王萬(wàn)程WANG Wan-cheng 趙玲艷 - 鄧放明 -

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410128)

鹽漬辣椒汁是剁辣椒鹽漬過(guò)程中滲出的汁液，經(jīng)測(cè)定其中蛋白質(zhì)含量約為0.73 g/100 mL、總糖含量約為3.46 g/mL、氨基酸態(tài)氮含量約為0.07 g/100 mL、氯化鈉含量約為24.93 g/100 mL、可溶性無(wú)鹽固形物含量約為7.61 g/100 mL，具有獨(dú)特的辣椒制品風(fēng)味[1]。目前，大多數(shù)企業(yè)都把鹽漬辣椒汁作為污水排放，這不僅造成大量營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)流失，而且對(duì)環(huán)境造成污染。為了利用好鹽漬辣椒汁，盧星軍等[2]對(duì)鹽漬辣椒汁的成分進(jìn)行了分析，并研究了風(fēng)味辣椒汁的加工；唐鑫[1]利用鹽漬辣椒汁，制作出了一種新型腌制菜調(diào)香料；李明浩等[3]利用鹽漬辣椒汁代替普通鹽水生產(chǎn)了剁椒坯鹽水醬油；唐鑫等[4-5]將鹽漬辣椒汁作為基質(zhì)設(shè)計(jì)了植物乳桿菌培養(yǎng)基，并對(duì)其培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化。雖然有關(guān)鹽漬辣椒汁應(yīng)用有一些研究，但相對(duì)于其巨大的排放量，利用程度還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。

發(fā)酵剁辣椒因其獨(dú)特的風(fēng)味而深受消費(fèi)者的喜愛(ài)，發(fā)酵過(guò)程中乳酸菌起到了至關(guān)重要的作用，研究[6]表明乳酸菌不僅使產(chǎn)品味美爽口，同時(shí)它還具有平衡腸道菌群、提高食物消化率、降低膽固醇等功效，進(jìn)而促進(jìn)了人體健康。傳統(tǒng)發(fā)酵辣椒食品一般采用自然發(fā)酵或單一菌種發(fā)酵，存在生產(chǎn)周期長(zhǎng)、產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定、酶系不全、氨基酸態(tài)氮含量低、風(fēng)味不佳等問(wèn)題。有研究[7]發(fā)現(xiàn)利用乳酸菌發(fā)酵相比于自然發(fā)酵可顯著縮短發(fā)酵時(shí)間。有關(guān)發(fā)酵辣椒利用多菌種接種發(fā)酵的研究也有一些報(bào)道，如邵偉等[8]對(duì)多菌種混合發(fā)酵酢辣椒的工藝進(jìn)行了初探；謝麗源[9]利用多菌種的協(xié)同作用，采用固態(tài)低鹽發(fā)酵方式生產(chǎn)豆瓣辣醬；沈暢萱等[10]為提高發(fā)酵辣椒工業(yè)的生產(chǎn)效率，設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)了以枯草芽孢桿菌、乳酸乳球菌和植物乳桿菌為優(yōu)勢(shì)菌的復(fù)合菌劑；徐浩[11]將從高鹽辣椒坯中分離得到耐鹽酵母Yx.509 及耐鹽乳酸菌L1、L2制成混合發(fā)酵劑接種發(fā)酵剁辣椒，得到了質(zhì)脆味美的產(chǎn)品。

為了解決鹽漬辣椒汁批量使用的問(wèn)題，本試驗(yàn)擬將鹽漬辣椒汁作為腌制劑對(duì)新鮮紅線椒進(jìn)行濕腌，擬選取在自然發(fā)酵辣醬中產(chǎn)酸量高且生長(zhǎng)良好的植物乳桿菌、腸膜明串珠菌、嗜酸乳桿菌3種乳酸菌組合而成發(fā)酵劑[12-13]，將這種乳酸菌多菌種發(fā)酵劑接種于紅線椒與鹽漬辣椒汁混合后的剁辣椒中，選取接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間3個(gè)因素，以乳酸含量為響應(yīng)值，進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，對(duì)剁椒發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化，旨在設(shè)計(jì)出風(fēng)味優(yōu)良的產(chǎn)品，并為鹽漬辣椒汁的利用提供新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

