郭溆，李文剛，田碩，曹宏杰，王維婷，劉超，程安瑋，王新坤，孫金月，*

（1.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品研究所/山東省農(nóng)產(chǎn)品精深加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)部新食品資源加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東濟(jì)南250100；2.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)基地服務(wù)中心，山東濟(jì)南250100；3.濟(jì)南市畜產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)測中心，山東濟(jì)南250000）

黃秋葵（Abelmoschus esculentus L.）屬于錦葵科（Malvaceae）秋葵屬（Abelmoschus Medic）一年生草本植物，是一種具有較高營養(yǎng)價值的新型保健蔬菜，抗疲勞效果佳[1]。自引入我國后，在山東、浙江、福建、江西、廣州、北京等多省市種植，選種的品種也較多。黃秋葵的花具有花期短、產(chǎn)量大的特點(diǎn)，因此具有很強(qiáng)的開發(fā)應(yīng)用潛能，現(xiàn)在已經(jīng)有大量的黃秋葵花茶在售，市場前景較好。

自由基與活性氧是機(jī)體在正常有氧呼吸過程中產(chǎn)生的物質(zhì)，若不及時清理，就會破壞人體內(nèi)的動態(tài)平衡，使人體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)，易引發(fā)疾病與衰老[2]。開發(fā)自由基清除劑和抗氧化劑已經(jīng)受到了人們的重視，但化學(xué)合成抗氧化劑因具有潛在的毒、副作用，因此從植物中尋找天然抗氧化劑已經(jīng)成為研究熱點(diǎn)[3]。黃秋葵花中富含黃酮、多酚、多糖、氨基酸等多種物質(zhì)[4]，其中黃酮和多酚類化合物是植物抗氧化活性的主要物質(zhì)基礎(chǔ)[5-6]。目前對黃秋葵抗氧化活性的研究主要集中在果實(shí)中，對黃秋葵花的研究還很少。李孟秋等實(shí)驗(yàn)證明黃秋葵花水提物的抗氧化活性較好[7]。本研究以黃秋葵花乙醇提取物為研究對象，采用萃取法將黃秋葵花乙醇提取物分為乙酸乙酯相和水相兩個部位，對兩個不同極性部位中的總酚和黃酮含量進(jìn)行了測定，并分別對其抗氧化活性進(jìn)行分析，為黃秋葵花的合理開發(fā)利用提供理論依據(jù)，也為天然抗氧化劑和功能性食品開發(fā)提供新的資源。

1 材料與方法

1.1 原料

黃秋葵品種卡里巴：2016年春播種于山東省農(nóng)科院農(nóng)產(chǎn)品研究所章丘龍山試驗(yàn)基地，采集其盛開的花器官作為試驗(yàn)材料，經(jīng)干燥脫水后，粉碎過80目篩，置常溫干燥處備用；采用有機(jī)溶劑萃取法將黃秋葵花乙醇提取物分為乙酸乙酯相和水相部位。

1.2 試劑與儀器

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品、沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品、1，1-二苯基-2-苦基肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）：上海源葉生物科技有限公司；鐵氰化鉀、三氯乙酸、磷酸鹽緩沖液（pH6.6）、三氯化鐵、水楊酸、硫酸亞鐵、雙氧水、乙醇、Tris-HCl-EDTA緩沖液、鄰苯三酚：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

UV-1800型紫外分光光度計(jì)：日本島津公司；FE20K型臺式酸度計(jì)：美國梅特勒-托利多公司；AR423CN型電子天平：美國奧豪斯公司；DK-S24型電熱恒溫水浴鍋：上海精宏公司；Allegra 25R型高效冷凍離心機(jī)：美國貝克曼公司。

1.3 方法

1.3.1 黃秋葵花不同極性溶劑提取物制備

在乙醇體積分?jǐn)?shù)80%、料液比1∶50（g/mL）、溫度60℃條件提取1 h，提取2次，過濾；將濾液低壓濃縮至膏狀物質(zhì)，取部分冷凍干燥，得到醇提物干樣；加入定量的水將上述剩余的膏狀物質(zhì)溶解后，充分搖勻，轉(zhuǎn)入分液漏斗中。用乙酸乙酯進(jìn)行萃取3次，得到乙酸乙酯部位和水提部位的萃取物。將各組萃取物減壓濃縮后，真空冷凍干燥至恒質(zhì)量，密封置于冰箱冷藏備用。

