潘顯虎，虞鴻玉，吳淑恒，劉梁

（武漢輕工大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，湖北武漢430023）

米糠作為稻米加工的副產(chǎn)物，是一類具有廣泛開(kāi)發(fā)潛力的高附加值資源，近些年來(lái)受到國(guó)內(nèi)外研究學(xué)者的廣泛關(guān)注[1]。從米糠中提取出來(lái)的多糖，由于其結(jié)構(gòu)的特殊性，使其具有多種生物活性[2]。如增強(qiáng)免疫、抗腫瘤、抗病毒、抗氧化等活性，可用于藥品、功能型食品的開(kāi)發(fā)[3]。但由于米糠多糖的分子量較大，水溶性較差等導(dǎo)致我國(guó)對(duì)其功能的研究和開(kāi)發(fā)相對(duì)不足。本研究通過(guò)對(duì)米糠多糖進(jìn)行熒光標(biāo)記，得到米糠多糖-羅丹明 B（Rice Bran Polysaccharide-Rhodamine B，RBPRh B）和米糠多糖-異硫氰酸熒光素（Rice Bran Polysaccharide-Fluorescein isothiocyanate，RBP-FITC）兩種熒光標(biāo)記物，解決米糠多糖本身缺少易于檢測(cè)發(fā)光基團(tuán)的難題，為進(jìn)一步研究多糖的生物學(xué)活性提供一種新型可靠的輔助手段。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Lambda 25型紫外分光光度計(jì)：PerkinElmer公司；NICOLET iS10紅外分光光度計(jì)：美國(guó)賽默飛世爾公司；970CRT熒光分光分光光度計(jì)：上海天美科學(xué)儀器有限公司；DF-1CD磁力攪拌油浴鍋：金壇市億能實(shí)驗(yàn)儀器廠。

米糠多糖：制藥工程實(shí)驗(yàn)室自制并純化；95%乙醇、無(wú)水乙醇、乙醚、濃硫酸、苯酚、葡萄糖、酒石酸鉀鈉、碳酸氫鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氰基硼氫化鈉、溴化鉀（均為分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；羅丹明 B（Rhodamine B，Rh B）：天津市北聯(lián)細(xì)化學(xué)品開(kāi)發(fā)有限公司；酪胺（2-（4-Hydroxyphenyl）ethylamine，Tyr）：上海笛柏化學(xué)品技術(shù)有限公司；異硫氰酸熒光素（Fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）：山東西亞化學(xué)工業(yè)有限公司；DMEM/HIGH GLUCOSE（DMEM培養(yǎng)基）、磷酸鹽緩沖液（Phosphate Buffered Saline，PBS）：HyClone公司；胰蛋白酶-EDTA溶液（胰酶）、Penicillin-Streptomycin（雙抗）：百替生物公司；人宮頸癌細(xì)胞Hela：華中師范大學(xué)農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng)。

1.2 方法

1.2.1 米糠多糖總糖含量測(cè)定

米糠多糖中總糖含量采用硫酸-苯酚法測(cè)定[4-5]。稱取葡萄糖0.04 g加蒸餾水定容于500 mL容量瓶中，得到0.08 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶 液 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1 mL 于 試管中，補(bǔ)水至2 mL，依次加入1 mL6%苯酚溶液和5 mL濃硫酸，反應(yīng)5 min后置于沸水浴中反應(yīng)20 min，取出待冷至室溫時(shí)用紫外分光光度計(jì)測(cè)定490 nm處的吸光度值A(chǔ)1，以不加葡萄糖溶液的試管為空白組，測(cè)得吸光度值A(chǔ)0。以葡萄糖溶液的濃度梯度為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的吸光度值A(chǔ)1-A0為縱坐標(biāo)繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。取一定濃度的米糠多糖溶液代替葡萄糖溶液測(cè)得吸光度值A(chǔ)，計(jì)算出米糠多糖中總糖的含量。

