付 慧, 胡小鍵, 陳 曦, 林少彬

(中國(guó)疾病預(yù)防控制中心環(huán)境與健康相關(guān)產(chǎn)品安全所, 北京 100021)

多環(huán)芳烴(PAHs)作為一類(lèi)廣泛存在的環(huán)境致癌性化合物,受到國(guó)內(nèi)外研究者的普遍關(guān)注。人類(lèi)主要通過(guò)攝入含有PAH的食物或者吸入帶有PAH的空氣而受到污染[1-4]。進(jìn)入體內(nèi)的PAH在肝臟內(nèi)分兩步轉(zhuǎn)化為結(jié)合態(tài)羥基多環(huán)芳烴(OH-PAH),而后經(jīng)尿液或糞便排出體外。由于PAH在體內(nèi)代謝期較短,因而測(cè)定尿中OH-PAH可反映近期PAH暴露情況[5]。以往的研究結(jié)果表明,應(yīng)該選擇多個(gè)PAH代謝物(尤其是致癌性多環(huán)芳烴如苯并[a]蒽、苯并[a]芘等)作為生物標(biāo)志物,來(lái)聯(lián)合評(píng)價(jià)人體的PAHs暴露。由于高環(huán)數(shù)多環(huán)芳烴主要經(jīng)糞便排泄,在尿中的濃度很低[6,7],需要有更靈敏的方法對(duì)尿中多種OH-PAHs代謝物進(jìn)行同時(shí)測(cè)定,以期發(fā)現(xiàn)適于聯(lián)合評(píng)價(jià)PAHs內(nèi)暴露水平的OH-PAHs。

目前,測(cè)定尿中多環(huán)芳烴代謝物的方法主要有氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[5,9-13]、液相色譜法[14-18]和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[19-26]。美國(guó)疾病控制與預(yù)防中心(CDC)采用氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(GC-MS/MS)法測(cè)定尿中24種OH-PAH,尿液樣品經(jīng)液液萃取后再濃縮100倍,衍生化后進(jìn)行儀器分析[5]。該方法作為標(biāo)準(zhǔn)操作方法用于美國(guó)生物監(jiān)測(cè)項(xiàng)目中尿液的測(cè)定,方法具有較高的靈敏度(檢出限達(dá)0.01 μg/L),但是前處理繁瑣,使用有機(jī)溶劑較多,大批量樣品測(cè)定時(shí)效率低下。高效液相色譜-熒光檢測(cè)法[14,16,17]具有選擇性強(qiáng)、分析時(shí)間短、檢出限低和重現(xiàn)性好等優(yōu)點(diǎn),但對(duì)熒光強(qiáng)度較弱的化合物則無(wú)法測(cè)定。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法省略了氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法繁瑣的前處理過(guò)程,且多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式(MRM)的應(yīng)用避免了分析過(guò)程中基質(zhì)的雜質(zhì)干擾,使檢出限明顯降低。目前,國(guó)內(nèi)對(duì)于多環(huán)芳烴的職業(yè)暴露研究多于非職業(yè)暴露,且可以測(cè)定的生物標(biāo)志物少,這與分析手段不夠先進(jìn),檢出限高有關(guān)。全面了解不同地區(qū)PAHs的人體內(nèi)暴露水平,將為政府職能部門(mén)提供可靠的基礎(chǔ)數(shù)據(jù),為PAHs污染防控提供建議。因此發(fā)展快速靈敏、實(shí)用的分析檢測(cè)方法仍是分析化學(xué)工作者努力的方向。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

API4000三重四極桿質(zhì)譜儀(ESI源,美國(guó)Applied Biosystems公司), Acquity UPLC I-Class系統(tǒng)(美國(guó)Waters公司),純水機(jī)(美國(guó)Barnstead公司), Mettler AE 163十萬(wàn)分之一電子天平(瑞士Mettler公司), C18固相萃取柱(3 mL/500 mg)(美國(guó)Supelco公司), 0.2 μm GHP針頭過(guò)濾器(美國(guó)Waters公司)。

