張松賀，袁樹東，韓 冰

(河海大學(xué)環(huán)境學(xué)院，江蘇 南京 210098)

沉水植物是水生態(tài)系統(tǒng)中的重要組成部分[1],具有凈化水體、固著懸浮顆粒物、穩(wěn)定水體環(huán)境等功能[2]。在有沉水植物存在的水域，水體透明度通常明顯增高，底泥營養(yǎng)鹽的釋放可以得到有效控制，水質(zhì)有較明顯的改善[3-7]?？嗖?Vallisnerianatans)是湖泊中常見的沉水植物優(yōu)勢種，生命力強(qiáng)，在不同的底質(zhì)中有廣泛的適應(yīng)能力，對湖泊生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能起關(guān)鍵作用，常作為污染水體植被恢復(fù)工程的主要選用品種[8]。

水生態(tài)修復(fù)過程中仍然有許多問題需要解決，如沉水植物的分布特征與水質(zhì)、水流及水位變化的影響等。水體環(huán)境對沉水植物的影響主要通過植物體內(nèi)保護(hù)酶體系的響應(yīng)、植物形態(tài)指標(biāo)以及生物量的變化來反映[9-10]。目前關(guān)于沉水植物的研究很多，王謙等[11]總結(jié)了沉水植物在重金屬水體污染修復(fù)中的應(yīng)用，明確了沉水植物的作用；高海榮等[12]研究了鉛對龍須眼子菜光合作用的影響。關(guān)于苦草的研究主要集中于富營養(yǎng)化水體中苦草的形態(tài)與生理響應(yīng)。宋玉芝等[8]研究了苦草對富營養(yǎng)化水體中氮磷營養(yǎng)鹽的生理響應(yīng)；王永平等[13]對貧、富營養(yǎng)化水平湖泊中的苦草形態(tài)進(jìn)行了比較；本課題組前期研究了氨氮對沉水植物的影響以及沉水植物附著微生物群落特征[14-16]。

水流是影響水體生態(tài)系統(tǒng)的重要因素之一。水流對水生植物的形態(tài)以及物質(zhì)組成具有重要的影響[17]。在微觀角度，Besemer等[18]認(rèn)為水流作用有助于將營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣輸送到河床表面生物膜，影響生物膜的生長以及微生物群落的演替。Battin等[19]發(fā)現(xiàn)高流速水體中河床表面生物膜的厚度比低流速中的要小，低流速有利于提高生物膜生物量。目前，關(guān)于水流對沉水植物影響的研究較少。本研究以本土沉水植物苦草作為研究對象，通過野外現(xiàn)場試驗(yàn)，分析較強(qiáng)水流對苦草生長以及不同生長階段的生理指標(biāo)的影響。這些結(jié)果將為認(rèn)識(shí)沉水植物在野外生長及繁殖情況提供試驗(yàn)數(shù)據(jù)，為水生生態(tài)系統(tǒng)的保護(hù)和持續(xù)利用提供基礎(chǔ)資料。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)置

丁家山河位于江蘇省南京市浦口區(qū)，上游為珍珠泉水庫。珍珠泉為天然地下涌泉，水質(zhì)良好，下游河道河底平整，水位落差小。在丁家山河上游河道(浦廠中學(xué)旁)選取一段作為實(shí)驗(yàn)區(qū)域(圖1)，種植苦草，種植時(shí)間為2016年6月。種植前對試驗(yàn)區(qū)河道進(jìn)行平整，盡量保證水位及底質(zhì)條件一致。在試驗(yàn)區(qū)域內(nèi)，選取兩個(gè)點(diǎn)位作為采樣點(diǎn)(圖1(a)，1(b))。圖1(a)為靜水區(qū)域(流速小于2 cm/s)，位于河道靠岸邊位置，通過圍堰使水流相對靜止；圖1(b)為動(dòng)水區(qū)域(流速為30～40 cm/s)，位于河道中部。

