凌阿茹, 郭文博, 楊俊花, 趙志輝, 郭晉麗

(上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所, 上海 201403)

黃曲霉毒素(aflatoxins, AFTs)是由寄生曲霉菌(aspergillusparasiticus)和黃曲霉菌(aspergillusflavus)等在適宜的溫度、濕度條件下產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物,普遍存在于花生、玉米、小麥等谷物和糧油產(chǎn)品中[1]。至今已鑒定到的AFTs有20多種,其中關(guān)于黃曲霉毒素B1(AFB1)、黃曲霉毒素B2(AFB2)、黃曲霉毒素G1(AFG1)、黃曲霉毒素G2(AFG2)及其代謝產(chǎn)物黃曲霉毒素M1(AFM1)、黃曲霉毒素M2(AFM2)的研究較多,以上AFTs均含有雙呋喃環(huán)和致癌性結(jié)構(gòu)氧雜萘鄰?fù)猍2]。雜色曲霉素(sterigmatocystin, SMC)是曲霉菌生物合成AFB1、AFG1等的前體物質(zhì),結(jié)構(gòu)與AFTs極為相似,常協(xié)同污染谷物及糧油產(chǎn)品[3]。近年來多有研究[4,5]指出,真菌毒素中黃曲霉毒素的毒性最強(qiáng),動物或人攝入較大劑量易引起急性中毒、肝炎、出血性壞死、肝細(xì)胞脂肪變性等,而持續(xù)微量攝入可造成慢性中毒,致癌、致畸及致突變等,嚴(yán)重時能引起肝硬化壞死、癌變甚至死亡[6,7]。1993年世界衛(wèi)生組織(WHO)癌癥研究機(jī)構(gòu)將黃曲霉毒素列為Ⅰ級致癌物。此外也有研究表明,雜色曲霉素也具有腎臟和肝臟毒性,會造成動物肝細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞壞死、肝硬化、中毒性肝炎等[8]。畜禽攝入被黃曲霉毒素或者雜色曲霉素污染的谷物飼料,不僅影響健康,還極易在動物源性產(chǎn)品(肉、奶、動物肝臟)中蓄積殘留,嚴(yán)重威脅人類健康。因此,建立一種靈敏、簡便、快速檢測黃曲霉毒素和雜色曲霉素殘留的分析方法非常必要。

動物源性組織中黃曲霉毒素的檢測手段主要有高效液相色譜法(HPLC)、薄層色譜法(TLC)、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)等[9-16]。史瑩華等[9]采用免疫親和柱凈化,反相高效液相色譜法測定動物組織中AFB1、AFB2、AFG1和AFG2,該方法凈化、衍生步驟復(fù)雜,前處理過程耗時,靈敏度低;薄層色譜法分析步驟復(fù)雜,不適宜大批量樣品的檢測[10];基于單克隆抗體或多克隆抗體的ELISA檢測對象單一,容易出現(xiàn)假陽性結(jié)果[11]。目前,液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法已廣泛用于飼料、血漿、谷物、牛奶等不同基質(zhì)中黃曲霉毒素的分析檢測[12-15],其靈敏度高,檢測限低,確證和定量分析準(zhǔn)確。孫雪等[16]建立了LC-MS/MS檢測豬肉、魚肉和豬肝中AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、AFM1和AFM2的方法,該方法采用免疫親和柱凈化,需大批量的樣本篩查和安全監(jiān)測,成本較高。因此,本研究在此基礎(chǔ)上,選用經(jīng)濟(jì)、簡單、快速、高效的QuEChERS前處理技術(shù)[17],結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(UHPLC-MS/MS),同時增加污染頻率較高、毒性僅次于AFTs的雜色曲霉素進(jìn)行分析,旨在為動物源性產(chǎn)品中黃曲霉毒素和雜色曲霉素的安全監(jiān)管提供便捷、高效、廣泛的技術(shù)支持。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑和材料

ACQUITY UPLC I-Class超高效液相色譜儀(美國Waters公司); TRIPLE QUAD 5500型三重四極桿質(zhì)譜儀(美國AB Sciex公司); Sorvall ST 16R型高速冷凍離心機(jī)(美國Thermo Fisher公司); DC-24型氮?dú)獯蹈蓛x、2500 TH型超聲波清洗機(jī)(上海安普實驗科技股份有限公司); DMT-2500型多管式旋渦混勻儀(上海豫明儀器有限公司)。

AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、AFM1、AFM2和SMC標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥99%, Romer國際貿(mào)易(北京)有限公司);β-葡萄糖苷酶(3 000 U/mg,上海泰坦科技股份有限公司)、甲醇、乙腈、乙酸銨和甲酸(色譜純,美國Merck公司);氯化鈉、無水硫酸鎂(上海埃彼化學(xué)試劑有限公司);正己烷(上海安譜科學(xué)儀器有限公司); 0.22 μm有機(jī)系濾膜(天津市津騰實驗設(shè)備有限公司);實驗用豬肉、豬肝、雞肉樣本均購自上海各超市及農(nóng)貿(mào)市場。

1.2 溶液配制

稱取AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、AFM1、AFM2和SMC標(biāo)準(zhǔn)品各1 mg,分別置于100 mL棕色容量瓶中,用乙腈配制成10 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液,于-20 ℃避光保存;準(zhǔn)確量取AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、AFM1、AFM2和SMC標(biāo)準(zhǔn)儲備液各100 μL,分別置于10 mL棕色容量瓶中,用乙腈定容,配制成1 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)工作液,于-20 ℃避光保存。

取適量混合標(biāo)準(zhǔn)工作液,用5 mmol/L乙酸銨水溶液-乙腈(80∶20, v/v)進(jìn)行稀釋,配制成質(zhì)量濃度為0.1、1、5、10、20、50、100 μg/L的系列溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液;分別量取適量混合標(biāo)準(zhǔn)工作液,加入豬肉、豬肝、雞肉組織的空白提取液進(jìn)行稀釋,配制成質(zhì)量濃度為0.1、1、5、10、20、50、100 μg/L的系列基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液。

稱取β-葡萄糖苷酶5 mg,用1 mL磷酸鹽緩沖液(PBS)配制成5 g/L(15 000 U/mL)β-葡萄糖苷酶緩沖液;稱取0.197 2 g乙酸銨冰晶,用500 mL超純水配制成5 mmol/L乙酸銨溶液。

1.3 實驗條件

1.3.1樣品前處理

將豬肉、雞肉和豬肝臟樣品分別絞至勻漿狀,分裝好后于-20 ℃保存,測定前于4 ℃解凍。

準(zhǔn)確稱取(2.00±0.05) g樣品,置于50 mL離心管中,加入20 μLβ-葡萄糖苷酶緩沖液和1.6 mL水,渦旋混勻,于37 ℃酶解12 h,加入8.4 mL乙腈,渦旋均勻,于40 ℃超聲40 min,然后以2 000 r/min渦旋30 min,再分別加入NaCl 1.0 g和無水MgSO41.0 g,最后加入5 mL正己烷脫脂,渦旋均勻,以5 000 r/min離心10 min,取5 mL中層清液于10 mL離心管中,于40 ℃水浴氮?dú)獯蹈?加入1 mL 5 mmol/L乙酸銨水溶液-乙腈(80∶20, v/v)復(fù)溶,過0.22 μm有機(jī)系濾膜,待上機(jī)檢測。

1.3.2液相色譜條件

色譜柱:Agilent Poroshell 120 EC-C18柱(100 mm×3.0 mm, 2.7 μm);柱溫:40 ℃;進(jìn)樣室溫度:25 ℃;流動相A:甲醇;流動相B: 5 mmol/L乙酸銨溶液;流速:0.4 mL/min。梯度洗脫程序:0～1.0 min, 10%A; 1.0～6.0 min, 10%A～90%A; 6.0～6.5 min, 90%A; 6.5～6.7 min, 90%A～10%A; 6.7～8.0 min, 10%A。進(jìn)樣體積:5 μL。

1.3.3質(zhì)譜條件

離子化模式:電噴霧正離子模式(ESI+);質(zhì)譜掃描模式:多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式;離子源溫度:150 ℃;掃描范圍(m/z): 100～800;各離子對駐留時間:100 ms;毛細(xì)管電壓:2.5 kv;錐孔電壓:25 v;干燥氣溫度:500 ℃;干燥氣流速:1 000 L/h。其他質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表 1 6種黃曲霉毒素和雜色曲霉素在多反應(yīng)監(jiān)測模式下的質(zhì)譜參數(shù)

*Quantitative ion.