甲醇(HPLC級(jí),美國(guó)Fisher公司),無(wú)水醋酸銨、冰醋酸(分析純,國(guó)藥集團(tuán)),β-葡萄糖苷酸酶、芳基硫酸酯酶(美國(guó)Sigma-Aldrich公司),人工尿樣(湖州英創(chuàng)生物科技公司)。

人體尿液實(shí)際樣品采自淮河流域的100名志愿者。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

OH-PAHs標(biāo)準(zhǔn)溶液:準(zhǔn)確稱(chēng)取一定量的目標(biāo)化合物的標(biāo)準(zhǔn)品,以甲醇為溶劑配成質(zhì)量濃度約為1.00 g/L的單標(biāo)儲(chǔ)備液;12種單標(biāo)儲(chǔ)備液各取一定體積混合后,用甲醇定容,配制成各組分質(zhì)量濃度均為100 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液。用甲醇逐級(jí)稀釋得到使用液。

飽和醋酸-醋酸銨緩沖溶液:準(zhǔn)確稱(chēng)取740.0 g無(wú)水醋酸銨,加入500 mL水,用超聲波振蕩器振蕩溶解,用冰醋酸調(diào)pH至5.0。水解酶溶液:按照每個(gè)樣品使用3 000 Uβ-葡萄糖苷酸酶、70 U芳基硫酸酯酶的量,根據(jù)所購(gòu)β-葡萄糖苷酸酶、芳基硫酸酯酶的含量,計(jì)算實(shí)驗(yàn)所需水解酶的量,準(zhǔn)確稱(chēng)取(3 000×(n+3)/A) gβ-葡萄糖苷酸酶和(70×(n+3)/B) g芳基硫酸酯酶(n為樣品數(shù),通常多加3份樣品的量;A、B分別為兩種酶的比活力,U/g),用飽和醋酸-醋酸銨緩沖溶液控溫超聲溶解并定容至10×(n+3) mL,現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1樣品前處理

將冰凍尿樣放置至室溫,準(zhǔn)確移取10.0 mL尿樣于25.0 mL玻璃試管中,分別加入100 μL 200 μg/L的內(nèi)標(biāo)溶液和10.0 mL的水解酶溶液,充分混勻后置于37 ℃恒溫箱中避光水解16 h,得水解液。依次用5.0 mL甲醇、5.0 mL水活化C18固相萃取柱,將水解液通過(guò)C18固相萃取柱富集,用1.0 mL水淋洗小柱,氮?dú)獯蹈?0 min,然后用1.0 mL甲醇以0.25 mL/min進(jìn)行洗脫,收集洗脫液,用甲醇定容至1.0 mL,混勻,0.2 μm GHP針頭過(guò)濾器過(guò)濾后,待測(cè)。

1.3.2色譜條件

Acquity UPLC?HSS T3色譜柱(100 mm×2.1 mm, 1.8 μm);柱溫:25 ℃;進(jìn)樣量3.00 μL;流速0.25 mL/min;流動(dòng)相:甲醇(A)和水(B);梯度洗脫程序:0～22 min, 55%A～85%A; 22～25 min, 85%A～55%A。

1.3.3質(zhì)譜條件

ESI離子源,負(fù)離子多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM);霧化氣:高純氮?dú)?碰撞氣(CAD): 83 kPa;氣簾氣(CUR): 138 kPa;霧化氣(GS1): 172 kPa;輔助氣(GS2): 241 kPa;噴霧電壓(IS): -4 000 V;離子源溫度(TEM): 450 ℃;掃描時(shí)間:100 ms;其他質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表1。

表 1 12種OH-PAHs和2種同位素內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間、監(jiān)測(cè)離子、碰撞電壓(CE)和去簇電壓(DP)

* Quantitative ion.

