劉 星，劉云鵬，付 慧，劉 雪，姜曉亮，楊志偉(中國醫(yī)學科學院醫(yī)學實驗動物研究所，北京協(xié)和醫(yī)學院比較醫(yī)學中心，北京 100021)

鈉水代謝障礙是導致高血壓等多種心腦血管疾病的重要病因[1 - 3]。腎臟多巴胺D5受體(D5R)通過調(diào)節(jié)腎臟鈉鉀ATP酶(Na+, K+-ATPase)、鈉氫交換體(Na+/H+exchanger 3，NHE3)的活性在鈉水代謝和血壓調(diào)節(jié)中起重要作用[4]。胃泌素(gastrin)是一種重要的胃腸激素，已被證實在調(diào)節(jié)機體鈉水代謝中起重要作用[5]。Gastrin由胃和十二指腸內(nèi)的G細胞分泌，并釋放到血液循環(huán)中。與其他胃腸激素相比gastrin能夠被腎皮質(zhì)腎小管大量吸收，通過與其受體CCKBR結(jié)合參與鈉離子調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)運[6]。有研究發(fā)現(xiàn)D5R與CCKBR在腎臟近曲小管上皮細胞共表達，并通過相互調(diào)節(jié)參與機體鈉水代謝[7]，但其機制并不清楚。

微管(microtubule)是構(gòu)成細胞骨架的主要成分，由α和β兩種類型的微管蛋白亞基構(gòu)成二聚體，在細胞內(nèi)物質(zhì)運輸?shù)壬磉^程中發(fā)揮重要作用[8]。β-tubulin是抗微管藥物的主要靶點，是構(gòu)成細胞骨架重構(gòu)的關鍵蛋白[9]，其表達異常與心肌損傷、癌癥等多種疾病的發(fā)展密切相關。研究證明,有功能和活性的多巴胺受體在細胞質(zhì)膜上是動態(tài)變化的，且需要完整的微管網(wǎng)絡的介導[10]。微管蛋白抑制劑nocodazole可以破壞微管蛋白網(wǎng)絡和并阻斷循環(huán)利用的多巴胺受體遷移至細胞膜[11]，但目前關于β-tubulin參與D5R和CCKBR的轉(zhuǎn)運的研究甚少。本研究擬探討β-tubulin在CCKBR和D5R相互作用及鈉水代謝中的作用，并比較其在正常人和高血壓患者中的表達差異。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

正常人腎近曲小管細胞(NT16)和高血壓患者腎近曲小管細胞(HT14)由安徽醫(yī)科大學教授惠贈。

1.2 主要試劑與儀器

胃泌素(南京金斯瑞生物科技有限公司，RP12740)，fenoldopam(Sigma公司，SML0198)，小鼠抗人多巴胺D5R抗體(Novus公司，NB110-60019)，兔抗人CCKBR抗體(Santa Cruz公司，SC-33221)，兔抗人Na+, K+-ATP酶抗體(Santa Cruz公司，SC-28800)，β-tubulin抗體(杭州華安公司，M1305-2)，羊抗小鼠IgG(Abcam 公司，Ab175473)。激光共聚焦掃描顯微鏡(Leica TCS SP2，德國)，化學發(fā)光凝膠成像儀(Tanon-5500)，CO2培養(yǎng)箱(Thermo 公司，F(xiàn)ORMA 371)。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養(yǎng)和實驗分組

正常人腎近曲小管細胞(NT16)和高血壓患者腎近曲小管細胞(HT14)用DMED/F12培養(yǎng)基，置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)基中含有表皮生長因子EGF(10 ng/mL)，地塞米松(36 ng/mL)，三碘甲狀腺氨酸T3(2 ng/mL)，胰島素鐵硒傳遞蛋白ITS(1×)，青霉素/鏈霉素(10 000 U/mL)，胎牛血清(2%)，細胞長滿后用胰酶消化傳代培養(yǎng)。

