夏珍珍，陳 檉，李冰韶，王永潔，謝遠平，林紅梅，吳 清

（北京中醫(yī)藥大學中藥學院，北京 102488）

復方車前水浸膏組方為車前子、牽牛子、大腹皮等多味中藥。臨床上將其涂抹于腹部治療惡性腫瘤引起的癌性腹水，臨床使用多年，療效顯著且年需求量逐漸增加。但因浸膏流動性過大，黏著力差，使用不便，患者順應性較差，阻礙了該方的進一步推廣。凝膠貼膏作為一種新型的經(jīng)皮給藥劑型，因載藥量大，含水量高，刺激性，敏性小，生物相容性好，使用方便等優(yōu)勢[1-2]，近年來成為外用制劑研發(fā)的熱點[3-6]。因此，本研究選擇凝膠貼膏為復方車前水浸膏的新劑型，在復方車前浸膏基礎上,對復方車前凝膠貼膏處方進行優(yōu)化,為進一步開發(fā)復方車前凝膠貼膏提供基礎。

1 材料

LC-20AT型高效液相色譜儀、SPD-20A檢測器(日本島津國際貿(mào)易有限公司)，JY1002電子天平（上海舜宇恒科學儀器有限公司），BSA-224S電子天平（賽多利斯科學儀器北京有限公司），5DM-03-R萬能混合攪拌機（株式會社三英制作所），涂布機（自制）；CZY-G型初黏力測試儀（濟南蘭光機電技術有限公司），CZY-S型持黏力測試儀（濟南蘭光機電技術有限公司），BLD-200N型電子剝離試驗機（濟南蘭光機電技術有限公司），TK-24BL型藥物透皮擴散試驗儀（上海鍇凱科技貿(mào)易有限公司）。

NP700[亞什蘭（中國）投資有限公司]，甘羥鋁（北京鳳禮精求商貿(mào)有限公司），L（+）-酒石酸（國藥集團化學試劑有限公司），甘油（北京化工廠，分析純），PVPK90（天津市福晨化學試劑廠），京尼平苷酸（上海源葉，批號P25F8F30154），圓形透析膜片(截留分子量 3.5KD，批號 SP132488，生工生物工程上海股份有限公司)，甲醇（Sigma，色譜純），水（娃哈哈），昆明小鼠[SPF級，斯貝福(北京)生物技術有限公司,許可證號 SCXK（京）2016-0002]，Mouse VEGF Elisa Kit（Proteintech）。

2 方法與結(jié)果

2.1 凝膠貼膏的制備 通過前期實驗[7-8]，確定凝膠貼膏的制備工藝。取一定量NP700、甘羥鋁均勻分散于適量的甘油中，作為A相；將一定量的酒石酸溶解于蒸餾水中，再加入PVPK90，放置過夜，使PVPK90充分溶脹，作為B相；將B相和一定量的浸膏加入A相中充分攪拌，涂布后裝入鋁箔袋中，放置成型，即得。

2.2 凝膠貼膏的評價指標

2.2.1 初黏力測定 參照中國藥典（2015）[9]。測量值以小球質(zhì)量計算，單位:質(zhì)量（g），以測得最大值為35分，其余的與之相比計算得分。

2.2.2 持黏力測定 參照中國藥典（2015）[9]。測量值以剝離力計算，單位:牛頓（N），以測得最大值為35分，其余的與之相比計算得分。

2.2.3 剝離強度測定 參照中國藥典（2015）[9]。測量值以掉落時間計算，單位:s，以測得最小值為30分，其余的與之相比計算得分。

2.2.4 綜合感官評分[7-8]

2.3 Plackett-Burman設計篩選顯著影響因子 本實驗篩選出對凝膠膏成型影響較大的因素，為Box-Behnken設計提供指導。

2.3.1 實驗因素及水平設計 根據(jù)預實驗，將NP700、PVPK90、甘油、甘羥鋁、酒石酸 5 個因素作為Plackett-Burman設計的因素，因素水平設計表，見表1。

表1 Plackett-Burman水平設計 g

2.3.2 Plackett-Burman實驗結(jié)果及分析 根據(jù)Plackett-Burman 設計表進行實驗，按“2.2.1/2.2.2/2.2.3”項對凝膠膏 3個黏性指標進行考察，綜合得分。實驗設計及響應值，見表2。

表2 Plackett-Burman實驗設計及結(jié)果

以 Design-Expert8.0.6 軟件設計實驗方案，實驗結(jié)果及方差分析，見表3。

表3 Plackett-Burman方差分析表

從表3中可以看出，該模型回歸顯著，模型r2＝0.981 3，說明回歸擬合程度較好，甘油、PVPK90、NP700具有顯著性，因此選擇NP700、PVPK90、甘油3個因素作進一步響應面分析，以確定這些因素的最優(yōu)水平。