辣椒：壇壇香4號(hào)紅線椒，湖南壇壇香食品科技有限公司；

鹽漬辣椒汁：辣椒加工企業(yè)生產(chǎn)剁辣椒過(guò)程中因鹽漬過(guò)程所產(chǎn)生的辣椒鹽坯細(xì)胞組織浸出液，湖南壇壇香食品科技有限公司；

植物乳桿菌ATCC-8014(Lactobacillusplantarum)：廣東省微生物菌種保藏中心；

腸膜明串珠菌CICC-21861(Leu-conostocmesentero-ides)：廣東省微生物菌種保藏中心；

嗜酸乳桿菌ATCC-4356(Lactobacillusacidophilus)：廣東省微生物菌種保藏中心；

MRS培養(yǎng)基：廣東環(huán)凱微生物技術(shù)有限公司；

氫氧化鈉、領(lǐng)苯二甲酸氫鉀、甲醛：AR級(jí)，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

無(wú)水乙醇：AR級(jí)，衡陽(yáng)市凱信化工試劑股份有限公司；

酚酞：AR級(jí)，天津市化學(xué)試劑研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

電子天平：AB265-S型，湖南立德測(cè)控技術(shù)有限公司；

立式壓力蒸汽滅菌鍋：LDZX-50KBS型，上海申安醫(yī)療器械廠；

離心機(jī)：SS-450型，湘潭離心機(jī)配件廠；

凈化工作臺(tái)：CJ-2D型，天津市泰斯特儀器有限公司；

生化培養(yǎng)箱：SPL-250型，天津市萊玻特瑞儀器設(shè)備有限公司；

電熱鼓風(fēng)干燥箱：WGL-230B型，天津市泰斯特儀器有限公司；

pH計(jì)：雷磁PH-S3C型，上海精密科學(xué)儀器有限公司；

雙向磁力攪拌器：78-2型，常州華普達(dá)教學(xué)儀器有限公司；

恒溫水浴鍋：DHG-9140A型，上海博訊醫(yī)療設(shè)備廠。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 工藝流程

紅線椒原料挑選→清洗晾干→剁碎→加入鹽漬辣椒汁→接種發(fā)酵液→混勻裝壇→密封發(fā)酵→殺菌冷卻→成品

1.3.2 乳酸菌發(fā)酵液的制備 將腸膜明串珠菌、嗜酸乳桿菌、植物乳桿菌3種菌株分別活化2～3代，再各吸取0.1 mL接入裝有50 mL MRS液體培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，在37 ℃下擴(kuò)大培養(yǎng)24 h，在3 500 r/min、4 ℃條件下離心10 min，用50 mL 0.85%的生理鹽水洗滌沉淀菌種2～3次后制成多菌種發(fā)酵劑備用(發(fā)酵種子液的菌濃度達(dá)109CFU/mL)。

1.3.3 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

(1) 乳酸菌接種量對(duì)鹽漬辣椒汁復(fù)合紅線椒發(fā)酵的影響：將菌種質(zhì)量比為植物乳桿菌∶嗜酸乳桿菌∶腸膜明串珠菌=1∶2∶1的發(fā)酵液接種于紅線椒與鹽漬辣椒汁質(zhì)量比為1∶1的發(fā)酵辣椒中，乳酸菌接種量分別為4%，5%，6%，7%，8%。在30 ℃的條件下靜置發(fā)酵5 d，發(fā)酵結(jié)束后對(duì)剁辣椒的乳酸和氨基酸態(tài)氮酸含量進(jìn)行測(cè)定，并對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行感官評(píng)價(jià)。

(2) 發(fā)酵溫度對(duì)鹽漬辣椒汁復(fù)合紅線椒發(fā)酵的影響：將菌種質(zhì)量比為植物乳桿菌∶嗜酸乳桿菌∶腸膜明串珠菌=1∶2∶1的發(fā)酵液接種于紅線椒與鹽漬辣椒汁質(zhì)量比為1∶1的發(fā)酵辣椒中，乳酸菌接種量為6%。分別在20，25，30，35，40 ℃的條件下靜置發(fā)酵5 d，發(fā)酵結(jié)束后對(duì)剁辣椒的乳酸和氨基酸態(tài)氮酸含量進(jìn)行測(cè)定，并對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行感官評(píng)價(jià)。