1.3.2 免疫熒光檢測蛋白表達定位

細胞長至合適濃度，計數(shù)后調(diào)整濃度為2 × 104個/mL，接種于無菌蓋玻片，長至50%進行實驗。吸凈培養(yǎng)基，無血清培養(yǎng)基洗一遍，分別加入gastrin、fenoldopam、nocodazole，37℃處理(分組如下)，將正常人腎近曲小管細胞(NT16)分為四組：第一組：gastrin(10-8mol/L，30 min)組；第二組：nocodazole(10-4mol/L，30 min)+ gastrin(10-8mol/L，30 min)組，第三組：fenoldopam(10-6mol/L，30 min)組；第四組：nocodazole(10-4mol/L，30 min)+ fenoldopam(10-6mol/L，30 min)組。將高血壓患者腎近曲小管細胞(HT14)分為兩組：第一組：gastrin(10-8mol/L，30 min)組；第二組：fenoldopam(10-6mol/L，30 min)組。處理后加入PBS洗三遍，4%多聚甲醛常溫固定20 min，PBS洗三遍，1% Triton 100破膜15 min，PBS洗三遍，10% FBS常溫封閉30 min，β-tubulin抗體、D5R抗體、CCKBR抗體，4℃過夜，PBS洗三遍，羊抗小鼠IgG 1∶200室溫1 h，PBS洗三遍，滴一滴DAPI，將圓形玻片取出，小心扣于載玻片上，封片，熒光顯微鏡觀察。

1.3.3 Western blot檢測蛋白表達

兩種細胞分別按2 × 104個/mL濃度接種于100 mm細胞培養(yǎng)皿，37℃、5% CO2生長至合適濃度，無血清培養(yǎng)基漂洗一次，分為五組，第一組：對照組；第二組：fenoldopam(10-6mol/L，24 h)組；第三組：nocodazole(10-4mol/L，30 min)+ fenoldopam(10-6mol/L，24 h)組；第四組：gastrin(10-8mol/L，24 h)組；第五組：nocodazole(10-4mol/L，30 min)+ gastrin(10-8mol/L，24 h)組，37℃、5% CO2過夜培養(yǎng)，PBS洗三遍，胰酶消化細胞，PBS洗三遍，提取膜蛋白，測定蛋白濃度，制樣，40 μg蛋白量10% SDS-PAGE電泳，2000 mA NC膜轉(zhuǎn)移1 h，5%脫脂奶粉室溫封閉3 h，分別與小鼠抗人D5R抗體、兔抗人CCKBR抗體、兔抗人Na+, K+-ATP酶抗體4℃過夜反應，二抗為羊抗小鼠IgG抗體(1∶5000)，羊抗兔IgG(1∶5000)，反應1 h，HRP-GAPDH為內(nèi)參抗體(1∶10 000)，化學發(fā)光，曝光。

1.4 統(tǒng)計學方法

2 結(jié)果

2.1 腎臟近曲小管細胞中CCKBR和D5R的相互作用

給予正常人近曲小管細胞(NT16)fenoldopam處理后細胞膜CCKBR的表達量顯著增加，同樣，給予細胞gastrin后細胞膜D5R的表達量顯著增加(P< 0.05，圖1A)。本課題組前期研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)D5R和CCKBR間存在相互作用共同參與鈉水代謝[7]，但其相互作用的機制并不清楚。因此本研究使用微管抑制劑nocodazole預處理再加入fenoldopam，細胞膜CCKBR的表達量與對照組相比增加不顯著(P< 0.05，圖1A)，同樣使用nocodazole預處理再加入gastrin處理后，細胞膜D5R的表達量與對照組相比無差異，Na+, K+-ATP酶的表達也與對照組無異。該結(jié)果顯示腎小管上皮細胞內(nèi)D5R和CCKBR的相互作用與微管蛋白密切相關。