1.2 采樣

水樣以及植物樣品(苦草葉片及植株)均采集自靜水區(qū)和動(dòng)水區(qū)兩個(gè)采樣點(diǎn)，采樣時(shí)間為2016年8月、10月、12月以及2017年1月，共4次。每個(gè)采樣點(diǎn)采集約30 g新鮮植物葉片樣品，5株植株樣本。采集后立即用冰袋保存，帶回實(shí)驗(yàn)室后選取5 g樣品來測定葉片相對電導(dǎo)率，剩余樣品用液氮冷凍后放入超低溫冰箱(-65℃保存)，以便后續(xù)其他指標(biāo)的測定。每個(gè)采樣點(diǎn)采集約1 000 mL水樣，帶回實(shí)驗(yàn)室后4℃保存，并于24 h內(nèi)完成水質(zhì)指標(biāo)檢測。

(a) 靜水區(qū)域

(b) 動(dòng)水區(qū)域

1.3 測定項(xiàng)目及測定方法

1.3.1 水質(zhì)指標(biāo)測定

TN的測定采用GB11894—1989《堿性過硫酸鉀消解紫外分光光度法》， TP的測定采用GB1183—1989《鉬酸銨分光光度法》。

1.3.2 苦草生長指標(biāo)的測定

葉長、葉寬的測定：將苦草植株采回后用水洗凈，分別統(tǒng)計(jì)植株的葉長、葉寬，并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

附著生物量測定：將采集的植株放入500 mL聚氯乙烯瓶中，加入300 mL酒精，以180 r/min 震蕩30 min，超聲3 s之后，再以180 r/min 震蕩30 min。棄去植物，將洗脫液以8 000 r/min離心10 min，棄去上清液后稱重。

1.3.3 苦草葉綠素含量比測定

葉綠素含量測定采用95%乙醇-丙酮提取法[18]，分別于665、643 nm波長下測定吸光度值，葉綠素a、葉綠素b和葉綠素的總含量計(jì)算公式分別為

Ca=12.7A663 nm-2.69A645 nm

(1)

Cb=22.9A645 nm-4.68A663 nm

(2)

C=Ca+Cb

(3)

式中：Ca為葉綠素a含量；Cb為葉綠素b含量；C為葉綠素總含量；A645 nm為645 nm波長下吸光度；A663nm為663 nm波長下吸光度。

1.3.4 苦草生理指標(biāo)測定

相對電導(dǎo)率R的測定:取大小相當(dāng)?shù)闹参锶~片，用自來水洗凈后再用蒸餾水沖洗3次，用濾紙吸干表面水分，將葉片剪成適宜長度的長條，快速稱取鮮樣3份，每份0.1 g，分別置于10 mL去離子水的刻度試管中，蓋上玻璃塞置于室溫下浸泡處理12 h，用電導(dǎo)儀(YSI EC300，美國)測定浸提液電導(dǎo)率(R1)，然后沸水浴加熱30 min，冷卻至室溫后搖勻,再次測定浸提液電導(dǎo)率(R2)。R=R1/R2×100%。

丙二醛(MDA)采用TBA法[21]測定，過氧化氫(H2O2)采用比色法測定，超氧化物歧化酶(SOD)采用羥胺法測定，過氧化氫酶(CAT)采用鉬酸銨法測定[20]，可溶性糖采用蒽酮比色法測定，可溶性蛋白采用考馬斯亮藍(lán)法[21]測定。將保存于超低溫冰箱中的新鮮植物葉片取出，用自來水沖洗干凈，然后用去離子水沖洗3次，再用濾紙將葉片表面的水分吸干。稱取1 g苦草葉片，按1∶9的比例加入磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)，用勻漿器研磨成勻漿液。分別使用MDA、H2O2、SOD、CAT、可溶性蛋白和可溶性糖試劑盒測定相關(guān)生理指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)方法參考說明書，試劑盒購買于南京建成生物工程研究所(中國，南京)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)的計(jì)算和處理使用Excel 2013，圖形的繪制和處理在Excel 2013中完成。用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié) 果