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理條件的優(yōu)化

2.1.1提取溶劑的優(yōu)化

6種黃曲霉毒素的化學(xué)結(jié)構(gòu)相似,易溶于醇類、丙酮、氯仿等有機(jī)溶劑,難溶于水和正己烷等[4]。常見的提取溶劑有乙腈-水、乙腈-乙酸-水、甲醇-水、氯仿等,且混合提取溶劑的比例不同提取結(jié)果也存在差異。本實驗對添加了50 μL 1 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)工作液的豬肉樣品(即添加水平25 μg/kg)進(jìn)行前處理,比較乙腈-水(84∶16, v/v)、乙腈-水(90∶10, v/v)、乙腈-水(50∶50, v/v)、乙腈-水-乙酸(79∶20∶1, v/v/v)4種不同提取溶劑對6種黃曲霉毒素和雜色曲霉素回收率的影響,結(jié)果見圖1。不同提取溶劑對6種黃曲霉毒素和雜色曲霉素的回收率存在顯著差異(p<0.05),當(dāng)乙腈和水的體積比為84∶16時,6種黃曲霉毒素和雜色曲霉素的回收率均最高,為97.6%～118.5%。同時對雞肉和豬肝樣品進(jìn)行考察也獲得了相同的結(jié)果。因此本實驗選用乙腈-水(84∶16, v/v)進(jìn)行提取。

圖 1 不同提取溶劑對6種黃曲霉毒素和雜色曲霉素回收率的影響(n=3)Fig. 1 Influence of different extract solvents on the recoveries of the six AFTs and SMC (n=3)

2.1.2酶的選擇

Mabee和Chipley[18]通過觀察雞肉體內(nèi)14C-AFB1的組織分布與代謝途徑發(fā)現(xiàn)14C-AFB1的代謝產(chǎn)物14C-AFM1在雞肉組織中與葡萄糖苷酸以共軛物的形式存在,并且檢測結(jié)果顯示,經(jīng)β-葡萄糖苷酶酶解后的樣品中有31.5%的14C都來源于該共軛物所釋放的葡萄糖苷酸綴合物。曹曉琴[4]先利用β-葡萄糖苷酶酶解豬、牛、羊的肌肉、肝臟、腎臟和脂肪組織,再對黃曲霉毒素進(jìn)行提取檢測,其回收率較高。因此,本實驗最終選擇β-葡萄糖苷酶對畜禽組織進(jìn)行酶解。分別制備加標(biāo)豬肉、豬肝、雞肉樣品(25 μg/kg),各加標(biāo)樣品酶解前后的提取效果見圖2。由圖2可知,3種加標(biāo)樣品在經(jīng)β-葡萄糖苷酶酶解后6種黃曲霉毒素和雜色曲霉素的回收率均高于未酶解的樣品。表明酶解有助于6種黃曲霉毒素和雜色曲霉素的游離,使結(jié)果更準(zhǔn)確，同時研究發(fā)現(xiàn)酶解使復(fù)溶液更容易過濾,上機(jī)樣品也更澄清。

圖 2 酶解前后不同加標(biāo)樣品中6種黃曲霉毒素和雜色曲霉素的回收率(n=3)Fig. 2 Recoveries of the six AFTs and SMC in different spiked samples with and without enzymatic hydrolysis (n=3)

2.2 色譜條件的優(yōu)化

為了使結(jié)構(gòu)類似的黃曲霉毒素和雜色曲霉素能夠有效分離,本研究選用分離性能較好的Agilent Poroshell 120 EC-C18色譜柱(100 mm×3.0 mm, 2.7 μm),并比較了在不同流動相(乙腈-水、甲醇-0.1%(v/v)甲酸水溶液、甲醇-0.1%(v/v)乙酸水溶液和甲醇-5 mmol/L乙酸銨溶液)和不同洗脫梯度條件下各黃曲霉毒素和雜色曲霉素的響應(yīng)值和峰形。結(jié)果顯示,在水相中加入5 mmol/L乙酸銨時6種黃曲霉毒素和雜色曲霉素的響應(yīng)值較高,分離度好,峰形尖銳。因此最終選擇甲醇和5 mmol/L乙酸銨溶液作為流動相。

2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

實驗通過直接進(jìn)樣方式對質(zhì)譜條件進(jìn)行優(yōu)化。由于黃曲霉毒素和雜色曲霉素屬于中等極性物質(zhì),所以采用電噴霧離子源進(jìn)行離子化,并且在正離子模式下進(jìn)行母離子全掃描。結(jié)果表明,黃曲霉毒素和雜色曲霉素均生成[M+H]+基峰離子,以此為母離子進(jìn)行子離子掃描。通過兩者之間信號強(qiáng)度的比較,優(yōu)化母離子、定量子離子、去簇電壓、碰撞電壓等質(zhì)譜參數(shù),得到優(yōu)化后的最佳質(zhì)譜參數(shù)。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)的考察

畜禽組織成分復(fù)雜,含有許多蛋白質(zhì)等大分子化合物,極易對質(zhì)譜離子化產(chǎn)生影響。為了保證實驗的準(zhǔn)確性,分別建立溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線和基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線,考察豬肉、豬肝、雞肉不同基質(zhì)對提取效果的影響。本實驗分別制備了3種樣品的空白基質(zhì)溶液,用于基質(zhì)效應(yīng)的考察和方法學(xué)驗證。對質(zhì)量濃度為0.1、1、5、10、20、50、100 μg/L的系列溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液和基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液依次進(jìn)行測定,以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、相應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)繪制溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線和基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)Matuszewski等[19]的描述,用信號增強(qiáng)或抑制的程度(SSE)來評價基質(zhì)效應(yīng),計算公式如下:

SSE=(S1/S2)×100% (1)

y: peak area;x: mass concentration, μg/L.