(3) 發(fā)酵時(shí)間對(duì)鹽漬辣椒汁復(fù)合紅線椒發(fā)酵的影響：將菌種配比質(zhì)量比為植物乳桿菌∶嗜酸乳桿菌∶腸膜明串珠菌=1∶2∶1的發(fā)酵液接種于紅線椒與鹽漬辣椒汁質(zhì)量比為1∶1的發(fā)酵辣椒中，乳酸菌接種量為6%。在25 ℃的條件下分別靜置發(fā)酵3，4，5，6，7 d，發(fā)酵結(jié)束后對(duì)剁辣椒的乳酸和氨基酸態(tài)氮酸含量進(jìn)行測(cè)定，并對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行感官評(píng)價(jià)。

1.3.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 選取接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間3個(gè)因素，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，按照Box-Behnken中心組合原理，使用Design-Expert.8.06軟件進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以乳酸含量為響應(yīng)值進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)。

1.3.5 測(cè)定指標(biāo)與方法

(1) 乳酸：酸堿滴定法，按GB/T 12456—2008執(zhí)行。

(2) 氨基酸態(tài)氮：酸度計(jì)法，按GB 5009.235—2006執(zhí)行。

(3) 感官評(píng)價(jià)：感官評(píng)定采用100分制，邀請(qǐng)10名食品專業(yè)的研究生組成評(píng)定小組對(duì)剁辣椒的外觀、色澤、口感、風(fēng)味和形態(tài)等進(jìn)行感官評(píng)分，結(jié)果取平均分作為最終評(píng)分。剁辣椒感官評(píng)分表見(jiàn)表1。

表1 剁辣椒感官評(píng)分表Table 1 Sensory evaluation of the chopped pepper

1.3.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 采用Design-Expert.8.06軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與數(shù)據(jù)分析，采用ORIGIN軟件制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 乳酸菌接種量對(duì)紅線椒與鹽漬辣椒汁復(fù)合發(fā)酵的影響 由圖1可知，隨著乳酸菌接種量的增大，乳酸和氨基酸態(tài)氮含量先增大后減小，當(dāng)乳酸菌接種量為6%時(shí)，兩者含量最大，當(dāng)乳酸菌接種量高于6%時(shí)，兩者含量又有下降趨勢(shì)。結(jié)合感官評(píng)分可以看出，乳酸菌接種量低于4%時(shí)，由于發(fā)酵劑中的乳酸菌量較少，使得發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)酸量不高，感官評(píng)分也較低；乳酸菌接種量高于4%時(shí)，隨著乳酸菌接種量的不斷上升，辣椒風(fēng)味逐漸濃郁，當(dāng)接種量為6%時(shí)，剁辣椒感官評(píng)分最高。當(dāng)接種量超過(guò)6%后，產(chǎn)品的色澤、口感、滋味和形態(tài)都會(huì)發(fā)生一定程度的下降。以上現(xiàn)象說(shuō)明隨著乳酸菌接種量的增加，紅線椒與鹽漬辣椒汁復(fù)合發(fā)酵的效果越來(lái)越好，但當(dāng)乳酸菌接種量達(dá)到一定程度后，若繼續(xù)增加，辣椒的風(fēng)味反而會(huì)適得其反，其原因在于產(chǎn)酸量是衡量一個(gè)菌種發(fā)酵能力的重要指標(biāo)，氨基酸態(tài)氮含量又是衡量剁辣椒鮮味的特性指標(biāo)[14]；當(dāng)乳酸菌接種量低于4%時(shí)，發(fā)酵液中的優(yōu)勢(shì)乳酸菌數(shù)太少，發(fā)酵過(guò)程中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)主要用于乳酸菌的生長(zhǎng)，因此，產(chǎn)酸率不高，同時(shí)由于含酸量不高，雜菌的生長(zhǎng)和代謝未被抑制，從而破壞了剁辣椒的風(fēng)味；當(dāng)乳酸菌接種量高于6%時(shí)，乳酸產(chǎn)率逐漸降低的原因在于剁辣椒中的生物量太多導(dǎo)致菌種對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的競(jìng)爭(zhēng)作用[15]。所以6%的乳酸菌接種量為本試驗(yàn)的最適接種量。

