邢志恒 呂娜 何忠梅 郜玉鋼 趙巖 祝洪艷 楊鶴 張連學(xué)

摘 要 對黃藤素進行結(jié)構(gòu)修飾，采用160～180℃高溫熱解使黃藤素選擇性在9-位脫甲基，再分別與一系列酰氯發(fā)生酯化反應(yīng)，最終獲得12種黃藤素衍生物，經(jīng)1H-NMR、13C-NMR分析確定了各衍生物的化學(xué)結(jié)構(gòu)，分別為：9-O-苯甲?；?黃藤素（9-O-Benzoyl-fibrauretin）、9-O-（2-甲基苯甲?；?黃藤素（9-O-（2-Methylbenzoyl）-fibrauretin）、9-O-（4-甲基苯甲?；?黃藤素（9-O-（4-Methylbenzoyl）-fibrauretin）、9-O-（3，5-二甲基苯甲酰基）-黃藤素（9-O-（3，5-Dimethylbenzoyl）-fibrauretin）、9-O-（4-（氯甲基）苯甲酰基）-黃藤素（9-O-（4-（Chloromethyl）benzoyl）-fibrauretin）等共12種化合物，均為新化合物。采用以碘化硫代乙酰膽堿為底物、來源于蒼蠅頭部的乙酰膽堿酯酶（AChE）為酶源的體外活性測定方法，測定了黃藤素及其衍生物的AChE抑制活性。結(jié)果表明，大部分黃藤素酰氯衍生物體外AChE抑制活性均強于黃藤素，其中化合物9-O-（4-甲基苯甲?；?黃藤素、9-O-（3，5-二甲基苯甲?；?黃藤素、9-O-（4-（氯甲基）苯甲?；?黃藤素對AChE的抑制作用顯著，活性強度強于陽性藥鹽酸多奈哌齊，具有開發(fā)成抗阿爾茨海默癥藥物的潛力。

關(guān)鍵詞 黃藤素；酯化反應(yīng)；乙酰膽堿酯酶；抑制活性

1 引 言

隨著全球范圍內(nèi)老齡化人口的增加，阿爾茨海默病（Alzheimer's disease，AD）己成為繼中風、癌癥、心血管疾病之后嚴重威脅老年人生命的一大殺手[1]。AD是以中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)Tau蛋白高度磷酸化、β-淀粉樣蛋白（β-Amyloid protein，Aβ）老年斑沉積為特征的一種神經(jīng)系統(tǒng)進行性、退行性疾病。具有抑制體內(nèi)乙酰膽堿酯酶（AChE）活性的藥物（AChEI）可以緩解AD的癥狀[2]，目前AChEI類制劑已廣泛應(yīng)用于臨床治療。已上市的乙酰膽堿酯酶抑制劑他克林（Tacrine）、利斯的明（Rivastigmine）、鹽酸多奈哌齊（Donepezil）等藥物雖有一定治療作用，但均存在選擇性低、副作用較大的缺點[3～5]。研究發(fā)現(xiàn)，從中藥中提取的生物堿、香豆素、萜類、黃酮等成分均具有抑制AChE的作用[6]，如石杉科植物千層塔中發(fā)現(xiàn)的石杉堿甲[7]、油膠樹脂白松香中分離得到的8-羥基香豆素[8]、唇形科植物益母草中的二萜類化合物Leoheteronin A和Leopersin G[9]等都有顯著抑制AChE活性的作用，并且副作用都相對較低。因此，從中藥中尋找耐受性好、活性強、副作用小的AChEI成為國內(nèi)外研究的熱點。