然而對高血壓患者腎臟近曲小管細胞的研究發(fā)現(xiàn)，兩種受體激動劑的加入對于D5R和CCKBR的相互作用并沒有顯著的促進作用，給予nocodazole預處理后細胞膜CCKBR及D5R的表達量差異無顯著性(P> 0.05，圖1B)。該結(jié)果提示高血壓患者較正常人腎近曲小管細胞中D5R和CCKBR的相互作用存在顯著差異，其機制可能與微管蛋白功能缺失有關，因此影響到相關蛋白的轉(zhuǎn)運和鈉水代謝。

注：A：正常人腎臟近曲小管細胞(NT16)；B：高血壓病人腎臟近曲小管細胞(HT14)。FEN： fenoldopam(D5R激動劑)；GAS：胃泌素gastrin(CCKBR激動劑)。與對照組相比，* P< 0.05；與FEN組相比，# P< 0.05；與GAS組相比，& P< 0.05。圖1 人腎臟近曲小管細胞中CCKBR和D5R的相互作用Note.A: Normotensive renal proximal tubule cells (NT16). B: Hypertensive renal proximal tubule cells (HT14). FEN: fenoldopam (D5R agonist); GAS: gastrin (CCKBR agonist). Compared with the control group,* P< 0.05. Compared with the FEN group,# P< 0.05. Compared with the GAS group,& P< 0.05.Fig.1 Microtubules are involved in the interaction between the cholecystokinin B receptor and dopamine D5 receptor in human renal proximal tubule cells

2.2 正常人與高血壓患者腎近曲小管細胞微管蛋白β-tubulin差異

為了檢測正常人與高血壓患者腎臟近曲小管細胞微管蛋白是否存在表達差異，本研究通過免疫熒光方法，標記微管蛋白β-tubulin。如圖2所示，NT16細胞的微管蛋白在細胞內(nèi)呈現(xiàn)清晰的束網(wǎng)狀分布，多聚集于細胞內(nèi)部向細胞膜延伸；但HT14細胞的微管蛋白結(jié)構(gòu)混亂，無序，在細胞膜上分布明顯變多。有研究顯示高血壓病人紅細胞中微管蛋白向細胞膜轉(zhuǎn)移[12]。本研究則發(fā)現(xiàn)HT14細胞的微管蛋白同樣表現(xiàn)出異常行為，可能是造成細胞中D5R和CCKBR等蛋白轉(zhuǎn)運障礙的重要原因之一。

注：NT16：正常人腎臟近曲小管細胞；HT14：高血壓病人腎臟近曲小管細胞。圖2 微管蛋白在正常人和高血壓病人腎臟近曲小管細胞中的表達Note.NT16: Normotensive renal proximal tubule cells; HT14: Hypertensive renal proximal tubule cells.Fig.2 Tubulin expression in normotensive and hypertensive renal proximal tubule cells

2.3 微管蛋白促進CCKBR和D5R在正常腎臟近曲小管細胞中的轉(zhuǎn)運

已有研究發(fā)現(xiàn)多巴胺受體等多種蛋白在細胞質(zhì)和細胞膜中的動態(tài)位移需要微管蛋白系統(tǒng)的介導[10]。為了進一步研究微管蛋白參與CCKBR和D5R的轉(zhuǎn)運機制，本研究通過免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)，fenoldopam處理NT16細胞后，D5R和CCKBR表達聚集在細胞膜上(圖3A)，nocodazole預處理再給予fenoldopam后，由激動劑誘發(fā)的D5R及CCKBR向細胞膜上的移動均無法發(fā)生，細胞膜上相應的受體蛋白表達也沒有明顯增加(圖3C)。同樣nocodazole能夠阻斷gastrin誘導的D5R和CCKBR向細胞膜轉(zhuǎn)移(圖3F)，說明腎小管上皮細胞內(nèi)D5R和CCKBR的轉(zhuǎn)運與廣泛存在的微管蛋白密切相關，當微管結(jié)構(gòu)被破壞以后，受體間的招募活動無法完成，從而影響受體表達及對鈉水代謝的調(diào)節(jié)功能。

