黃進團 陳春宇 李森茂 陳浩 廖藝 林鋒 楊祖立

中山大學(xué)附屬第六醫(yī)院（廣東省胃腸肛門醫(yī)院）胃腸外科（廣州 510655）

胃癌是最常見的消化道惡性腫瘤之一，東亞地區(qū)尤其是我國胃癌發(fā)病率較高［1-2］。盡管以手術(shù)為主的綜合治療手段取得較大進步，但胃癌患者的總體預(yù)后仍較差。較低的早期診斷率及進展期胃癌較高的局部復(fù)發(fā)率和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率是我國胃癌患者預(yù)后較差的主要原因。因此，進一步研究胃癌發(fā)生發(fā)展的機制，尋找胃癌發(fā)生發(fā)展關(guān)鍵靶點，對提高胃癌早期診斷及開發(fā)新的治療方法具有重要意義。含Ⅰ型血小板結(jié)合蛋白基序的解聚蛋白樣金屬蛋白酶（ADAMTS）屬于Zn2+依賴的金屬蛋白酶家族，該家族包含19個成員，研究發(fā)現(xiàn)它們參與多種生物學(xué)行為，包括組織形態(tài)發(fā)生、病理生理重構(gòu)、炎癥、血管生成、惡性腫瘤等［3-4］。ADAMTS5基因位于21號染色體（21q21.3），編碼930個氨基酸［3］。據(jù)報道，ADAMTS5能抑制小鼠黑色素瘤細(xì)胞增殖，促進細(xì)胞凋亡，并具有抗血管生成作用［5］。另外，ADAMTS5在人肝細(xì)胞癌中低表達(dá)，通過下調(diào)VEGF而抑制細(xì)胞遷移［6］。然而，也有報道ADAMTS5在人惡性膠質(zhì)瘤［7］和人非小細(xì)胞肺癌［8］中高表達(dá)，促進細(xì)胞侵襲遷移。我們在前期研究中發(fā)現(xiàn)ADAMTS5在人結(jié)直腸癌組織中低表達(dá)，并能抑制腫瘤細(xì)胞遷移侵襲［9］。然而，ADAMTS5在胃癌中的表達(dá)及作用尚不明確。因此本研究采用免疫組化方法檢測ADAMTS5蛋白在胃癌及癌旁組織中的表達(dá)情況，分析ADAMTS5表達(dá)狀態(tài)與胃癌臨床病理特征及總生存期的相關(guān)性，探討其在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用，以期尋找新的潛在胃癌診斷及判斷預(yù)后的分子標(biāo)志物。

1 資料與方法

1.1 一般資料收集中山大學(xué)附屬第六醫(yī)院2007年12月至2012年3月經(jīng)手術(shù)切除且病理確診的176例胃癌患者的癌組織及24例癌旁正常組織石蠟標(biāo)本。按照2010年AJCC第七版TNM分期標(biāo)準(zhǔn)進行病理分期。術(shù)后隨訪資料來源于電話隨訪、住院、門診病歷，隨訪截止時間為2017年12月31日，隨訪時間1～123個月，中位隨訪時間52個月。本研究著重研究患者的總體生存期（overall survival，OS），OS為自手術(shù)日期至死亡或隨訪結(jié)束日期。

1.2 主要試劑兔抗人ADAMTS5多克隆抗體（英國Abcam公司），免疫組織化學(xué)試劑盒、濃縮型DAB顯色試劑盒、蘇木素染色劑（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）。