1.2.2 RBP-Rh B和RBP-FITC的制備

1.2.2.1 RBP-Rh B復(fù)合物的制備

RBP-Rh B復(fù)合物的制備采用張中北等[6]的方法，精確稱取米糠多糖與羅丹明B各20 mg，溶于10 mL蒸餾水，在避光的條件下攪拌反應(yīng)24 h，將反應(yīng)后的樣品避光流水透析7 d，在透析后的溶液中加入3倍量體積的無(wú)水乙醇，溶液中出現(xiàn)暗紅色沉淀物質(zhì)，靜置使沉淀完全。沉淀分別用95%乙醇、無(wú)水乙醇、各洗滌一次，干燥后得到RBP-Rh B復(fù)合物。

1.2.2.2 RBP-FITC的制備

米糠多糖的胺化[7-8]，稱取米糠多糖0.5 g溶于15 mL的0.2mol/L的PBS（pH8.0），分別加入400 mg酪胺與150 mg氰基硼氫化鈉，在37℃的條件下攪拌反應(yīng)96 h，將反應(yīng)后溶液離心取其上清液，將離心后的溶液用自來(lái)水透析2 d，在透析后的溶液中加入3倍量體積的無(wú)水乙醇，溶液中出現(xiàn)紅棕色沉淀物質(zhì)，靜置使沉淀完全。沉淀分別用95%乙醇、無(wú)水乙醇、各洗滌1次，干燥后得到米糠多糖-酪胺（RBP-Tyr）復(fù)合物。

RBP-FITC的制備[9-10]，將RBP-Tyr加水溶解，用0.5 mol/L的NaHCO3溶液調(diào)pH至8.5，加入FITC在室溫條件下避光攪拌反應(yīng)12 h，將反應(yīng)后的樣品避光流水透析7 d，在透析后的溶液中加入3倍量體積的無(wú)水乙醇，溶液中出現(xiàn)黃綠色沉淀物質(zhì)，靜置使沉淀完全。沉淀分別用95%乙醇、無(wú)水乙醇、各洗滌1次，干燥后得到RBP-FITC復(fù)合物。

1.2.3 RBP-Rh B和RBP-FITC的表征

1.2.3.1 理化性質(zhì)分析

取少量的RBP-Rh B和RBP-FITC固體，加蒸餾水溶解，分別取一滴溶液于載玻片上，室溫避光干燥，將干燥后的樣品置于熒光顯微鏡下觀察[7]。

1.2.3.2 紅外光譜分析

取米糠多糖、羅丹明B、FITC、RBP-Rh B和RBPFITC粉末與溴化鉀壓成薄片[11]，用紅外分光光度計(jì)掃描測(cè)定。

1.2.3.3 紫外光譜分析

紫外光譜分析確定反應(yīng)成功[12]。稱取米糠多糖、羅丹明B、FITC、RBP-Rh B和RBP-FITC粉末1 mg溶于蒸餾水并定容至10 mL，得到0.1 mg/mL的樣品溶液。以水為空白對(duì)照，用紫外分光光度計(jì)對(duì)各樣品進(jìn)行200nm～700 nm范圍掃描。

1.2.3.4 熒光光譜分析

稱取羅丹明B、FITC、RBP-Rh B和RBP-FITC粉末1 mg溶于蒸餾水并定容至10 mL，得到0.1 mg/mL的樣品溶液。選擇羅丹明B和FITC紫外光譜的最大吸收峰處作為熒光掃描的激發(fā)波長(zhǎng)，用熒光分光光度計(jì)對(duì)各樣品進(jìn)行掃描。其中羅丹明B和RBP-RhB的激發(fā)波長(zhǎng)（Ex）562 nm，發(fā)射波長(zhǎng)（Em）掃描范圍 350 nm～700 nm；FITC和RBP-FITC的激發(fā)波長(zhǎng)495 nm，發(fā)射波長(zhǎng)掃描范圍450 nm～700 nm[13]。

1.2.4 熒光取代度的測(cè)定

1.2.4.1 紫外分光光度法

參照文獻(xiàn)[12]的方法，取配制好的0.01 mg/mL的RhB 溶液 20、40、80、120、160、200 μL 于試管中，加水至5 mL，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定554 nm處的吸光度值A(chǔ)1。以RhB的濃度為橫坐標(biāo)，A1為縱坐標(biāo)得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。取一定濃度的RBP-Rh B溶液測(cè)定其吸光度A，計(jì)算出RBP-Rh B的熒光取代度。