高血壓患者腎小管近曲小管HT14細胞使用fenoldopam和gastrin刺激后，D5R和CCKBR并未出現(xiàn)明顯的細胞膜轉(zhuǎn)移，細胞質(zhì)中的表達仍然較多(圖3B和圖3D)。該結(jié)果進一步證實，高血壓病人較正常人腎近曲小管細胞微管蛋白可能存在功能上的缺失，從而導致D5R和CCKBR等蛋白遷移至細胞膜的能力變?nèi)?，因此影響到相關蛋白的表達以及發(fā)揮生物學功能。

注：NT16：正常人腎臟近曲小管細胞；HT14：高血壓病人腎臟近曲小管細胞。FEN： fenoldopam(D5R激動劑)；GAS：胃泌素gastrin(CCKBR激動劑)；nocodazole：微管抑制劑。圖3 微管蛋白促進CCKBR和D5R在人腎臟近曲小管細胞中的轉(zhuǎn)運Note.NT16: Normotensive renal proximal tubule cells; HT14: Hypertensive renal proximal tubule cells. FEN: fenoldopam (D5R agonist); GAS: gastrin (CCKBR agonist); nocodazole: microtubule inhibitor.Fig.3 Microtubules improve the interaction between the cholecystokinin B receptor and dopamine D5 receptor in human renal proximal tubule cells

3 討論

鈉水代謝障礙是導致高血壓和心血管疾病的重要原因之一[2 - 3]，機體內(nèi)的鈉水代謝受到胃腸道和腎臟的共同調(diào)控。胃泌素作為重要的胃腸道激素，通過與其受體CCKBR結(jié)合參與鈉水代謝的調(diào)節(jié)[13]。胃泌素能被腎臟近曲小管細胞吸收從而調(diào)節(jié)腎臟鈉離子轉(zhuǎn)運[6]。胃泌素也能夠抑制小腸粘膜鈉離子的轉(zhuǎn)運，增加鈉排泄[14]，因此本課題組首次通過人群實驗證實胃泌素與高血壓的發(fā)病機制密切相關[15]，并且通過動物實驗證實CCKBR能夠與D5R相互作用參與機體鈉水代謝調(diào)節(jié)和鹽敏感性高血壓的發(fā)展[7]。在對具體作用機制的進一步研究中，本課題組發(fā)現(xiàn)細胞骨架中的微管蛋白起著非常重要的調(diào)節(jié)作用。

微管是細胞骨架的主要成分之一，幾乎存在于所有真核生物細胞之中。近年來，由于其在細胞形態(tài)的維持、細胞內(nèi)物質(zhì)運輸、細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導、細胞分裂及分化等生理過程中的重要作用，已成為多種疾病治療的新靶點[8, 16]。β-tubulin是重要的微管蛋白，它作為鈣離子相關蛋白，參與細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導[17]。研究顯示，糖尿病大鼠心肌細胞中β-tubulin表達增多。ATⅡ拮抗劑可有效阻斷RAAS通路，抑制β-tubulin表達，從而對糖尿病心肌起到保護作用[18]。高血壓患者的紅細胞中微管蛋白向細胞膜移動，并與Na+, K+-ATP酶結(jié)合，導致酶活性受到抑制。應用諾考達唑治療高血壓患者的紅細胞，引起細胞膜上乙?；奈⒐艿鞍诇p少，使Na+, K+-ATP酶激活[12]。本實驗通過免疫熒光檢測腎臟近曲小管細胞中β-tubulin的表達，同樣發(fā)現(xiàn)正常人的微管蛋白β-tubulin在細胞中成清晰的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，而高血壓患者腎臟細胞中的β-tubulin表達雜亂無章，微管網(wǎng)絡不清晰，有向細胞膜移動的趨勢，顯示高血壓患者腎小管細胞中的微管蛋白表達異常。而研究顯示，微管網(wǎng)絡參與并且調(diào)控多巴胺受體由細胞內(nèi)向細胞質(zhì)膜的遷移，并在細胞質(zhì)膜上保持動態(tài)變化，從而發(fā)揮調(diào)節(jié)鈉水代謝等生理功能[19 - 20]。也有研究顯示微管蛋白對于D5R及CCKBR等G蛋白偶聯(lián)受體的轉(zhuǎn)運起十分重要的作用[21 - 22]。高血壓患者腎臟多巴胺系統(tǒng)表達異常，鈉水代謝障礙[23 - 24]。因此微管蛋白可能成為調(diào)控CCKBR和D5R間相互作用，參與鈉水代謝和血壓調(diào)節(jié)的新靶點。

