周玉，董孝元，余義，劉莎，唐艷榮，陳佳麟，時宏偉，*

（1.武漢天龍黃鶴樓酒業(yè)有限公司，湖北武漢430050；2.健民藥業(yè)集團股份有限公司，湖北武漢430050）

甜味劑是改善食品口味的一種食品添加劑，有著低熱量、高甜度、適合糖尿病病人適用等特點而成為蔗糖替代品在食品中廣泛使用。紐甜是一種新型的非營養(yǎng)高倍甜味劑，甜度為蔗糖的7 000倍～13 000倍，口味純正，甜感清爽，持續(xù)時間長，紐甜的安全性、有效性、穩(wěn)定性、經(jīng)濟性及環(huán)保性等多方面的系統(tǒng)評價得出紐甜為可取代阿斯巴甜且具廣闊應(yīng)用前景的二肽類甜味劑[1-4]。甜味劑盡管應(yīng)用范圍很廣，但是在白酒中是不允許添加的[5]。

白酒是我國的傳統(tǒng)蒸餾酒，按其風(fēng)味特征可分為各種不同的香型，雖然每種香型各有其典型風(fēng)格，但是不論哪種香型的白酒，保持適度的甜味，不僅可以遮蓋其他一些苦澀雜味，而且還能使酒體甘冽、醇厚、綿軟，但是這種甜味是來自于自然發(fā)酵產(chǎn)生的，而非添加甜味劑。風(fēng)味化學(xué)研究表明，味覺是由一定的呈味物質(zhì)引起的，酒之所以具有醇甜之感，是因為酒中含有一定量的甜味物質(zhì)，如高級醇、多元醇、氨基酸等，這些甜味物質(zhì)，對于名優(yōu)白酒，是由其特殊的生產(chǎn)工藝決定的，如濃香型大曲酒的低溫入池、緩慢發(fā)酵，就是為了有利于醇甜物質(zhì)的生成，無需另行添加[6-10]。

人工合成甜味劑可能對人體有致癌、致病的副作用[6]，因而已被許多國家限制使用。尤其在白酒行業(yè)，GB 2760-2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》中規(guī)定白酒中甜味劑不得檢出。所以對于白酒中甜味劑的測定應(yīng)該做到嚴(yán)格把關(guān)，防止行業(yè)和白酒企業(yè)中出現(xiàn)假冒偽劣產(chǎn)品，對消費者產(chǎn)生不利影響。目前，關(guān)于紐甜的檢測方法主要有液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[11-17]、高效液相色譜法[18-19]、離子交換色譜法[20]、毛細(xì)管電泳法[21]、氣相色譜法[22]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紐甜（規(guī)格100 mg，儲存溫度-20℃）：上海安譜實驗科技股份有限公司；甲醇（色譜純）：美國Baker公司；乙酸（分析純）：天津市天力化學(xué)試劑有限公司；蒸餾水（規(guī)格600 mL）：廣州屈臣氏食品飲料有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1260LC-Agilent 6460安捷倫三重串聯(lián)四級桿質(zhì)譜儀、Agilent ZORBAX RX-C18安捷倫色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）：安捷倫科技有限公司；有機濾膜（孔徑0.22 μm）、全玻璃微孔過濾器（規(guī)格1 000 mL）：天津津騰實驗設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

準(zhǔn)確稱取10 mg（精確至0.000 1 mg）紐甜標(biāo)準(zhǔn)品于100 mL容量瓶中，用蒸餾水溶解并定容至100 mL），配制成100 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，置于4℃冰箱中保存。根據(jù)使用需要用蒸餾水逐級稀釋成適當(dāng)濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3.2 樣品前處理方法

用一次性注射器吸取均質(zhì)樣品，經(jīng)0.22 μm的有機濾膜過濾，濾液供液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀測定。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX RX-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：A 為 0.1%乙酸溶液，B 為甲醇；流動相體積比：A ∶B=20 ∶80；流速：0.4 mL/min；柱溫箱：25 ℃；進樣量：2 μL。

1.3.4 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源；掃描方式：正離子掃描；檢測方式：多反應(yīng)檢測模式；干燥氣體溫度：325℃；干燥氣體流速：6 L/min；噴霧電壓：206.8 kPa。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件和質(zhì)譜條件的優(yōu)化