中藥黃藤為防己科（Menispermaceae）天仙藤屬（Fibraurea）植物黃藤（Fibraurea recisa Pierre.）的干燥藤莖，又名天仙藤、土黃連、金鎖匙、藤黃連[10]等，始載于《本草綱目》，現(xiàn)收載于2015年版《中華人民共和國藥典》，其味苦，性寒，歸心、肝經(jīng)，具有清熱解毒、瀉火通便功效[11]，主要含有生物堿類成分[12]，主要活性代表成分為黃藤素，具有抗炎[13～14]、抑菌[15]、增強免疫[16]等作用。目前，黃藤素制劑在臨床上主要用于治療各種感染性疾病[17]，療效確切，使用安全。本課題組發(fā)現(xiàn)黃藤素體外具有顯著抑制AChE活性的作用，其活性作用強度是陽性對照藥鹽酸多奈哌齊的50倍[18，19]，但由于黃藤素分子結(jié)構(gòu)中含有季銨氮，水溶性較強，故體內(nèi)生物利用度較低[20]。為進一步開發(fā)利用黃藤素，本研究從中藥黃藤中分離純化得到黃藤素，對其結(jié)構(gòu)進行修飾，規(guī)避開8-位C上的親核加成反應(yīng)和13-位Mannich反應(yīng)引入烷基的方法[21，22]，使其在9-位選擇性脫甲基，分別與一系列酰氯發(fā)生酯化反應(yīng)，以獲得具有較強AChE抑制作用、生物利用度較高的衍生物，為黃藤的進一步開發(fā)利用以及AD新藥開發(fā)提供了參考。

2 實驗部分

2.1 儀器與試劑

Angilent1220高效液相色譜儀（美國Angilent公司）；AV400型超導(dǎo)核磁共振波譜儀（瑞士Bruker公司）； BS124S電子天平（賽得利斯有限公司）； 熔點測定儀（Yanacomicrometer）； RE52-98型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；RT-6100酶標分析儀（雷杜公司）；pH計（上海虹益儀器儀表有限公司）。

黃藤藥材購于云南昆明中藥材市場，經(jīng)吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)張連學(xué)教授鑒定為防己科天仙藤屬植物黃藤（Fibraurea recisa Pierre.）的干燥藤莖。D101大孔樹脂（天津波鴻樹脂科技有限公司）； 堿性氧化鋁（國藥集團化學(xué)試劑有限公司）； ODS（FUJI Silysia Chemical高松，批號R050606）； 鹽酸多奈哌齊片（衛(wèi)材（中國）藥業(yè)有限公司）； 5，5'-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）（DTNB）、碘化硫代乙酰巰基膽堿（ATCI）、Tris堿（分析純，美國Sigma公司）； 小牛血清蛋白（廈門市云鵬科技發(fā)展有限公司）； 乙酰膽堿酯酶（200 U/g，來源于蒼蠅頭部， 上海源葉生物科技有限公司）。其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

2.2 實驗方法

2.2.1 乙酰膽堿酯酶溶液的配制 AChE溶于20 mL Tris-HCl（0.05 mol/L，pH=7.8）緩沖液中，再加入1 mg小牛血清蛋白穩(wěn)定酶液，制得10 U/mL酶溶液。用pH=8.0的PBS稀釋成0.5 U/mL的酶液，供AChE活性抑制測定方法Ellman法使用[23]。7.92 mg DTNB溶于1 mL無水乙醇中，用pH=7.0的PBS緩沖溶液定容至10 mL，制得2 mmol/L DTNB。將43.34 mg ATCI以水溶解并定容至10 mL，得到15 mmol/L ATCI溶液，在4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2 鹽酸多奈哌齊溶液的配制 取鹽酸多奈哌齊片（批號：140607A）1片（含鹽酸多奈哌齊5 mg）研細，溶于5 mL pH 8.0 的PBS緩沖溶液中，即得1 mg/mL的溶液，依次用PBS緩沖液稀釋至50、25、10、5和2.5 g/mL。