本研究通過給予正常人腎臟近曲小管細胞(NH16)CCKBR激動劑gastrin和D5R激動劑fenoldopam后，D5R及CCKBR均可以向細胞膜上移動，其在細胞膜上的表達量也有所增加。nocodazole可以破壞微管蛋白網(wǎng)絡，進而影響受體遷移至細胞膜的能力，因此在對正常人腎小管近曲小管細胞進行nocodazole預處理后，激動劑并沒有增加細胞膜上D5R及CCKBR的表達量，免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)D5R及CCKBR仍然聚集在細胞內(nèi)部，并沒有向細胞膜移動。該結(jié)果證實微管蛋白在D5R及CCKBR相互作用中起重要作用，并且發(fā)現(xiàn)高血壓患者體內(nèi)腎臟近曲小管細胞中微管蛋白的異?？赡苁怯绊慏5R及CCKBR相互作用及鈉水代謝的重要原因之一。目前研究發(fā)現(xiàn)nocodazole能夠抑制PKC的激活[10]。腎臟D5R可以激活磷脂酶C(PLC)-PKC途徑[25]，胃泌素能夠與CCKBR結(jié)合激活PI3K/PKC途徑[26]。因此，微管網(wǎng)絡可能通過抑制PKC激活從而抑制D5R及CCKBR相互作用，也是本課題組下一步研究的內(nèi)容。

綜上所述，本研究首次發(fā)現(xiàn)微管蛋白β-tubulin參與腎臟近曲小管細胞內(nèi)D5R與CCKBR相互作用及Na+, K+-ATP酶的調(diào)節(jié)，從而參與鈉水代謝調(diào)節(jié)；同時發(fā)現(xiàn)高血壓患者腎小管內(nèi)β-tubulin存在表達和功能上的缺失，從而影響D5R與CCKBR相互作用及對鈉水代謝的調(diào)節(jié)，可能成為鹽敏感高血壓治療的新靶點。

參考文獻：

[1] 水克冬, 祁華金, 陸昀, 等. 2002年和2012年我國成人高血壓患病和治療情況比較分析 [J]. 中國醫(yī)藥導報, 2016, 13(24): 170-173.

[2] Frame AA, Wainford RD. Renal sodium handling and sodium sensitivity [J]. Kidney Res Clin Pract, 2017, 36(2): 117-131.

[3] Hall JE. Kidney dysfunction mediates salt-induced increases in blood pressure [J]. Circulation, 2016, 133(9): 894-906.

[4] Cuevas S, Villar VA, Jose PA, et al. Renal dopamine receptors, oxidative stress, and hypertension [J]. Int J Mol Sci, 2013, 14(9): 17553-17572.

[5] Jose PA, Yang Z, Zeng C, et al. The importance of the gastrorenal axis in the control of body sodium homeostasis [J]. Exp Physiol, 2016, 101(4): 465-470.

[6] Melis M, Krenning EP, Bernard BF, et al. Renal uptake and retention of radiolabeled somatostatin, bombesin, neurotensin, minigastrin and CCK analogues: species and gender differences [J]. Nucl Med Biol, 2007, 34(6): 633-641.

[7] Jiang X, Chen W, Liu X, et al. The synergistic roles of cholecystokinin B and dopamine D5 receptors on the regulation of renal sodium excretion [J]. PLoS One, 2016, 11(1): e0146641.

[8] Sève P, Isaac S, Trédan O, et al. Expression of class III β-tubulin is predictive of patient outcome in patients with non-small cell lung cancer receiving vinorelbine-based chemotherapy [J]. Clin Cancer Res, 2005, 11(15): 5481-5486.