2.4 單因素實驗考察顯著因子最佳用量范圍 本節(jié)實驗以綜合感官評分為指標，在Plackett-Burman設計結(jié)果基礎上考察顯著因子NP700、PVPK90、甘油的最佳用量范圍。按2.1項下制備凝膠貼膏，按2.2.4項下評分標準進行評價，最終得到PVPK90 4～6 g，NP700 5～8 g，甘油 30～35 g 為 Box-Behnken實驗設計因素水平。

2.5 Box-Behnken設計篩選最優(yōu)處方

2.5.1 Box-Behnken設計實驗 根據(jù)Plackett-Burman實驗及單因素實驗結(jié)果結(jié)果，利用Design-Expert8.0.6軟件，將對凝膠膏成型影響較大的NP700、PVPK90、甘油3個因素及水平設計[10]，見表4。

表4 Box-Behnken設計實驗因素水平g

2.5.2 Box-Behnken實驗結(jié)果 按照Box-Behnken設計表進行實驗，以初黏力、持黏力、180°剝離強度為評價指標，各組實驗綜合評分結(jié)果，見表5。

2.5.3 模型的建立及顯著性檢驗 以Design-Expert8.0.6軟件設計處理結(jié)果及方差分析，見表6。

根據(jù)實驗結(jié)果，應用Design-Expert8.0.6軟件，以評價指標分別對各因素進行二項式擬合，表5所示為不同配方響應值的相應變化。表6為本實驗的方差分析結(jié)果，經(jīng)F檢驗顯示總模型方程顯著（P＝0.000 2），r2＝0.968 3，表明該回歸模型的擬合情況良好，回歸方程的代表性較好，能準確地預測實際情況。由表 6 可知 A、B、C、AB、AC、A2、B2、C2 有顯著性差異，利用Design-Expert 8.0.6軟件進行多元回歸擬合，得二次多項回歸模型:Y＝83.20+13.68A+10.01B+8.21C+15.04AB-10.24AC+5.96BC-5.92A2-32.84B2-12.72C2。式中 Y 為響應值，A，B，C 分別為NP-700、PVAK90、甘油。該方程相關系 r2＝0.968 3。由表 6 可知，整體模型達到顯著水平（P＝0.000 2），表示該二次方程模型比較顯著，失擬值＝0.286 8＞0.05，沒有顯著性，變異系數(shù)（CV）為 11.61，其值較小，說明實驗穩(wěn)定可信。由表6可知，模型中A、B、C、AB、AC、B2、C2 項具有顯著性，表明各個自變量與因變量之間不是簡單的線性關系，具有一定的交互作用。在各影響因素中，因素A的影響最大，其次是因素B。

表5 Box-Behnken實驗設計及結(jié)果

表6 Box-Behnken設計方差分析

由圖1可見中響應面的3D曲面圖和等高線圖，直觀地反映各因素的交互作用對響應值的影響以及最優(yōu)條件下各因素的取值。圖1中A、B，A、C響應面曲線較陡，說明A與B、A與C之間具有顯著性交互作用，這和方差分析的結(jié)果相一致。

2.5.4 最優(yōu)處方驗證實驗 根據(jù)Box-Behnken實驗所得的結(jié)果和二次多項回歸方程，利用Design Expert 8.0.6 軟件優(yōu)選得到，在 NP 700 8 g、PVPK90 5.38 g、甘油 32.5 g、酒石酸 0.5 g、甘羥鋁 0.5 g 的條件下，其最大評價總分為95.39。按照最佳處方條件制備了3批樣品進行驗證，見表7。結(jié)果顯示評價總分與模擬值基本接近，表明預測值和真實值之間有很好的擬合性，進一步驗證了模型的可靠性。

2.6 京尼平苷酸高效液相色譜（HPLC）方法的建立

2.6.1色譜條件色譜柱:InertsilODS-3C18（4.6mm×250 mm，5 μm）；流動相為甲醇:0.5%醋酸＝8∶92；流速:1.0 mL/min；檢測波長:210 nm；柱溫:30℃；進樣量:10 μL；理論板數(shù)按京尼平苷酸峰計算應不低于3 000。