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的選擇

用甲醇將14種物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液分別稀釋成100 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)使用液,采用流動(dòng)注射方式,以10 μL/min的流速進(jìn)樣,在正離子和負(fù)離子模式下進(jìn)行全掃描,以選擇適當(dāng)?shù)碾婋x方式和分子離子峰。結(jié)果表明,在負(fù)離子模式下,目標(biāo)化合物全掃描的分子離子[M-H]-最理想;以目標(biāo)化合物的[M-H]-為母離子進(jìn)行子離子掃描,選擇豐度最高、干擾較少的兩個(gè)子離子,優(yōu)化CE和DP;用100 μg/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,在負(fù)離子模式下,以MRM方式優(yōu)化CUR、CAD、GS1、GS2、IS、TEM等參數(shù),結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

比較了14種物質(zhì)在Acquity UPLC?BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm)和Acquity UPLC?HSS T3色譜柱(100 mm×2.1 mm, 1.8 μm)上的保留行為。結(jié)果顯示,在C18色譜柱上3-OHP和2-OHP不能完全分離,3-OHC和3-OHBAA無(wú)法完全分離;在T3色譜柱上,只有2-OHF和3-OHF無(wú)法完全分離,其他化合物均得到較好分離,目標(biāo)化合物的響應(yīng)值較高,各物質(zhì)峰形尖銳、對(duì)稱(chēng),峰形較好。另外,比較了甲醇-水、乙腈-水、0.05%(v/v)氨水乙腈-水、0.1%(v/v)氨水乙腈-水和0.2%(v/v)氨水-乙腈流動(dòng)相對(duì)14種物質(zhì)離子化程度的影響。結(jié)果表明,使用甲醇-水溶液體系時(shí)選擇離子的色譜峰形和靈敏度均優(yōu)于其他溶液體系。方法選用Acquity UPLC?HSS T3色譜柱(100 mm×2.1 mm, 1.8 μm),用甲醇-水流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫,尿中目標(biāo)化合物的MRM色譜圖見(jiàn)圖1。將14個(gè)目標(biāo)化合物單標(biāo)溶液在最佳儀器條件下分別進(jìn)樣以確定各目標(biāo)化合物的保留時(shí)間,見(jiàn)表1。

圖 1 14種OH-PAHs的MRM色譜圖Fig. 1 MRM chromatogram of the fourteen OH-PAHs Peak identifications: 1. 2-OHN; 2. 1-OHN; 3. 3-OHF & 2-OHF; 4. 2-OHP; 5. 3-OHP; 6. 1-OHP; 7. 1-OHPyr; 8. 3-OHC; 9. 3-OHBAA; 10. 6-OHC; 11. 1-OHBAA; 12. 3-OHP-13C6; 13. 6-OHC-13C6.

2.3 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.3.1淋洗溶劑及用量的選擇

為了減小尿樣基體的干擾,提高實(shí)驗(yàn)的靈敏度,實(shí)驗(yàn)在水解液通過(guò)固相萃取柱富集后,加入了淋洗步驟?？疾炝瞬煌浔鹊募状?水、乙腈-水和純水淋洗對(duì)目標(biāo)化合物回收率的影響。結(jié)果表明,純水淋洗效果較好,因此實(shí)驗(yàn)采用1.0 mL純水進(jìn)行淋洗。

2.3.2濃縮方式的選擇

實(shí)驗(yàn)比較了濃縮和直接洗脫進(jìn)樣對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。取2份平行尿樣,分別加入等量的標(biāo)準(zhǔn)品,37 ℃恒溫避光酶解16 h,將酶解液通過(guò)固相萃取小柱富集、淋洗后,一份用1.0 mL甲醇進(jìn)行洗脫、定容至1.0 mL后待測(cè);另一份用5.0 mL甲醇洗脫,真空濃縮儀35 ℃濃縮至干后,1.0 mL甲醇溶解定容后待測(cè)。結(jié)果表明,直接洗脫進(jìn)樣所測(cè)樣品的峰面積明顯高于濃縮后測(cè)定樣品。采用真空濃縮方式進(jìn)行樣品濃縮時(shí),1-OHN和2-OHN兩種物質(zhì)損失較為嚴(yán)重;用1.0 mL甲醇進(jìn)行洗脫,定容至1.0 mL后測(cè)定,既省去了濃縮步驟,又可以達(dá)到良好的實(shí)驗(yàn)效果。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1線性范圍和檢出限