2.2.3 待測樣品溶液的配制 精密稱取各待測樣品10 mg，加入適量10% （V/V）DMSO溶解，再用pH 8.0的PBS緩沖液定容至10 mL，配成1 mg/mL待測樣品原液，用PBS緩沖液稀釋成100、50、25、10、5、2.5和1.25 g/mL系列溶液，經(jīng)0.45 m濾膜過濾，樣品溶液中DMSO終濃度均小于1%。

2.2.4 黃藤素的制備 黃藤藥材2 kg，用10倍量60%乙醇回流提取2次，每次2 h，濾過，合并濾液，減壓濃縮得浸膏228.3 g。將浸膏加水使溶解，通過預(yù)先處理好的D101大孔樹脂柱（Φ 1000 mm×100 mm），先用3倍柱體積水洗，再用8倍柱體積40%乙醇洗脫，收集乙醇洗脫液，回收乙醇，干燥，得黃藤總生物堿50.6 g。取黃藤總生物堿10 g溶于95%乙醇，經(jīng)堿性氧化鋁柱（100～200目，200 g， Φ 880 mm ×100 mm）層析，95%乙醇為洗脫劑常壓洗脫，薄層層析（TLC）檢測，合并相同組分，組分Ⅰ經(jīng)ODS柱（40～75 μm， Φ 420 × 36 mm），以甲醇-水（10∶90～50∶50， V/V）梯度洗脫，TLC檢測，合并相同組分，分離得到純化合物，經(jīng)氫譜碳譜檢測該化合物為黃藤素，純度>95%，以其為原料進行衍生物合成。

2.2.5 黃藤素衍生物的合成 黃藤素在160～180℃真空條件下熱解20 min[24]，冷卻至室溫，用硅膠柱分離提純（V三氯甲烷∶V甲醇∶V氨水= 8∶1∶0.1）得暗紅色粉末狀化合物巴馬汀紅堿，將巴馬汀紅堿溶于CH2Cl2中，緩慢滴加各種酰氯試劑，再加入三乙胺，常溫條件下攪拌，待反應(yīng)完全，減壓回收溶劑，干燥，得粗產(chǎn)物。粗產(chǎn)物先用乙醚洗脫，再用硅膠柱分離純化，三氯甲烷、甲醇洗脫，得黃色粉末化合物a-l，經(jīng)高效液相色譜法測定各化合物純度均大于90%。具體反應(yīng)流程見圖1。

得到的12個黃藤素衍生物a-l的R基團取代情況見電子版文后支持信息中圖S1。

2.2.6 黃藤素衍生物乙酰膽堿酯酶抑制活性研究 參照文獻[23]的方法，測定黃藤素、黃藤素衍生物以及陽性對照藥鹽酸多奈哌齊的對乙酰膽堿酯酶活性體外抑制率。

酶促反應(yīng)條件優(yōu)化：分別考察不同酶濃度（所加酶量分別為2.5、5、7.5、10、15和20 μL）、不同反應(yīng)時間（5、10、15、20、25和30 min）、不同反應(yīng)底物濃度（分別為1.0、2.5、5.0、10.0、15.0、20.0和25.0 mmol/L）時反應(yīng)體系的吸光度（OD）值變化情況，以確定最佳酶促反應(yīng)條件。

最終反應(yīng)體系條件如下： 96孔板中每孔加入140 μL PBS緩沖液，20 μL待測樣品溶液和15 μL 0.5 U/mL酶溶液，混合均勻后在4℃保存20 min。取出96孔板每孔加入10 μL 2 mmol/L DTNB溶液和10 μL 15 mmol/L ATCI溶液，37℃反應(yīng)20 min，測定405 nm處吸收值。背景對照孔用15 μL PBS緩沖液代替15 μL酶溶液，空白對照孔用20 μL PBS緩沖液代替20 μL待測樣品溶液。按公式（1）計算酶活性抑制率（R）：