2.1.2 發(fā)酵溫度對(duì)紅線椒與鹽漬辣椒汁復(fù)合發(fā)酵的影響 發(fā)酵溫度是影響發(fā)酵的重要因素，溫度過(guò)高和過(guò)低都會(huì)影響乳酸菌的代謝，從而影響產(chǎn)品的風(fēng)味。由圖2可知，20～35 ℃時(shí)乳酸與氨基酸態(tài)氮的含量不斷增加，溫度高于35 ℃時(shí)兩者略有下降。由感官評(píng)分可知，發(fā)酵溫度在20～25 ℃時(shí)，發(fā)酵辣椒風(fēng)味不足且口感不佳，因?yàn)榈蜏赜绊懥巳樗峋旱纳L(zhǎng)與代謝，使得產(chǎn)酸量下降，對(duì)雜菌的抑制作用不強(qiáng)，導(dǎo)致發(fā)酵辣椒感官質(zhì)量不高；當(dāng)發(fā)酵溫度為40 ℃時(shí)，較高的溫度也會(huì)影響乳酸菌群的生長(zhǎng)，使得產(chǎn)品風(fēng)味不佳。已有的研究[13]表明植物乳桿菌和腸膜明串珠菌的最適生長(zhǎng)溫度在30～40 ℃，結(jié)合乳酸含量、氨基酸態(tài)氮含量與感官評(píng)分，選擇35 ℃為紅線椒與鹽漬辣椒汁復(fù)合發(fā)酵的最佳溫度。

圖1 不同乳酸菌接種量下的剁辣椒中各指標(biāo)的變化

Figure 1 Changes in various indicators ofred line chili under different lactobacillus inoculation

圖2 不同發(fā)酵溫度下的剁辣椒中各指標(biāo)的變化

Figure 2 Changes in various indicators of red line chili under different fermentation temperatures

2.1.3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)紅線椒與鹽漬辣椒汁復(fù)合發(fā)酵的影響 發(fā)酵時(shí)間是影響剁辣椒產(chǎn)品品質(zhì)的重要因素，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，乳酸菌不斷繁殖，發(fā)酵作用也不斷增強(qiáng)。由圖3可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，乳酸和氨基酸態(tài)氮含量不斷增加。發(fā)酵初期乳酸菌迅速產(chǎn)酸使得體系中pH迅速下降，有效抑制有害微生物的水平是乳酸發(fā)酵產(chǎn)品生產(chǎn)中的技術(shù)關(guān)鍵。發(fā)酵后期的乳酸含量緩慢增加的原因可能是由于酵母菌、丁酸菌等菌種分解乳酸導(dǎo)致[16]，也有可能是部分乳酸與乙醇發(fā)生酯化反應(yīng)生成乙酸乙酯所致[15]。由圖3還可知，發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)品的風(fēng)味逐漸變的濃郁，但發(fā)酵時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，乳酸含量過(guò)高，影響產(chǎn)品風(fēng)味，同時(shí)過(guò)度的發(fā)酵會(huì)導(dǎo)致組織軟化，從而使辣椒的脆度逐漸降低，產(chǎn)品的口感變差，其原因可能為在發(fā)酵過(guò)程中酵母菌及其他一些產(chǎn)果膠酶的菌群開(kāi)始大量生長(zhǎng)，產(chǎn)生果膠酶，使與纖維素結(jié)合的果膠物質(zhì)降解[14]。試驗(yàn)結(jié)果表明，發(fā)酵至第6天時(shí)，辣椒色澤紅亮，香氣濃郁，酸度適宜，所以選擇其為最佳的發(fā)酵時(shí)間。

圖3 不同發(fā)酵溫度下的剁辣椒中各指標(biāo)的變化

Figure 3 Changes in various indicators of red line chili under different fermentation time

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)

Box-Behnken試驗(yàn)因素水平見(jiàn)表2，設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表3。

2.2.1 回歸方程的方差分析 使用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)表3中數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多元回歸擬合，得到乳酸含量(Y)的回歸方程：