本方法采用內(nèi)標(biāo)法定量。向人工尿樣中加入系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和內(nèi)標(biāo)溶液,配制成質(zhì)量濃度分別為0、0.04、0.10、0.40、1.00、2.00、10.0、20.0 μg/L,內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度為2.00 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。經(jīng)過(guò)與樣品相同的前處理后,在優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下測(cè)定。2-OHN、1-OHN、3-OHF、2-OHF、3-OHP、2-OHP和1-OHP以3-OHP-13C6為內(nèi)標(biāo),1-OHPyr、3-OHC、6-OHC、1-OHBAA、3-OHBAA以6-OHC-13C6為內(nèi)標(biāo),進(jìn)行定量計(jì)算。以被測(cè)組分質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(x, μg/L),被測(cè)組分定量離子峰面積與內(nèi)標(biāo)物定量離子峰面積比為縱坐標(biāo)(y),進(jìn)行線性回歸分析,得到12種目標(biāo)化合物的線性方程和相關(guān)系數(shù)。采用空白樣品中添加目標(biāo)物的方法,以3倍信噪比(S/N)對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度確定檢出限(LOD), 10倍信噪比(S/N)對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度確定定量限(LOQ)。12種目標(biāo)化合物在0.04～20.0 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)>0.99,方法檢出限為0.01～0.41 μg/L,定量限為0.04～1.35 μg/L。線性方程和檢出限見(jiàn)表2。

2.4.2回收率和精密度

取一實(shí)際尿樣,分別在高、中、低3個(gè)濃度水平下加標(biāo),每個(gè)加標(biāo)樣品做6個(gè)平行樣。采用1.3.1節(jié)樣品前處理方法處理加標(biāo)樣品,在最佳儀器條件下,依次進(jìn)樣,將測(cè)試樣各組分的峰面積代入工作曲線的線性回歸方程,計(jì)算各組分的濃度。同樣條件處理樣品3批,進(jìn)行測(cè)定。計(jì)算準(zhǔn)確度、批內(nèi)精密度和批間精密度。準(zhǔn)確度以加標(biāo)回收率表示,批內(nèi)和批間精密度以相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)表示。樣品平均回收率和精密度見(jiàn)表3。

2.5 實(shí)際樣品測(cè)定

采用本實(shí)驗(yàn)條件和方法,對(duì)淮河流域某區(qū)域的100份人體尿樣進(jìn)行了檢測(cè),以期了解該地區(qū)不同人群的PAHs內(nèi)暴露水平。結(jié)果顯示,OH-PAHs的檢出率為98%,檢出率由高到低,分別為2-OHP、3-OHP、2-OHN、1-OHN、1-OHP和3-OHF & 2-OHF,其余物質(zhì)未檢出。以2-OHN為例,其檢出率為40%,檢出范圍為0.10～3.62 μg/L,四分位距為0.23 μg/L,結(jié)果詳見(jiàn)表4。

表 2 12種OH-PAHs的定量?jī)?nèi)標(biāo)、回歸方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)(r)、檢出限和定量限

y: peak area ratio of quantitative ions of the measured component to the internal standard;x: mass concentration of the measured component, μg/L.

表 3 12種OH-PAHs在尿中3個(gè)水平下的加標(biāo)回收率和精密度(n=6)

表 4 100份尿樣中12種OH-PAHs的檢測(cè)結(jié)果

*IQR: interquartile range.

