表達而發(fā)揮抗炎作用[15]。

絕大多數(shù)哺乳類細胞中都有Caspases家族，在Caspase級聯(lián)反應(yīng)中居于重要位置的Caspase-3與Caspase-8是致使細胞發(fā)生凋亡的關(guān)鍵因子和所有凋亡信號傳導(dǎo)的中樞[16-17]。Caspase-8是凋亡途徑中的起始因子，可以直接激活下游效應(yīng)Caspase，Caspase-3處于凋亡級聯(lián)反應(yīng)的下游，也是細胞程序性死亡的主要效應(yīng)因子[18]。本試驗結(jié)果顯示，Mmc可顯著提高Caspase-3的活性，而BAY11-7082能夠顯著降低Caspase-3的活性，削弱Mmc對Caspase-3活性的促進作用。

H2O2是活性氧的代謝副產(chǎn)物，是很多反應(yīng)過程中的主要因子。而近年來研究發(fā)現(xiàn)，ROS會參與激活NF-κB等因子，趙進軍等[19]的研究結(jié)果表明，H2O2損傷能導(dǎo)致肝細胞核中NF-κB蛋白表達量增加。趙宏偉等[20]的研究結(jié)果表明，氧化損傷使NF-κB活化后進入細胞核，進一步激活某些凋亡路線使細胞凋亡。本試驗中，Mmc感染使NF-κBp65 mRNA表達水平顯著提高，同時可提高NF-κBp65的磷酸化水平。在抑制劑BAY11-7082作用下，可以抑制Mmc介導(dǎo)的IL-8 mRNA表達水平，降低了機體內(nèi)的炎癥因子表達量和H2O2分泌量，減輕了Mmc對細胞的損傷。

NO在不同濃度下對細胞存在促進凋亡和抑制凋亡2種功能。己有研究發(fā)現(xiàn)，支原體不僅介導(dǎo)機體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，同時也誘導(dǎo)單核細胞和巨噬細胞壞死或凋亡[21]。細胞凋亡是通過一系列生化與細胞因子變化導(dǎo)致細胞死亡的過程。NO作為一種多功能分子參與機體各種生理和病理過程。在低濃度下，可保護細胞免受凋亡，然而，NO的過度分泌則會導(dǎo)致多種細胞類型發(fā)生凋亡。此外，許多類支原體能夠通過誘導(dǎo)過量NO的表達來觸發(fā)凋亡[22-23]。而NO的表達是由低劑量抑制因子一氧化氮合酶所調(diào)控的[24]，過量的NO與超氧陰離子自由基形成過氧亞硝酸鹽，從而導(dǎo)致細胞凋亡的級聯(lián)激活[25]。綜上可知，NF-κB信號通路在Mmc致病機制中發(fā)揮重要作用。

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