其中,S1和S2分別表示樣品基質(zhì)和溶劑標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。SSE值的正常范圍為80%～120%,當(dāng)其高于120%時顯示信號增強(qiáng)效應(yīng),當(dāng)其低于80%時顯示信號抑制效應(yīng)[20]。不同畜禽組織對6種黃曲霉毒素和雜色曲霉素提取效果的干擾情況見表2。

由表2可知,豬肉基質(zhì)對AFB2和AFM2有一定的抑制作用,其他4種黃曲霉毒素和雜色曲霉素的SSE值均在80%～120%之間;豬肝和雞肉基質(zhì)對部分毒素有一定的干擾效應(yīng),其SSE值>120%或<80%。因此,為了保證檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性,選擇基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量分析。

表 2 不同畜禽組織中6種黃曲霉毒素和雜色曲霉素的基質(zhì)效應(yīng)

2.5 方法學(xué)驗證

2.5.1線性關(guān)系、檢出限和定量限

對質(zhì)量濃度為0.1、1、5、10、20、50、100 μg/L的系列基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行分析,建立基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線(見表3)。分別根據(jù)定性離子通道中信噪比(S/N)=3和定量離子通道中S/N=10計算方法的檢出限(LOD)和定量限(LOQ),結(jié)果見表3。

由表3可知,不同基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液中6種黃曲霉毒素和雜色曲霉素在線性范圍0.1～100 μg/L內(nèi),相關(guān)系數(shù)均>0.99,參考2002/657/EC標(biāo)準(zhǔn),說明本方法線性關(guān)系良好。豬肉、豬肝、雞肉基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液中黃曲霉毒素及雜色曲霉素的檢出限分別為0.007～0.30、0.01～0.15和0.01～0.27 μg/kg,定量限分別為0.02～0.80、0.03～0.49和0.02～0.91 μg/kg,說明本方法靈敏度高,可用于不同畜禽樣品的定性和定量分析。

2.5.2回收率

稱取(2.00±0.05) g空白樣品,分別加入2、10和50 μL 1 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(即加標(biāo)水平分別為1、5和25 μg/kg),每個水平做6個平行樣品,靜置10 min,依次對樣品進(jìn)行提取處理和色譜-質(zhì)譜分析。根據(jù)檢測結(jié)果計算回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),結(jié)果見表4。在3個添加水平下,3種不同基質(zhì)中6種黃曲霉毒素和雜色曲霉素的回收率為77.3%～118.5%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為1.5%～19.9%。

表 4 豬肉、豬肝和雞肉樣品中6種黃曲霉毒素和雜色曲霉素的回收率和精密度(n=6)

2.6 實際樣品分析

通過本文建立的UHPLC-MS/MS方法對從各超市及大型農(nóng)貿(mào)批發(fā)市場采購的127份樣品(1～33號為豬肉樣品、34～54號為豬肝樣品、55～127號為雞肉樣品)中6種黃曲霉毒素和雜色曲霉素進(jìn)行定量分析。127份樣品中有10份檢出黃曲霉毒素或雜色曲霉素,其中雜色曲霉素SMC的檢出率最高,污染率為7.08%,含量為0.118～0.798 μg/kg; AFM1和AFM2未檢出;其中只有27號豬肉樣品同時檢出了AFB1、AFB2、AFG1、AFG2和SMC,含量為0.118～0.458 μg/kg,表明畜禽產(chǎn)品中黃曲霉毒素和雜色曲霉素的殘留量較低,其中主要以SMC殘留為主。

3 結(jié)論

本文建立了以QuEChERS前處理技術(shù)為基礎(chǔ)同時測定畜禽組織中6種黃曲霉毒素和雜色曲霉素的UHPLC-MS/MS定量分析方法。方法操作簡單,靈敏度高,準(zhǔn)確性好,穩(wěn)定可靠,適用于畜禽組織中黃曲霉毒素和雜色曲霉素的確證和定量分析,同時可為建立檢測畜禽組織中黃曲霉毒素和雜色曲霉素的國家標(biāo)準(zhǔn)方法和畜禽產(chǎn)品當(dāng)中真菌毒素的風(fēng)險監(jiān)控提供參考。

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