3 結(jié)論

:

[1] Song X J, Li H Y, Yin M M, et al. Chinese Journal of Chromatography, 2018, 36(1): 51

宋曉娟, 李海燕, 尹明明, 等. 色譜, 2018, 36(1): 51

[2] Wang M F, Yang L L, Hu E Y. Chinese Journal of Chromatography, 2017, 35(6): 669

王美飛, 楊麗莉, 胡恩宇. 色譜, 2017, 35(6): 669

[3] Feng L, Zhang S J, Zhu G H, et al. Chinese Journal of Chromatography, 2017, 35(4): 466

馮利, 張勝軍, 朱國(guó)華, 等. 色譜, 2017, 35(4): 466

[4] Zhao B, Li Y Q, Zhang S K, et al. Chinese Journal of Chromatography, 2014, 32(9): 960

趙波, 黎玉清, 張素坤, 等. 色譜, 2014, 32(9): 960

[5] Li Z, Romanoff L C, Trinidad D A, et al. Anal Chem, 2006, 78(16): 5744

[6] Pang Y H, Ma Y, Cui Y, et al. Journal of Environment and Health, 2012, 29(6): 567

龐月紅, 馬蕓, 崔燕, 等. 環(huán)境與健康雜志, 2012, 29(6): 567

[7] Song X L, Hu X J, Lin S B. Journal of Environment and Health, 2017, 34(6): 555

宋喜麗, 胡小鍵, 林少彬. 環(huán)境與健康雜志, 2017, 34(6): 555

[8] Li Z, Romanoff L C, Trinidad D A, et al. Anal Bioanal Chem, 2014, 406(13): 3119

[9] Campo L, Mercadante R, Rossella F, et al. Anal Chim Acta, 2009, 631(2): 196

[10] Mattarozzi M, Musci M, Careri M, et al. J Chromatogr A, 2009, 1216(30): 5634

[11] Campo L, Rossella F, Fustinoni S. J Chromatogr B, 2008, 875(2): 531

[12] Romanoff L C, Li Z, Young K J, et al. J Chromatogr B, 2006, 835(1/2): 47

[13] Smith C J, Huang W, Walcott C J, et al. Anal Bioanal Chem, 2002, 372(1): 216

[14] Maisonnette C, Simon P, Hennion M C, et al. J Chromatogr A, 2006, 1120(1/2): 185

[15] Yang H M, Wang Y S, Li J H, et al. Applied Chemical Industry, 2014, 43(5): 957

楊紅梅, 王永生, 黎俊宏, 等. 應(yīng)用化工, 2014, 43(5): 957

[16] Wang Y, Dong Y L, Fan R F, et al. Journal of Environment and Health, 2006, 23(1): 76

王宇, 董玉蓮, 范瑞芳, 等. 環(huán)境與健康雜志, 2006, 23(1): 76

[17] You F, Zhu L, He L, et al. Chinese Journal of Analytical Chemistry, 2014, 42(12): 1723

游釩, 朱嵐, 何玲, 等. 分析化學(xué), 2014, 42(12): 1723

[18] Chauhan A, Bhatia T, Singh A, et al. J Chromatogr B, 2015, 985: 110

[19] Ramsauer B, Sterz K, Hagedorn H W, et al. Anal Bioanal Chem, 2011, 399(2): 877

[20] Chen Y S, Wang S, Yu J J, et al. Tobacco Science & Technology, 2012(4): 37

陳玉松, 王昇, 余晶晶, 等. 煙草科技, 2012(4): 37

[21] Fan R F, Ramage R, Wang D L, et al. Talanta, 2012, 93(11): 383

[22] Zhao G, Chen Y, Wang S, et al. Talanta, 2013, 116(22): 822

[23] Li X X, Cui S W, He M F, et al. Chinese Preventive Medicine, 2012, 13(4): 246

李欣欣, 崔師偉, 何民富, 等. 中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志, 2012, 13(4): 246

[24] Ding C M, Jin Y L, Lin S B. Chinese Journal of Analytical Chemistry, 2012, 40(3): 397

丁昌明, 金銀龍, 林少彬. 分析化學(xué), 2012, 40(3): 397

[25] Huang C F, Yan H F, Pan Z F, et al. Journal of Hygiene Research, 2010, 39(3): 355

黃傳峰, 閆慧芳, 潘祖飛, 等. 衛(wèi)生研究, 2010, 39(3): 355

[26] Zheng L, Ding C M, Hu X J, et al. Journal of Environment and Health, 2011, 28(4): 348

鄭磊, 丁昌明, 胡小鍵, 等. 環(huán)境與健康雜志, 2011, 28(4): 348