1.3.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

采用Al（NO3）3法測定[8]。準(zhǔn)確稱取經(jīng)120℃烘干至恒質(zhì)量的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品1 g，80%乙醇溶解后定容至100 mL，搖勻，得0.5 mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別精密量取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液 0、1、2、3、4、5、6 mL，各加 80%乙醇溶液至10 mL，再加入0.7 mL 5%亞硝酸鈉溶液，搖勻，避光靜置反應(yīng)6 min后，加入0.7mL的10%硝酸鋁，搖勻，靜置6 min，加入5.0 mL的4%氫氧化鈉，用25%乙醇定容至25 mL后搖勻放置15 min后，于波長510 nm處測定其吸光值。以蘆丁濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)方程Y=1.410 6x+0.007 3，R2=0.997 6。式中：Y為吸光度；x為黃酮質(zhì)量濃度，mg/mL。

1.3.3 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

采用Folin-Ciocalteu方法測定[9]。準(zhǔn)確稱取經(jīng)120℃烘干至恒質(zhì)量的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品0.05 g，80%乙醇溶解定容至50 mL，得到1 mg/mL沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別精密量取沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液 1、2、3、4、5 mL，各加80%乙醇溶液至10 mL，各吸取200 μL后加入1.0 mL蒸餾水、福林酚試劑0.2 mL混勻，靜置3 min后，加入7.5%碳酸鈉溶液0.6 mL后混勻，室溫靜置40 min后，于波長765 nm下測定器吸光值。以沒食子酸濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)方程Y=2.151x-0.032 6，R2=0.992 5。式中：Y為吸光度；x為多酚質(zhì)量濃度，mg/mL。

1.3.4 黃秋葵花不同極性部位中總黃酮、多酚含量測定

準(zhǔn)確稱取黃秋葵花萃取物0.01 g，溶于10 mL 80%乙醇中，配制成1 mg/mL溶液，代入到各標(biāo)準(zhǔn)曲線中，測定萃取物中總黃酮、多酚含量。

1.3.5 還原力的測定

將水相和乙酸乙酯相分別稀釋為0.01、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 mg/mL的濃度，用相同濃度的VC溶液做對照。取各濃度的樣品液1 mL于試管中，分別加0.2 mol/L pH6.6的磷酸鹽緩沖液和1%的K3Fe（CN）6溶液各2.5 mL，混勻后將試管在50℃水浴鍋中反應(yīng)20 min，取出放置室溫，再加入2.5 mL 10%三氯乙酸，混勻后靜置10 min，取出2.5 mL，再加入2.5 mL蒸餾水和0.5 mL 0.1%的 FeCL3，混勻后反應(yīng) 10 min，在700 nm處測定吸光度。

1.3.6 清除DPPH自由基活性的測定

配制濃度為1×10-4mol/L的DPPH溶液。量取配制好的 DPPH 溶液 2、4、6、8、10 mL 于 10 mL 容量瓶之中，用無水乙醇定容后在517 nm波長下測吸光度并記錄，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。將VC、水相和乙酸乙酯相分別配制成濃度為 0.002、0.004、0.006、0.008、0.01、0.012 mg/mL的溶液。各取1.00 mL溶液，分別加入1mL DPPH溶液，室溫避光反應(yīng)15 min，在517 nm波長下下測定吸光度A樣品，用1 mL無水乙醇與1.00 mL樣品溶液調(diào)零，消除樣品本身的顏色對吸光度的影響。向1 mL DPPH溶液中加入1 mL相應(yīng)樣品溶劑，記錄吸光度為A空白，用1 mL無水乙醇與1 mL相應(yīng)樣品溶劑調(diào)零，以扣除溶劑的影響。

清除率計(jì)算公式：DPPH自由基清除率/%=（A空白-A樣品）/A空白×100。

1.3.7 清除羥自由基的測定

將水相和乙酸乙酯相分別稀釋為0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 mg/mL的溶液，相同濃度的VC溶液做對照。取1 mL樣品，分別加入1.8mmol/LFeSO42mL和1.8mmol/L水楊酸-乙醇1.5 mL，再加入0.03%H2O20.1 mL在37℃反應(yīng) 30 min，8 000 r/min離心 10 min，510 nm 測定吸光度Ax。另用1 mL蒸餾水代替樣品溶液做空白對照測定吸光值A(chǔ)0，1 mL的蒸餾水代替雙氧水測定吸光度AX0。