取配制好的0.01 mg/mL的FITC溶液10、20、30、40、50 μL于試管中，加水至5 mL，用紫外光分光光度計(jì)測(cè)定495 nm處的吸光度值A(chǔ)1。以FITC的濃度為橫坐標(biāo)，A1為縱坐標(biāo)得到標(biāo)準(zhǔn)曲線[14]。取一定濃度的RBPFITC溶液測(cè)定其吸光度值A(chǔ)，計(jì)算出RBP-FITC的熒光取代度。

1.2.4.2 熒光分光光度法

稱取1 mg的羅丹明B，加水溶解至濃度為0.01 mg/mL的儲(chǔ)液，分取羅丹明B溶液0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL于試管中，補(bǔ)水至5 mL，用熒光分光光度計(jì)在Ex=562 nm，Em=610 nm條件下測(cè)定其熒光強(qiáng)度F1。以RhB的濃度為橫坐標(biāo)，F(xiàn)1為縱坐標(biāo)得到標(biāo)準(zhǔn)曲線[9，15]。取一定濃度的RBP-Rh B溶液測(cè)定其熒光強(qiáng)度F，計(jì)算出RBP-Rh B的熒光取代度。

稱取1.0mg的FITC，加水溶解至濃度為0.01mg/mL的儲(chǔ)液，分取 FITC 溶液 5、10、15、20、25 μL 于試管中，補(bǔ)水至5 mL，用熒光分光光度計(jì)在Ex=495 nm，Em=550 nm條件下測(cè)定其熒光強(qiáng)度F1。以FITC的濃度為橫坐標(biāo)，F(xiàn)1為縱坐標(biāo)得到標(biāo)準(zhǔn)曲線[16-17]。取一定濃度的RBP-FITC溶液測(cè)定其熒光強(qiáng)度F，計(jì)算出RBP-FITC的熒光取代度。

1.2.5 細(xì)胞攝取

1.2.5.1 細(xì)胞培養(yǎng)

在試驗(yàn)期間將Hela細(xì)胞培養(yǎng)在含有10%FBS、1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基中，放入37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞達(dá)到80%～90%匯合度時(shí)，吸去培養(yǎng)基，用PBS潤(rùn)洗后加入胰酶消化，將消化下來(lái)的細(xì)胞進(jìn)行傳代處理[18]。待細(xì)胞傳至3代～4代后可以進(jìn)行細(xì)胞試驗(yàn)。

1.2.5.2 細(xì)胞毒性試驗(yàn)

取匯合度達(dá)到80%～90%的細(xì)胞，用胰酶消化分散后，均勻的鋪于96孔板中，使得各孔細(xì)胞數(shù)約為1.5×104個(gè)，置于37℃，5%CO2的條件下培養(yǎng)24 h。用DMEM培養(yǎng)基將米糠多糖、RBP-Rh B和RBP-FITC溶解成濃度為 0、0.1、0.2、0.3、0.4 和 0.5 mg/mL 溶液，將96孔板中的細(xì)胞在此濃度梯度下處理24 h，向每孔中加入10 μL濃度為5 mg/mL的MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，吸除培養(yǎng)液，用DMSO溶解生成的晶體，并用酶標(biāo)儀測(cè)定570 nm處的吸光值，以未加樣品處理的孔作為空白對(duì)照組，計(jì)算細(xì)胞存活力[18]。

1.2.5.3 細(xì)胞攝取試驗(yàn)

對(duì)文獻(xiàn)的方法進(jìn)行改進(jìn)[19-21]，分別稱取RBP-Rh B和RBP-FITC粉末10 mg，加水溶解定容至10 mL，得到1 mg/mL的儲(chǔ)液備用。待細(xì)胞達(dá)到80%～90%匯合度時(shí)，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行胰酶消化處理，將胰酶消化處理的細(xì)胞均勻鋪到24孔培養(yǎng)板中，保證每孔細(xì)胞數(shù)為105個(gè)，在37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)24 h，吸去培養(yǎng)基，用PBS潤(rùn)洗2遍后，每孔加入400 μL DMEM培養(yǎng)基，向各孔中加入100 μL RBP-Rh B溶液，并與37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)，以不加樣品孔作為空白對(duì)照。分別在培養(yǎng) 1、2、3、4、5 h 后，取其中 3 個(gè)孔用 PBS 洗去含有樣品的培養(yǎng)基，用胰酶消化后轉(zhuǎn)入黑色96孔板中，用酶標(biāo)儀檢測(cè)Ex=562.0 nm，Em=610.0 nm處的熒光強(qiáng)度F，待熒光強(qiáng)度達(dá)到穩(wěn)定后，將其余的孔置于熒光顯微鏡下拍照[22]。RBP-FITC的檢測(cè)方法同RBP-Rh B，其Ex=495 nm，Em=550 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 米糠多糖的總糖含量測(cè)定