R=A0-（AS-AB）A0× 100%（1）

其中， A0表示不加樣品的吸收值；AS表示為既加樣品又加酶的吸收值；AB表示為不加酶的吸收值。

黃藤素、黃藤素衍生物以及陽性對照藥鹽酸多奈哌齊分別設(shè)定5個梯度濃度，按照上述反應(yīng)體系條件操作，測定每個孔在405 nm處的吸收值，設(shè)置三個重復(fù)孔。以樣品濃度（μg/mL）為橫坐標，以酶活性抑制率為縱坐標，繪制曲線，計算半數(shù)抑制濃度（Half maximal inhibitory concentration，IC50）。

2.2.7 黃藤素衍生物抑制乙酰膽堿酯酶活性的動力學(xué)抑制類型的測定 選擇活性最強的黃藤素衍生物9-O-（4-甲基苯甲酰基）-黃藤素，測定其動力學(xué)抑制類型。配制濃度約為IC50值的待測樣品溶液，按照酶活性測定方法，不同酶濃度（0、2和5 g/mL）時，測定不同ATCI底物濃度（6、9、12、15和18 mmol/L），不同反應(yīng)時間（5、10、15、20和25 min）時的吸光度，以時間（t）-吸收值（A）作線性回歸，可得到AChE的反應(yīng)速率。再以反應(yīng)速率倒數(shù)（1/v）對底物濃度的倒數(shù)（1/[S]）繪制Lineweaver-Burk的曲線[25]，根據(jù)對照組和實驗組兩直線交點位置判斷其動力學(xué)抑制類型。

3 結(jié)果與討論

3.1 黃藤素衍生物結(jié)構(gòu)鑒定結(jié)果

化合物a：黃色粉末狀固體； 收率為89.3%； mp：160.1～160.9； ESI-MS：m/z 443.2 [M+H]+； 1H-NMR（300 MHz， CF3COOD）： δ 9.26（s，1H），8.39（s，1H），8.13（s，1H），8.11（s，1H），8.00（d，J=9.3 Hz，1H），7.91～7.88（m，1H），7.62～7.57（m，1H），7.44～7.39（m，3H），6.79（s，1H），4.69（t，J=5.7 Hz，2H），3.89（s，3H），3.88（s，3H），3.81（s，3H），3.11（t，J=6 Hz，2H）； 13C-NMR（75 MHz，CF3COOD）： δ 170.7（C-1'），155.3（C-3），154.6（C-2），151.8（C-13a），145.8（C-8），142.5（C-10），138.8（C-12a），137.8（C-9），137.2（C-4"），133.7（C-13），133.1（C-4a），132.5（C-2"），132.0（C-6"），130.4（C-1"），128.8（C-3"），125.1（C-5"），123.8（C-12），123.0（C-1a），122.1（C-8a），119.4（C-1），111.8（C-4），114.0（C-11），59.8（C-6），59.2（2-OCH3） 58.8（3-OCH3），58.3（10-OCH3），29.5（C-5）； 以上核磁數(shù)據(jù)可以確定化合物a為9-O-苯甲?；?黃藤素（9-O-benzoyl-fibrauretin），化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖2。

其余11種衍生物的核磁共振測定數(shù)據(jù)以及化學(xué)結(jié)構(gòu)圖見電子版文后支持信息圖S2-S12。

3.2 酶促反應(yīng)條件優(yōu)化結(jié)果

3.2.1 酶濃度對反應(yīng)體系的影響 實驗結(jié)果（圖3）表明，在相同時間內(nèi)，酶促反應(yīng)體系在405 nm處的吸收值均與酶濃度呈正比，隨所用酶量增加，水解產(chǎn)物生成量也隨之增加； 但當酶的加入量超過10 μL時，體系吸收值的增加趨于平穩(wěn)，說明底物的水解產(chǎn)物的量趨于穩(wěn)定，反應(yīng)達到平衡。因此，本實驗選擇酶的加入量為10 μL。