2.1 水質(zhì)及苦草生長指標(biāo)變化

根據(jù)GB3838—2002《地表水環(huán)境質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》，本研究區(qū)域內(nèi)水質(zhì)為V類水，且水質(zhì)比較穩(wěn)定(表1)。TN質(zhì)量濃度保持在1.6～1.8 mg/L之間，TP質(zhì)量濃度保持在0.020～0.035 mg/L之間，水體溫度隨季節(jié)變化較大，8月時(shí)最高，1月時(shí)最低。水體電導(dǎo)率、pH、DO無明顯變化。且靜水區(qū)與動(dòng)水區(qū)相比較，在同一時(shí)期TN、TP、溫度、pH、DO等水質(zhì)指標(biāo)均無明顯差異。靜水區(qū)流速常年處于0～2 cm/s，動(dòng)水區(qū)流速大于30 cm/s。水位常年處于30～40 cm，由于暴雨原因，8—10月多次水位升高至60 cm，2～3 d后水位下降，水位下降后植物狀態(tài)正常。

苦草的葉片長度在8月和10月有顯著性差異(P<0.05)，在水流中葉片長度較短，隨著生長期的變化，葉片長度趨于一致(圖2(a))。與靜水區(qū)中苦草葉片相比，動(dòng)水區(qū)苦草葉片在10月、12月時(shí)顯著較窄(P<0.05)，為靜水區(qū)的90%～95%。苦草生物量在不同條件下有顯著差異，靜水區(qū)中苦草生物量更高?？嗖輨偡N植時(shí)表面無生物膜，隨著時(shí)間變化，兩種水流條件下苦草葉片表面附著生物膜量有顯著差異(P<0.05)，靜水區(qū)葉片表面更容易附著生物膜。

(a) 葉片長度

(b) 葉片寬度

(c) 苦草生物量

(d) 苦草表面附著生物膜量

表1 兩種流速狀態(tài)下水質(zhì)指標(biāo)與流速分布

2.2 葉綠素及過氧化氫(H2O2)含量變化

如圖3所示，靜水區(qū)苦草葉片葉綠素總含量8—10月升高，10月后降低，與動(dòng)水區(qū)苦草葉片葉綠素總含量變化趨勢一致。調(diào)查期間，動(dòng)水區(qū)苦草葉片葉綠素總含量低于靜水區(qū)苦草的苦草葉片葉綠素總含量(P<0.05，圖3(a))。動(dòng)水區(qū)苦草葉片過氧化氫(H2O2)含量顯著高于靜水區(qū)的苦草葉片過氧化氫含量(P<0.05，圖3(b))。

(a) 葉綠素

(b) H2O2

2.3 苦草葉片可溶性蛋白及可溶性糖變化

苦草葉片在不同水流條件下可溶性蛋白質(zhì)含量變化趨勢相似，試驗(yàn)后都逐漸上升。生長在靜水區(qū)中的苦草，其葉片可溶性蛋白含量顯著低于動(dòng)水區(qū)的葉片可溶性蛋白含量(P<0.01)，表明水流影響植物葉片蛋白質(zhì)的合成(圖4(a))。如圖4(b)所示，可溶性還原糖在兩種水流條件下皆持續(xù)升高，表明兩種還原糖的產(chǎn)生與季節(jié)有相應(yīng)的聯(lián)系。同時(shí)水流對可溶性糖的合成有影響，靜水區(qū)中苦草葉片可溶性糖含量顯著低于動(dòng)水區(qū)中苦草葉片可溶性糖含量(P<0.01)。

2.4 葉片相對電導(dǎo)率、MDA以及抗氧化酶活性變化

在靜水區(qū)和動(dòng)水區(qū)，苦草相對電導(dǎo)率變化趨勢相同，隨著時(shí)間的變化相對電導(dǎo)率逐漸升高。8月和10月，動(dòng)水區(qū)中苦草葉片的相對電導(dǎo)率顯著高于靜水區(qū)(P<0.01)(圖5(a))。隨著時(shí)間的變化，