葡萄糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制見(jiàn)圖1。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of glucose

標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為Y=6.365 88X+0.104 67（R2=0.999 7），米糠多糖中的總糖含量為42%。

2.2 RBP-Rh B和RBP-FITC的表征

2.2.1 理化性質(zhì)分析

RBP-Rh B和RBP-FITC的熒光顯微鏡圖片如圖2所示。

圖2 熒光圖片F(xiàn)ig.2 Fluorescent picture

圖A1和A2分別是RBP-Rh B在自然光和激發(fā)光下的圖片，RBP-Rh B在綠色激發(fā)光下發(fā)射出紅色熒光；圖B1和B2分別是RBP-FITC在自然光和激發(fā)光下的圖片，RBP-FITC在藍(lán)色激發(fā)光下發(fā)射出綠色熒光。證明米糠多糖成功地標(biāo)記上這兩種熒光物質(zhì)。

2.2.2 紅外結(jié)果分析

紅外光譜圖見(jiàn)圖3。

圖3 樣品的紅外光譜圖Fig.3 IR spectrum of samples

由圖3可知，RBP-Rh B的紅外光譜圖中在1 621 cm-1處出現(xiàn)明顯的特征吸收峰，該處是由米糠多糖還原性末端與羅丹明B活潑的氨基發(fā)生反應(yīng)形成的C-N鍵伸縮振動(dòng)峰[6，23]，說(shuō)明米糠多糖成功修飾上熒光物質(zhì)羅丹明B；RBP-FITC的紅外光譜圖中在1 644 cm-1和1 210 cm-1處出現(xiàn)特征吸收峰，1 644 cm-1是米糠多糖還原性末端的半縮醛基通過(guò)還原胺化反應(yīng)與酪胺的氨基共價(jià)偶聯(lián)形成的C-N鍵變形振動(dòng)峰，1 210 cm-1是RBP-Tyr中酪胺引入的仲氨基通過(guò)與FITC進(jìn)行親核反應(yīng)生成的C-N鍵伸縮振動(dòng)峰[24-25]，這兩處的特征峰說(shuō)明了米糠多糖成功修飾上熒光物質(zhì)FITC。

2.2.3 紫外結(jié)果分析

紫外吸收光譜見(jiàn)圖4。

圖4 紫外吸收光譜Fig.4 UV absorption spectrum

由圖4可以看出，羅丹明B和FITC兩種熒光染料分別在553 nm和490 nm處有吸收峰，米糠多糖在400 nm～700 nm范圍內(nèi)無(wú)特征吸收峰，而RBP-Rh B和RBP-FITC分別在553 nm和490 nm處出現(xiàn)吸收峰，說(shuō)明米糠多糖上均成功的修飾了羅丹明B和FITC這兩種熒光染料。

2.2.4 熒光結(jié)果分析

熒光光譜圖見(jiàn)圖5。

由圖5可以看出，羅丹明B和FITC兩種熒光染料的最大發(fā)射波長(zhǎng)分別在590 nm和550 nm處，而RBP-Rh B和RBP-FITC分別在590 nm和550 nm左右出現(xiàn)熒光吸收，說(shuō)明米糠多糖成功修飾上羅丹明B和FITC這兩種熒光染料。

圖5 熒光圖譜Fig.5 Fluorescence absorption spectrum

2.3 熒光取代度的測(cè)定

2.3.1 紫外法

選擇554nm為羅丹明B含量測(cè)定的波長(zhǎng)，羅丹明B的濃度在0～0.04 μg/mL范圍內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖6（A），其回歸方程為Y=0.5847X+0.0001（R2=0.9962），測(cè)得RBP-Rh B中的羅丹明B的含量為0.7%；選擇495 nm為FITC含量測(cè)定的波長(zhǎng)，F(xiàn)ITC的濃度在0～0.1 μg/mL范圍內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖6（B），其回歸方程為Y=0.46X+0.045（R2=0.994 4），測(cè)得 RBP-FITC 中 FITC 的含量為0.2%。