2.1.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

采取直接進樣的方式，將目標(biāo)物標(biāo)準(zhǔn)溶液注入質(zhì)譜，分別進行正離子模式和負(fù)離子模式全掃描檢測，得到一級質(zhì)譜圖和準(zhǔn)分子離子峰，再用惰性氣體氮氣攻擊該母離子，獲得其二級質(zhì)譜圖及相應(yīng)的子離子。結(jié)果表明在正離子模式下響應(yīng)值及靈敏度均高于負(fù)離子模式，因此，本方法選擇正離子電離模式。利用多反應(yīng)監(jiān)測模式（multiple reaction monitoring，MRM））對選定的定性離子和定量離子對碎裂電壓、碰撞能、保留時間、碰撞池加速電壓等質(zhì)譜參數(shù)進行優(yōu)化，使各監(jiān)測離子豐度和信號達到最佳。正離子模式下的質(zhì)譜分析參數(shù)見表1。

表1 紐甜的質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass parameters for analysis of neotame

2.1.2 色譜條件的優(yōu)化

分別以0.1%乙酸-甲醇、0.1%乙酸-乙腈、2mmol/L乙酸銨-甲醇作為流動相進行樣品分離。結(jié)果表明，用0.1%乙酸-甲醇作為流動相時物質(zhì)分離度、峰形、響應(yīng)值以及保留時間的穩(wěn)定性均優(yōu)于0.1%乙酸-乙腈、2 mmol/L乙酸銨-甲醇，故本方法最終選用0.1%乙酸-甲醇為流動相進行洗脫。紐甜在優(yōu)化的色譜和質(zhì)譜條件下的MRM色譜圖，見圖1。

2.2 線性范圍、檢出限和定量限

線性范圍、檢出限和定量限參照Gan Zhiwei，Pro bir Kumar Ojha等[23-24]的方法，將紐甜標(biāo)準(zhǔn)儲備液用蒸餾水稀釋，分別配制成5種濃度為50、100、200、500、1 000 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作液，按1.5節(jié)所述的色譜-質(zhì)譜條件進行測定，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，見圖2。

圖1 紐甜的多反映監(jiān)測色譜圖Fig.1 Chromatogram of neotame in MRM mode

圖2 紐甜的線性相關(guān)系數(shù)Fig.2 Linear correlation coefficients of neotame

結(jié)果顯示，在50 μg/L～1 000 μg/L的濃度范圍內(nèi)，所有分析物的質(zhì)量濃度x（μg/mL）和響應(yīng)值y之間線性相關(guān)系數(shù)為0.999 99；以性噪比為3確定檢出限為50 μg/L，以性噪比為 10 確定定量限為 200 μg/L。

2.3 精密度和回收率

精密度和回收率參照 H.Ozer，Elisabeta-Irina Geana等[25-26]的方法，采用在空白樣品中添加標(biāo)準(zhǔn)溶液的方法，選擇常見的濃香型和兼香型兩個不同香型白酒酒樣及乙醇進行的紐甜檢測試驗，成品白酒1、2和乙醇3的紐甜含量均為未檢出，并向兩個樣品中分別添加200、500 μg/L二個濃度水平的紐甜進行回收率實驗，重復(fù)測定2次。共6組平行，12次檢測，結(jié)果表明，在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的相對偏差小于2%，且回收率均在85%～105%率范圍內(nèi)，所以該方法的精密度和回收率均符合相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)要求。

2.4 與國標(biāo)法比對

選擇常見的4種不同類型白酒酒樣添加紐甜，將本方法與國標(biāo)GB 5009.247-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中紐甜的測定》方法進行加標(biāo)測回收率結(jié)果比對，比對結(jié)果見表2。

表2 方法結(jié)果比對Table 2 Comparison of methods

將本方法和國標(biāo)方法的數(shù)據(jù)進行比較，兩組數(shù)據(jù)的絕對偏差小于1，相對偏差小于5%。國標(biāo)方法中紐甜的定量限是0.2 mg/L；本方法的檢出限是0.05 mg/L，定量限是0.2 mg/L。結(jié)果表明，本方法可以用于白酒中紐甜的檢測。相比液相色譜系統(tǒng)，液相質(zhì)譜聯(lián)用儀具有更高的分離度和靈敏度以及更短的檢測時間。

3 結(jié)論

本研究利用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀分析了白酒中甜味劑紐甜化合物的分子信息，利用多反應(yīng)監(jiān)測模式的液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀技術(shù)，建立了一個快速、穩(wěn)定、靈敏的可定性定量紐甜的方法。該方法可在15 min內(nèi)完成，其檢測范圍內(nèi)線性良好（r=0.999 99）；檢出限0.05 mg/L；定量限 0.2 mg/L；精密度＜2%；回收率＞85%；且與國標(biāo)中的檢測方法相比檢出限更低，能更加有效的監(jiān)控白酒中紐甜的含量，綜上所述該方法可以對紐甜進行實際的定性定量檢測。

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