2.6.2 對照品溶液的制備 取京尼平苷酸對照品適量，精密稱定，置棕色量瓶中，加60%甲醇制成每1 mL含0.406 mg的對照品溶液，過濾，即得。

2.6.3 供試品溶液的制備 精密稱取復方車前凝膠貼膏1.0 g，精密加入40 mL甲醇，稱質(zhì)量，加熱回流提取60 min，冷卻到室溫，再稱質(zhì)量，用甲醇補足失重，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.6.4 陰性樣品溶液的制備 按2.6.3項下制備車前子陰性凝膠貼膏溶液，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.6.5 專屬性、精密度、穩(wěn)定性考察結(jié)果均良好

2.6.6 線性關系考察 按2.6.1項下色譜條件測定。以京尼平苷酸質(zhì)量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標，得回歸方程 Y＝993 996X-12 878（r2＝0.999 9），表明京尼平苷酸在 2.032～203.2 μg/mL 內(nèi)與峰面積呈良好線性范圍。

圖1 Box-Behnken設計3D曲面圖及等高線圖

表7 最佳處方3批驗證實驗結(jié)果

2.7 凝膠貼膏中京尼平苷酸的體外釋放研究 采用Franz擴散池法[11-12]，上室為擴散室，下室為接受室，有效擴散面積 3.14 cm2。凝膠膏貼于 3.5KD 圓形透析膜片上，再將透析膜片固定在兩室之間。接收室注滿磷酸鹽緩沖液（PBS），排出氣泡，使液面完全與透析膜片接觸。磁攪拌轉(zhuǎn)速設定為300 r/min，控制溫度（32±0.1）℃，計時。于設定的時間點 2，4，6，8，10，12，24 h 移取接收液 1mL，同時補加同樣體積的新鮮接收液，過濾，測定接收液中京尼平苷酸的含量，計算Qn%。

式中Qn%為第n個時間點的累積釋放率（%），V為接收室中接收液的體積（mL），Cn為第n個取樣點測得的藥物質(zhì)量濃度（mg/mL），1代表取樣體積1 mL，W為凝膠膏中所含藥物質(zhì)量（mg）。京尼平苷酸 24 h 釋放率為（81.23±1.52）%。以 Qn%對釋放時間t作圖，繪制累積釋放曲線，見圖2。

對釋放數(shù)據(jù)以Origin Pro8.0軟件進行模型擬合，結(jié)果見表8。

由表8可知，復方車前凝膠貼膏中京尼平苷酸體外釋放零級擬合和一級擬合的相關系數(shù)分別0.903 82、0.991 38，說明藥物的釋放過程符合一級動力學方程，即與濃度有關。

2.8 藥效實驗 健康KM小鼠（SPF級），適應性飼養(yǎng)3 d后，隨機分為模型組、空白組、空白貼膏組、復方車前凝膠貼膏組、臨床浸膏組，每組8只。各組小鼠稱質(zhì)量后，腹部剃毛，面積為2 cm×3 cm。除空白組外，其余各組小鼠腹腔注射接種小鼠H22肝癌細胞，細胞接種密度[17-18]為 1×107個/mL，0.2 mL/只。造模第2天起，除模型組外，各組開始給藥，臨床浸膏組涂抹臨床浸膏，涂抹于小鼠腹部，并裹上紗布，以醫(yī)用膠帶固定。復方車前凝膠膏剪為2 cm×3 cm大小，貼于小鼠腹部，以醫(yī)用膠帶固定，空白貼膏組小鼠腹部貼空白凝膠膏，空白組以蒸餾水涂抹，給藥8 h后拆除紗布及膠帶，浸膏組以蒸餾水清洗干凈，連續(xù)給藥1周，每日稱質(zhì)量并記錄。破腹取腹水記錄體積。摘取脾臟，濾紙吸干表面液體后，稱質(zhì)量并記錄。破胸腔，摘取胸腺，以濾紙吸干表面液體后，稱質(zhì)量并記錄。腹水以10 000 r/min，10 min離心，取上清。以酶聯(lián)免疫吸附法測定腹水中血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的濃度。

胸腺指數(shù)及脾臟指數(shù)[19]計算公式如下:

胸腺（脾臟）指數(shù)＝胸腺質(zhì)量（mg）×10/體質(zhì)量（g）

結(jié)果以均數(shù)±標準差（±s）表示，數(shù)據(jù)以 SPPS 18.0統(tǒng)計軟件進行分析，組間比較采用單因素方差分析，結(jié)果見表9。