1.3 主要設(shè)備儀器奧林巴斯正置顯微鏡（日本Olympus公司），組織芯片儀（法國Alphelys公司）。

1.4 組織芯片制作組織芯片采用組織芯片儀制作，見參考文獻(xiàn)［10］。

1.5 免疫組化染色及結(jié)果判斷將制作好的組織芯片性4 μm連續(xù)切片。在55℃恒溫箱中烘烤3 h，常規(guī)脫蠟、脫水及Tris-EDTA緩沖液（pH 9.0）中行微波抗原修復(fù)，滴加ADAMTS5一抗稀釋液（1∶200）置于4℃冰箱孵育過夜；滴加二抗工作液于常溫孵育30 min，滴加DAB顯色液顯色1 min，蘇木素復(fù)染2 min，脫水、透明、干燥后中性樹脂封片。以PBS代替一抗，其余步驟與上述一致的組織切片作為陰性對照。結(jié)果判斷參照參考文獻(xiàn)［11］。每例標(biāo)本均按陽性著色強度和陽性細(xì)胞百分比進行評分。陽性著色強度分為4個等級：未著色（陰性）、淺黃色（弱陽性）、棕黃色（中等陽性）、褐色（強陽性）依次評分為0、1、2、3分；陽性細(xì)胞百分比評分分為5個等級：無陽性細(xì)胞為0分，1%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，76%以上為4分。免疫染色總分=陽性著色強度×陽性細(xì)胞百分比評分。在100倍光學(xué)顯微鏡下對每例標(biāo)本進行評分，每張芯片均行獨立、兩重復(fù)試驗，并取平均數(shù)作為每例標(biāo)本的得分。總分范圍0～12分，＜3.5分為ADAMTS5陰性，≥3.5分為ADAMTS5陽性。免疫組化評分采用雙盲法由兩位病理學(xué)專業(yè)人員獨立判定。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法使用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。計數(shù)資料以率（%）表示，比較采用χ2檢驗或Fisher精確概率法；使用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，生存率的比較采用Log-rank檢驗；單因素及多因素Cox比例風(fēng)險回歸模型用于評估預(yù)后相關(guān)因素，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。以P＜005為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胃癌及癌旁正常組織中ADAMTS5蛋白的表達(dá)如圖1所示，ADAMTS5蛋白表達(dá)主要位于胃癌細(xì)胞和胃正常黏膜上皮細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)。胃癌組織中ADAMTS5的陽性率為46.6%（82/176），癌旁正常組織中ADAMTS5的陽性率為87.5%（21/24），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=14.15，P＜0.001）。

圖1 ADAMTS5蛋白在癌旁正常組織和胃癌組織中的表達(dá)（免疫組織化學(xué)染色，×200，×400）Fig.1 Expression of ADAMTS5 in adjacent normal tissues and gastric cancer tissues（immunohistochemistry staining，× 200，× 400）

2.2 ADAMTS5蛋白在胃癌組織中的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系A(chǔ)DAMTS5在胃癌組織中的表達(dá)狀態(tài)與性別、組織學(xué)類型、腫瘤分化程度、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、TNM分期和脈管浸潤相關(guān)（表1）。ADAMTS5在男性患者中的表達(dá)高于女性患者；管狀或乳頭狀腺癌ADAMTS5表達(dá)高于印戒細(xì)胞癌；高中分化胃癌ADAMTS5表達(dá)高于低分化胃癌；無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者ADAMTS5表達(dá)高于有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者；TNMⅠ/Ⅱ胃癌ADAMTS5表達(dá)高于Ⅲ/Ⅳ期胃癌；無脈管浸潤者ADAMTS5表達(dá)高于有脈管浸潤者。上述差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。而胃癌組織中ADAMTS5的表達(dá)狀態(tài)與年齡、腫瘤大小、腫瘤位置、T分期及N分期無關(guān)（P＞0.05）。

表1 ADAMTS5在胃癌組織中的表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系Tab.1 The relationship of expression of ADAMTS5 in GC and clinicopathological characteristics

2.3 ADAMTS5蛋白在胃癌組織中的表達(dá)與胃癌患者總生存期的關(guān)系生存分析結(jié)果提示，ADAMTS5蛋白陽性患者1、3和5年總生存率分別為90.6%、78.3%和69.4%，ADAMTS5蛋白陰性患者1、3和5年總生存率分別為80.3%、54.6%和44.7%。ADAMTS5蛋白陽性患者總生存率顯著高于陰性者，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（χ2=10.36，P=0.001），見圖2。

圖2 不同ADAMTS5蛋白表達(dá)組胃癌患者總生存期比較Fig.2 Overall survival for the GC patients according to ADAMTS5 expression levels

單因素分析顯示，胃癌患者的預(yù)后與T分期（95%CI：2.409～18.258，P＜0.001）、N分期（95%CI：1.971～9.483，P＜0.001）、M 分期（95%CI：2.383～6.917，P＜0.001）、脈 管 浸 潤（95%CI：1.843～5.213，P＜0.001）和ADAMTS5的表達(dá)狀態(tài)（95%CI：0.264～0.736，P=0.002）密切相關(guān)。而Cox多因素回歸分析結(jié)果顯示，ADAMTS5表達(dá)狀態(tài)（95%CI：0.350～0.968，P=0.037）、腫瘤T分期（95%CI：1.383～11.455，P=0.01）和M分期（95%CI：1.259～3.966，P=0.006）是影響胃癌患者總生存時間的獨立因素。