清除率計(jì)算公式為：羥自由基清除率/%=[（A0-（AX-AX0））/A0]×100

1.3.8 清除超氧陰離子自由基的測定

將水相和乙酸乙酯相分別稀釋為0.000 5、0.001 1、0.005.、0.01、0.021、0.04、0.06、0.08、0.1 mg/mL 的溶液，相同濃度的VC溶液做對照。取4.5 mL pH值為8.2的Tris-HCl-EDTA緩沖液加入0.5 mL蒸餾水25℃反應(yīng)10 min，再加入10 μL 45 mmol/L鄰苯三酚溶液，混合均勻在325 nm波長下測定吸光度，每隔1 min測一次，共測4 min，計(jì)算未加入樣品時鄰苯三酚自氧化速率△A0。用樣品替代蒸餾水重復(fù)上述試驗(yàn)，計(jì)算入樣品后鄰苯三酚自氧化速率△A。

清除率計(jì)算公式：超氧陰離子自由基清除率/%=（△A0-△A）△A0×100

2 結(jié)果與分析

2.1 黃秋葵花提取物不同極性部位總黃酮和多酚含量

黃秋葵花水提部位總黃酮含量為（43.14±1.46）mg/g，總酚含量為（66.42±2.63）mg/g。乙酸乙酯提取部位總黃酮含量為（352.78±20.73）mg/g，總酚含量為（405.2±23.02）mg/g。乙酸乙酯部位的總黃酮和多酚含量要多于水提部位。

2.2 還原力的測定結(jié)果

采用鐵離子還原能力（ferric ion reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP）法測定，其作用機(jī)理是抗氧化物質(zhì)在較低pH值條件下可將Fe3+還原為Fe2+，在700 nm處檢測吸光值，值越大還原能力越強(qiáng)即抗氧化能力越強(qiáng)[10]。還原力的測定結(jié)果見圖1。

圖1 黃秋葵花不同極性部位提取物的還原能力Fig.1 Reducing power abilities of different polarity fractions from okra flowers

如圖1所示，黃秋葵花乙酸乙酯相和水相提取物均表現(xiàn)出不同程度的還原能力，具有明顯的量效關(guān)系，水提部位提取物的還原力要大于陽性對照，乙酸乙酯部位提取物的還原力要弱于陽性對照。

2.3 對DPPH自由基清除能力

DPPH自由基清除能力的作用機(jī)理是在抗氧化劑的作用下，紫色的DPPH自由基可被還原為黃色的非自由基DPPH-H，在517 nm處檢測吸光值，一定范圍內(nèi)吸光值變化程度與自由基清除程度呈線性關(guān)系[11]。對DPPH自由基清除能力見圖2。

由圖2可以看出，樣品對DPPH自由基的清除作用隨著濃度的增加而增強(qiáng)，水提部位清除DPPH自由基活性明顯優(yōu)于乙酸乙酯提取部位和VC。

為了便于比較不同物質(zhì)的抗氧化能力，常用IC50值表示抗氧化物質(zhì)對DPPH自由基的清除能力，即對自由基清除率為50%時所對應(yīng)抗氧化劑的質(zhì)量濃度。IC50值越小，表明該物質(zhì)清除自由基的能力越強(qiáng)。黃秋葵花不同極性部位提取物清除DPPH自由基的IC50見表1。

圖2 黃秋葵花不同極性部位提取物清除DPPH能力Fig.2 DPPH scavenging abilities of different polarity fractions from okra flowers

表1 黃秋葵花不同極性部位提取物清除DPPH自由基的IC50Table 1 IC50of DPPH scavenging capacities of different polarity fractions from okra flowers