表9 浸膏及復方貼膏對小鼠H22肝癌腹水的影響（±s）

表9 浸膏及復方貼膏對小鼠H22肝癌腹水的影響（±s）

注:與空白組比較，*P＜0.001；與模型組相比，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別 （mL） 胸腺指數(shù) 脾臟指數(shù) 腹水中VEGF含量（pg/mL）- 35.32±6.13 40.00±13.24 -4.19±0.58 9.02±3.70*109.59±14.55*792.81±47.48 2.41±1.07##13.53±3.19# 85.69±20.02#716.50±64.11#2.91±0.29##15.10±3.97# 87.95±26.19#723.16±21.19#4.00±1.26 9.14±2.30*108.75±19.94*774.81±65.11 n 8 8 8 8 8腹水量空白組模型組臨床浸膏組復方貼膏組空白貼膏組

由表9結(jié)果可知，與模型組比較，臨床浸膏組和復方車前貼膏組的腹水量均有統(tǒng)計學差異（P＜0.01），且復方貼膏組與臨床浸膏組無統(tǒng)計學差異（P＝0.363）。模型組小鼠與空白組相比，胸腺指數(shù)顯著降低（P＜0.001），脾臟指數(shù)顯著升高（P＜0.001）。臨床浸膏組和復方車前貼膏組的胸腺指數(shù)有一定的升高而脾臟指數(shù)顯著降低（P＜0.05），且貼膏組與浸膏組無差異（P＝0.846）。浸膏組與復方貼膏組的小鼠腹水中VEGF的含量與模型組相比，顯著降低（P＜0.05），且貼膏組與浸膏組無差異（P＝0.857）。以上各指標，空白貼膏組與模型組均無顯著差異。

藥效實驗結(jié)果表明，復方車前水浸膏及復方車前凝膠貼膏均能有效減輕H22小鼠肝癌細胞引起的小鼠腹水狀況。藥效實驗中觀察發(fā)現(xiàn)，給藥后，與模型組相比，浸膏組及貼膏組小鼠毛色有光澤，小鼠狀態(tài)較好，模型組小鼠出現(xiàn)脫毛，毛色暗淡等病態(tài)。但浸膏組由于浸膏涂抹，皮毛被污染嚴重，而貼膏組小鼠皮毛干凈，光澤較好，生存狀態(tài)較佳。因此，復方車前凝膠貼膏劑型改良成功且具有較高的開發(fā)意義。

3 討論

3.1 優(yōu)化方法的選擇 Plackett-Burman設計能用最少實驗次數(shù)篩選并確定對結(jié)果影響比較顯著的因素，避免在后期的優(yōu)化實驗中由于部分因子不顯著而浪費實驗資源，已經(jīng)被廣泛應用于化學、質(zhì)量控制和食品科學等領域[13]。Box-Behnken中心組合設計采用非線性模型擬，通過對函數(shù)響應面和等高中心組合設計采用非線性模型擬，通過對函數(shù)響應面和等高線的分析，對影響應值各因素水平及其交互作用進行優(yōu)化和評價快速有效地確定多因素系統(tǒng)的最佳條件，所得結(jié)果更加直地確定多因素系統(tǒng)的最佳條件，所得結(jié)果更加直觀，便于分析[14-15]。相比正交實驗設計及均勻設計，Box-Behnken設計響應面優(yōu)化更適合處方配比復雜，各因素之間存在交互作用的凝膠貼膏處方設計。因此，本研究選擇以Plackett-Burman設計選擇顯著因子，以Box-Behnken設計響應面優(yōu)化篩選最佳處方。

3.2 小鼠H22肝癌腹水實驗 小鼠（H22）肝癌是最常用的小鼠可移植性腫瘤細胞系之一，廣泛應用于小鼠腫瘤動物模型的復制[17]。在本研究中，藥效實驗結(jié)果顯示，H22肝癌腹水模型造模成功后，模型組小鼠與空白組相比，腹部積水嚴重，出現(xiàn)膨脹，胸腺指數(shù)顯著降低（P＜0.001），脾臟指數(shù)顯著升高（P＜0.001）。造模成功后，H22對小鼠的免疫系統(tǒng)造成了嚴重的傷害，胸腺萎縮，脾臟腫脹，引起水循環(huán)障礙，造成腹水不消，臨床浸膏及改變劑型后的復方車前凝膠貼膏均能夠有效的降低腹水量，提高胸腺指數(shù)，改善H22對小鼠免疫系統(tǒng)的傷害。

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