3 討論

胃癌是最常見的消化道惡性腫瘤之一，我國新發(fā)胃癌病例約占全世界的一半。我國胃癌發(fā)病率高，早期診斷率低，總體治療效果仍較差，嚴(yán)重威脅我國居民健康。盡管近年來對胃癌的臨床病理特征及發(fā)生發(fā)展機制的研究取得了較大進步，以外科手術(shù)治療為主，輔助放化療及靶向治療的綜合治療手段使胃癌總體治療效果有較大提升，但進展期胃癌仍有較高的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率，晚期胃癌治療有效率低［12］，大大降低胃癌總體治療效果。隨著對調(diào)節(jié)胃癌發(fā)生發(fā)展的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的進一步認(rèn)識，目前已有上市或仍處于臨床研究的靶向藥物應(yīng)用于晚期胃癌的治療，且取得一定的治療效果［13-14］。因此，進一步研究胃癌的發(fā)生發(fā)展機制，尋找胃癌發(fā)生發(fā)展關(guān)鍵靶點，對提高胃癌治療效果具有重要意義。

ADMATS5首次于1999年發(fā)現(xiàn)，并被證實是骨關(guān)節(jié)炎病理過程中的一個關(guān)鍵酶，通過降解蛋白多糖發(fā)揮作用［15］。隨著研究的進展，越來越多證據(jù)表明ADAMTS5也在其他病理生理進程中發(fā)揮重要作用，包括腫瘤［16］。ADAMTS5在腫瘤中的表達(dá)及作用呈雙向性。如人肝細(xì)胞癌［6］及結(jié)直腸癌［9］中ADAMTS5低表達(dá)且發(fā)揮抑癌基因作用，但在人惡性膠質(zhì)瘤［7］及非小細(xì)胞肺癌［8］中ADAMTS5高表達(dá)并能促進腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移。這提示ADAMTS5在惡性腫瘤的調(diào)節(jié)中具有多樣性及復(fù)雜性。

本研究通過對176例胃癌患者術(shù)后病理標(biāo)本的免疫組化檢測結(jié)果顯示，ADAMTS5在胃癌組織中的表達(dá)顯著低于癌旁正常胃黏膜組織中的表達(dá)；而且通過對患者的臨床病理資料的分析得出，ADAMTS5在胃癌組織中的表達(dá)下調(diào)與患者性別、病理學(xué)類型、腫瘤分化程度、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、TNM分期、脈管浸潤及不良預(yù)后相關(guān)，提示ADAMTS5可能參與胃癌的發(fā)生發(fā)展，并可能作為胃癌的一個潛在治療靶點。

胃癌腫瘤細(xì)胞的高侵襲轉(zhuǎn)移性是進展期胃癌總體治療效果較差的主要原因［17］。我們發(fā)現(xiàn)ADAMTS5表達(dá)跟遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、脈管浸潤相關(guān)，有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、脈管浸潤的胃癌組織中ADAMTS5表達(dá)下調(diào)，提示ADAMTS5可能抑制胃癌的侵襲轉(zhuǎn)移。這與我們的前期研究中ADAMTS5抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移［9］及既往報道中ADAMTS5抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞遷移［6］的結(jié)果一致。然而，與之相悖的是，ADAMTS5能促進人惡性膠質(zhì)瘤［7］及人非小細(xì)胞肺癌［8］的侵襲轉(zhuǎn)移，其中具體的作用機制尚不明確。其可能的機制是，ADAMTS5可通過基質(zhì)金屬蛋白酶依賴性和非依賴性的方式參與對細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)，而這兩種作用方式的結(jié)果可能是不一致的。此兩種調(diào)節(jié)方式也見于ADAMTS家族的其他成員，如 ADAMTS15［18］。而 ADAMTS5 如何調(diào)節(jié)胃癌的侵襲轉(zhuǎn)移，以及對胃癌其他生物學(xué)行為的影響，尚需通過構(gòu)建ADAMTS5過表達(dá)及沉默表達(dá)的胃癌細(xì)胞株進行體外實驗或動物實驗進行深入研究。

綜上所述，ADAMTS5在胃癌組織中表達(dá)低于癌旁正常組織，且與原發(fā)胃癌患者性別、病理學(xué)類型、腫瘤分化程度、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、TNM分期、脈管浸潤及預(yù)后相關(guān)，提示ADAMTS5可能參與胃癌的發(fā)生發(fā)展，并可能作為胃癌診斷及治療的潛在靶點。

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