由表1可知，黃秋葵花水提部位IC50值最小，而乙酸乙酯相值最大，表明它們的DPPH自由基清除能力大小依次為水相＞VC＞乙酸乙酯相。

2.4 對羥自由基的清除能力

清除羥自由基的作用機(jī)理是羥基自由基可與水楊酸分子上的苯環(huán)作用產(chǎn)生2，3-二羥基苯甲酸，在510 nm處可檢測吸光值，若反應(yīng)體系中存在抗氧化劑，吸光值就會降低[12]。對羥自由基的清除能力見圖3。

圖3 黃秋葵花不同極性部位提取物清除羥自由基能力Fig.3 Hydroxyl free radical scavenging abilities of different polarity fractions from okra flowers

由圖3可知，在考察濃度范圍內(nèi)，隨著濃度的逐漸增大，VC、水相和乙酸乙酯相表現(xiàn)出清除羥自由基的能力越來越強(qiáng)，量效關(guān)系非常明顯，尤其是乙酸乙酯相，很小的濃度變化就對清除率產(chǎn)生很大的影響。

黃秋葵花不同極性部位提取物清除羥自由基的IC50見表2。

表2 黃秋葵花不同極性部位提取物清除羥自由基的IC50Table 2 IC50of hydroxyl free radical scavenging capacities of different polarity fractions from okra flowers

由表2可知，乙酸乙酯提取部位清除羥自由基的IC50值最小，為14.04 μg/mL，因此清除羥自由基的能力的大小順序?yàn)椋阂宜嵋阴ヌ崛〔课唬舅嗵崛〔课唬綱C。

2.5 清除超氧陰離子自由基的能力

鄰苯三酚自氧化法清除超氧陰離子自由基的作用機(jī)理是鄰苯三酚在弱堿性條件下會發(fā)生自氧化反應(yīng)會產(chǎn)生有色中間物質(zhì)，若加入抗氧化物質(zhì)會阻斷有色物質(zhì)的積累，限制鄰苯三酚的自氧化，可在325 nm處檢測吸光度值變化情況[13]。由清除超氧陰離子自由基的能力見表4。

圖4 黃秋葵花不同極性部位提取物清除超氧陰離子自由基的能力Fig.4 Superoxide anion scavenging abilities of different polarity fractions from okra flowers

圖4所知，在考察濃度范圍內(nèi)，VC的清除能力最強(qiáng)，乙酸乙酯提取部位的清除能力略優(yōu)于水提部位，且隨著濃度的增加，其清除超氧陰離子自由基的能力增強(qiáng)。

黃秋葵花不同極性部位提取物清除超氧陰離子自由基的IC50見表3。

由表3可知，對照品VC清除50%的超氧陰離子自由基所需濃度為3.65 μg/mL，乙酸乙酯提取部位清除50%的超氧陰離子自由基所需濃度為6.19 μg/mL，水相提取部位清除50%的超氧陰離子自由基所需濃度為15.00 μg/mL。說明乙酸乙酯提取部位清除超氧陰離子自由基的能力強(qiáng)于水相提取部位。

表3 黃秋葵花不同極性部位提取物清除超氧陰離子自由基的IC50Table 3 IC50of superoxide anion scavenging capacities of different polarity fractions from okra flowers

3 結(jié)論與討論

不同抗氧化能力檢測方法有不同的反應(yīng)機(jī)理，本研究為了獲得更加可靠的結(jié)果，分別采用還原能力測定、清除DPPH自由基、清除羥自由基和清除超氧陰離子自由基4種不同方法對黃秋葵花不同極性部位提取物的抗氧化能力進(jìn)行評價。研究發(fā)現(xiàn)黃秋葵花不同極性部位提取物對Fe3+、DPPH自由基、羥自由基和超氧陰離子自由基均具有不同程度的抗氧化能力，且隨著濃度的升高抗氧化能力不斷提高，說明總黃酮和多酚含量與抗氧化活性之間具有良好的量效關(guān)系。由于不同抗氧化評價方法的測定原理不同，不同極性部位抗氧化能力的強(qiáng)弱順序有可能不一致，本研究中水相的還原能力和清除DPPH自由基的能力較強(qiáng)，強(qiáng)于VC，乙酸乙酯相最弱；水相和乙酸乙酯相對羥自由基的清除能力均較強(qiáng)，極低的濃度就具有較高的清除羥自由基活性且強(qiáng)于VC；水相和乙酸乙酯相清除超氧陰離子自由基的能力均弱于VC。

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