3.2.2 反應(yīng)時間對反應(yīng)體系的影響 實驗結(jié)果（圖4）表明，隨酶促反應(yīng)時間延長，反應(yīng)體系在405 nm處的吸收值隨之增大，但當反應(yīng)時間達到20 min后，吸收值的變化趨于平穩(wěn)。因此，本實驗選擇酶促反應(yīng)時間為20 min。

3.2.3 底物濃度對酶反應(yīng)體系的影響 由圖5可見，在酶使用量一定的情況下，增加底物ATCI的濃度，反應(yīng)體系的吸收值也隨之增加，當?shù)孜餄舛?gt;15 mmol/L時，吸收值趨于平穩(wěn)，因此選擇濃度為15 mmol/L的ATCI進行酶促反應(yīng)。

3.3 黃藤素衍生物對乙酰膽堿酯酶活性的抑制效果

在上述優(yōu)化的酶促反應(yīng)條件下，以待測樣品濃度（μg/mL）為橫坐標，以酶活性抑制率為縱坐標，繪制曲線，計算各待測樣品的IC50值，測定結(jié)果見表1，黃藤素及其衍生物對體外對AChE均具有一定的抑制作用，且存在顯著的量效關(guān)系。

所有的黃藤素衍生物體外對AChE的抑制活性均大于黃藤素，其中化合物9-O-（4-甲基苯甲?；?黃藤素（化合物c）、化合物9-O-（3，5-二甲基苯甲?；?黃藤素（化合物h）和化合物9-O-（4-（氯甲基）苯甲?；?黃藤素（化合物k）對AChE的抑制作用最顯著，IC50分別為3.54、4.71和6.36 g/mL，對AChE的抑制活性均大于陽性對照藥鹽酸多奈哌齊（IC50為8.96 g/mL）。進一步分析表1中數(shù)據(jù)可以發(fā)現(xiàn)，當黃藤素母核中的R基團是供電子基團時，化合物的活性較大，而當R基團是吸電子基團時，化合物的活性較小。雖然化合物b和化合物g連接的是供電子基團，但由于空間位阻較大，阻止了底物與酶活性位點的結(jié)合，從而活性減弱。

3.4 黃藤素衍生物抑制乙酰膽堿酯酶活性的動力學(xué)抑制類型

采用優(yōu)化后的酶活性測定方法，測定濃度約為IC50值的抑制劑對酶活力的影響，其中， 抑制作用最顯著的是9-O-（4-甲基苯酰基）黃藤素。采用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖， 如圖6所示，根據(jù)9-O-（4-甲基苯甲酰基）-黃藤素對AChE的抑制作用得到一組交于第二象限的直線，并且橫、縱軸截距都隨化合物濃度的變化而變化； 計算各組直線的橫、縱軸截距發(fā)現(xiàn)，隨化合物濃度的增大，米氏常數(shù)Km值增大，Vmax值減小，這符合混合型抑制劑反應(yīng)動力學(xué)的特點。據(jù)此可以判定化合物9-O-（4-甲基苯甲?；?黃藤素對AChE的抑制作用為混合型抑制，即此化合物既可與游離酶結(jié)合，也能與酶-底物復(fù)合物結(jié)合。

4 結(jié) 論

采用D101大孔樹脂對黃藤生物堿類成分進行了分離純化，顯著提高了總生物堿的純度和收率。 D101大孔樹脂具有性質(zhì)穩(wěn)定，選擇性好，使用周期長等優(yōu)點。采用高溫熱解法使黃藤素選擇性在9-位脫甲基，再分別與一系列酰氯發(fā)生酯化反應(yīng)，簡單易行，適用于大量生產(chǎn)中。利用Ellman法研究了黃藤素及其衍生物的體外AChE抑制活性研究，篩選出了具有顯著抑制AChE活性的衍生物9-O-（4-甲基苯甲酰基）-黃藤素， 為抗AD新藥的開發(fā)提供了參考。

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