圖6 紫外標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.6 UV standard curve

2.3.2 熒光法

選擇Ex=562 nm，Em=610 nm為羅丹明B熒光測(cè)定的波長(zhǎng)，羅丹明B的濃度在0～1 μg/mL范圍內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖7（A），其回歸方程為Y=111.6X+10.215（R2=0.994 8），測(cè)得RBP-Rh B的熒光取代度為1%；選擇Ex=495 nm，Em=550 nm為FITC熒光測(cè)定的波長(zhǎng)，F(xiàn)ITC的濃度在0～0.05 μg/mL范圍內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖7（B），其回歸方程為 Y=3 129.7X+13.121（R2=0.998 1），測(cè)得RBP-FITC的熒光取代度為0.3%。

圖7 熒光標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.7 Fluorescence standard curve

2.4 細(xì)胞毒性結(jié)果分析

樣品的細(xì)胞毒性結(jié)果如圖8所示。

圖8 樣品的細(xì)胞毒性評(píng)價(jià)Fig.8 Cytotoxicity evaluation of samples

在0～0.5 mg/mL的濃度范圍內(nèi)，均有80%以上的細(xì)胞活力，說(shuō)明米糠多糖、RBP-Rh B和RBP-FITC均具有很低的細(xì)胞毒性。與米糠多糖相比，熒光標(biāo)記物標(biāo)記后存在輕微的細(xì)胞毒性，幾乎不會(huì)對(duì)細(xì)胞試驗(yàn)結(jié)果造成影響。

2.5 細(xì)胞攝取結(jié)果

Hela細(xì)胞對(duì)RBP-Rh B和RBP-FITC的攝取情況見(jiàn)圖9。

圖9 Hela細(xì)胞對(duì)RBP-Rh B和RBP-FITC的攝取情況Fig.9 Hela cells uptake of RBP-Rh B and RBP-FITC

圖9的熒光圖片可以看出，羅丹明B標(biāo)記的米糠多糖在綠光激發(fā)下使細(xì)胞發(fā)射出紅光，F(xiàn)ITC標(biāo)記的米糠多糖在藍(lán)光激發(fā)下使細(xì)胞發(fā)射出綠光，表明了兩種熒光物質(zhì)標(biāo)記的米糠多糖均可以被Hela細(xì)胞所攝取。RBP-Rh B和RBP-FITC的細(xì)胞攝取結(jié)果見(jiàn)圖10。

圖10的熒光值則表明了隨時(shí)間的延長(zhǎng)，Hela細(xì)胞對(duì)這兩種熒光物質(zhì)標(biāo)記的多糖攝取量也逐漸增大，最終在4 h左右達(dá)到攝取的最大值。

3 結(jié)論

圖10 RBP-Rh B和RBP-FITC的細(xì)胞攝取結(jié)果Fig.10 Cell uptake of RBP-Rh B and RBP-FITC

用熒光物質(zhì)標(biāo)記米糠多糖的制備工藝簡(jiǎn)單，紫外分光光度法測(cè)得羅丹明B和FITC對(duì)于米糠多糖的標(biāo)記率分別為0.7%和0.2%，熒光分光光度法測(cè)得羅丹明B和FITC對(duì)于米糠多糖的標(biāo)記率分別為1.0%和0.3%。雖然這兩種熒光物質(zhì)對(duì)米糠多糖的標(biāo)記率不高，但它們?cè)跇O低的濃度下均含有很高的熒光值，所以用這兩種熒光物質(zhì)進(jìn)行標(biāo)記可以很容易的觀察到細(xì)胞攝取情況。本試驗(yàn)結(jié)果表明了米糠多糖可以很好的被Hela細(xì)胞所攝取且攝取時(shí)間較短，并且熒光標(biāo)記物修飾后幾乎沒(méi)有細(xì)胞毒性，為將來(lái)進(jìn)一步的開(kāi)發(fā)和研究米糠多糖及其米糠多糖修飾物提供理論依據(jù)。

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