表2 Box-Behnken試驗(yàn)因素水平表Table 2 Factors and their coded levels used in Box-Behnken experimental design

表3 響應(yīng)曲面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Box-Behnken experimental design with experimental results

Y=0.74+0.025A+0.028B+0.032C-0.010AB+0.030AC-0.025BC-0.062A2-0.17B2-0.066C2。

(1)

2.2.2 交互作用分析 根據(jù)回歸方程可得到各因素之間的相互作用對(duì)剁辣椒乳酸含量影響的響應(yīng)面及等高線圖見(jiàn)圖4。曲面圖可反映各因素對(duì)乳酸含量的影響程度，曲面越陡峭則影響越顯著;等高線圖越似橢圓形，表明兩因素間交互作用越顯著，將圖4中(a)、(b)、(c)3圖進(jìn)行對(duì)比后得知，接種量與發(fā)酵溫度之間的交互作用最為顯著。

2.2.3 紅線椒與鹽漬辣椒汁復(fù)合發(fā)酵工藝的優(yōu)化組合及驗(yàn)證 通過(guò)Design-Expert 8.0.6軟件分析得到紅線椒與鹽漬辣椒汁復(fù)合發(fā)酵工藝的最優(yōu)條件為乳酸菌接種量6.27%、發(fā)酵溫度35.26 ℃、發(fā)酵時(shí)間6.30 d，預(yù)測(cè)在此工藝條件下，產(chǎn)品乳酸含量值為0.747%。為了實(shí)際操作時(shí)的便利設(shè)計(jì)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的優(yōu)化條件為乳酸菌接種量6%、發(fā)酵溫度35 ℃、發(fā)酵時(shí)間6 d，經(jīng)3次平行實(shí)驗(yàn)后得到產(chǎn)品乳酸含量為0.74%，且風(fēng)味良好，與理論預(yù)期值基本相符。

表4 回歸模型的方差分析?Table 4 Analysis of variance of regression model

? **.差異極顯著，P<0.01；*.差異顯著，P<0.05。

圖4 各因素交互作用對(duì)剁辣椒乳酸含量的影響Figure 4 The effects of various factors on the lactic acid content of chopped pepper

3 結(jié)論

本試驗(yàn)采用植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌和腸膜明串珠菌3種乳酸菌組成的多菌種發(fā)酵劑對(duì)使用鹽漬辣椒汁作為腌制劑的紅線椒進(jìn)行接種發(fā)酵，發(fā)酵后得到風(fēng)味良好的產(chǎn)品。同時(shí)得到最佳的工藝條件組合為乳酸菌接種量6%、發(fā)酵溫度35 ℃、發(fā)酵時(shí)間6 d，經(jīng)驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)后得到乳酸含量為0.74%，且風(fēng)味良好的產(chǎn)品。

回顧試驗(yàn)過(guò)程對(duì)鹽漬辣椒汁與紅線椒發(fā)酵產(chǎn)品的進(jìn)一步研究提出以下展望：

(1) 剁辣椒發(fā)酵過(guò)程中以乳酸菌為主的益生微生物發(fā)揮著重要的作用，除乳酸菌外的酵母菌、醋酸桿菌、丁酸菌等微生物的生長(zhǎng)繁殖對(duì)發(fā)酵產(chǎn)品的品質(zhì)有一定的影響，本次試驗(yàn)多菌種發(fā)酵劑中的3種菌株皆屬乳酸菌類，下一步可對(duì)其他菌種發(fā)酵劑的配方進(jìn)行研究，進(jìn)一步提高產(chǎn)品品質(zhì)。

(2) 在鹽漬辣椒汁的研究上，參數(shù)、指標(biāo)的選取仍是一個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題，下一步研究可對(duì)產(chǎn)品中有機(jī)酸含量與組成、氨基酸組成、揮發(fā)性成分等指標(biāo)進(jìn)行監(jiān)測(cè)，更為全面地對(duì)產(chǎn)品品質(zhì)進(jìn)行把關(guān)。

(3) 將鹽漬辣椒汁作為腌制劑發(fā)酵紅線椒，產(chǎn)品脆度稍差，可考慮添加鈣鹽類保脆劑提高產(chǎn)品的脆度。

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