[9] Aquila-Pastir LA, DiPaola NR, Matteo RG, et al. Quantitation and distribution of β-tubulin in human cardiac myocytes [J]. J Mol Cell Cardiol, 2002, 34(6): 1513-1523.

[10] Kruse MS, Adachi S, Scott L, et al. Recruitment of renal dopamine 1 receptors requires an intact microtubulin network [J]. Pflugers Arch - Eur J Physiol, 2003, 44(5): 534-539.

[11] 禚銀玲, 郭其森. 下調(diào)βIII-tubulin逆轉(zhuǎn)肺腺癌A549/Taxol細胞株紫杉醇耐藥 [J]. 中國肺癌雜志, 2014, 1(8): 581-587.

[12] Amaiden MR, Santander VS, Monesterolo NE, et al. Tubulin pools in human erythrocytes: altered distribution in hypertensive patients affects Na+, K+-ATPase activity [J]. Cell Mol Life Sci, 2011, 68(10): 1755-1768.

[13] Koh TJ. Extragastric effects of gastrin gene knock-out mice [J]. Pharmacol Toxicol, 2002, 91(6): 368-374.

[14] von Schrenck T, Ahrens M, de Weerth A, et al. CCKB/gastrin receptors mediate changes in sodium and potassium absorption in the isolated perfused rat kidney [J]. Kidney Int, 2000, 58(3): 995-1003.

[15] Jiang X, Wang W, Ning B, et al. Basal and postprandial serum levels of gastrin in normotensive and hypertensive adults [J]. Clin Exp Hypertens, 2013, 35(1): 74-78.

[16] Bhattacharya R, Cabral F. A ubiquitous beta tubulin disrupts microtubule assembly and inhibits cell proliferation [J]. Mol Biol Cell, 2004, 15(7): 3123-3131.

[17] 袁致海, 賀曉生, 陳延, 等. 大鼠創(chuàng)傷性腦損傷后腦組織β-微管蛋白表達及意義 [J]. 中華神經(jīng)外科疾病研究雜志, 2013, 12(2): 134-137.

[18] 鐘雯, 曾姣娥, 文重遠, 等. 糖尿病大鼠心肌β-微管蛋白的表達及纈沙坦的保護性作用 [J]. 實用醫(yī)學雜志, 2011, 27(14): 2526-2528.

[19] Padia SH, Kemp BA, Howell NL, et al. Mechanisms of dopamine D1 and angiotensin AT2 receptor interaction in natriuresis [J]. Hypertension, 2012, 59(2): 437-445.

[20] Brismar H, Asghar M, Carey RM, et al. Dopamine-induced recruitment of dopamine D1 receptors to the plasma membrane [J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 1998, 95(10): 5573-5578.

[21] Brown D. Targeting of membrane transporters in renal epithelia: when cell biology meets physiology [J]. Am J Physiol, 2000, 278(2): F192-F201.

[22] Holtback U, Brismar H, DiBona GF, et al. Receptor recruitment: a mechanism for interactions between G protein-coupled receptors [J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 1999, 96(13): 7271-7275.

[23] Armando I, Konkalmatt P, Felder RA, et al. The renal dopaminergic system: novel diagnostic and therapeutic approaches in hypertension and kidney disease [J]. Transl Res, 2015, 165(4): 505-511.

[24] 張艷榮, 全雄志, 董偉, 等. 多巴胺D5受體轉(zhuǎn)基因小鼠的建立 [J]. 中國比較醫(yī)學雜志, 2008, 28(5): 54-58.

[25] Nowicki S, Kruse MS, Brismar H, et al. Dopamine-induced translocation of protein kinase C isoforms visualized in renal epithelial cells [J]. Am J Physiol, 2000, 279(6): C1812-C1818.

[26] Tripathi S, Flobak A, Chawla K, et al. The gastrin and cholecystokinin receptors mediated signaling network: a scaffold for data analysis and new hypotheses on regulatory mechanisms [J]. BMC Syst Biol, 2015, 24(7): 29-40.