(a) 可溶性蛋白

(b) 可溶性糖

MDA的含量逐月升高，到12月時(shí)最高。10月和12月，動(dòng)水區(qū)中苦草葉片MDA含量顯著高于靜水區(qū)中苦草葉片MDA含量(P<0.05)(圖5(b))。在同一取樣時(shí)間，動(dòng)水中苦草葉片的SOD活性顯著高于靜水中的苦草葉片的SOD活性(P<0.01)(圖5(c))。兩種試驗(yàn)條件下植物葉片內(nèi)CAT活性變化差異不顯著(P>0.05)。兩組試驗(yàn)條件下苦草葉片的CAT活性隨時(shí)間有所增高(圖5(d))。

3 討 論

丁家山河的水源為珍珠泉，河道淤積較淺，水流和水質(zhì)穩(wěn)定，無明顯污染源。在采取人工措施盡量保障動(dòng)水與靜水區(qū)域底泥性質(zhì)、水質(zhì)、水深、光照和溫度等保持一致性前提下，利用單因素實(shí)驗(yàn)分析水流流速對對沉水植物的影響。與靜水條件相比，動(dòng)水條件下的植株葉片更加纖細(xì)，植株長度變短，說明苦草會(huì)調(diào)整自身形態(tài)以適應(yīng)水流?？嗖萆L前期的葉片長度在靜水中更長。這些形態(tài)的變化可能與水體流動(dòng)對植物產(chǎn)生的剪切作用力有關(guān)，水流作用下植物形態(tài)會(huì)做出相應(yīng)改變，產(chǎn)生明顯的撓曲變形[24]。Zhu等[25]研究發(fā)現(xiàn)更短生物膜又稱附著的體長有利于應(yīng)對水流的沖擊作用。隨著時(shí)間變化，動(dòng)水中的苦草的生長最終與靜水中的趨于一致，表明水流會(huì)影響苦草的生長速率，但不影響最終長度。

(a) 相對電導(dǎo)率

(b) MDA

(c) SOD

(d) CAT

微生物，是由多種不同功能的微生物自身產(chǎn)生的胞外聚合物包圍而形成，且附著在固體介質(zhì)表面、具有代謝活性的群落[26]。沉水植物及其表面附著生物膜是水體自凈體系的重要組成部分，在污染物質(zhì)轉(zhuǎn)化及維持生態(tài)平衡方面起到重要作用。Pang等[27]研究了沉水植物表面生物膜對氮的響應(yīng)，表明生物膜能有效去除氨氮。本研究中，生長在靜水區(qū)的苦草表面附著生物膜量明顯比動(dòng)水區(qū)中的高，表明靜水區(qū)有利于生物膜的形成。但是，沉水植物葉片表面附著生物膜的過量生長會(huì)影響植物的光合作用[28]，因此適當(dāng)?shù)牧魉賹λw修復(fù)有重要意義。2017年1月，靜水中的植物葉片生長有所衰老但尚無綠葉存在，而動(dòng)水中的苦草此時(shí)已經(jīng)完全腐敗。這可能是因?yàn)閯?dòng)水區(qū)的沉水植物在受低溫和水流的雙重作用下加速腐敗。

葉綠素是反映光合效率的重要指標(biāo)[29]。在研究期間，靜水條件下苦草葉綠素的含量普遍比動(dòng)水條件下的高。黃婉媚等[30]研究發(fā)現(xiàn)，全緣馬尾藻孢子體葉綠素a含量與水流速率密切相關(guān)，當(dāng)水流速度在1～4 cm/s之間時(shí)葉綠素的含量最高，流速在低于1 cm/s或高于8 cm/s時(shí)葉綠素含量較少。Madsen等[31]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)水體流速從10 cm/s增加至86 cm/s時(shí)，多種沉水植物的凈光合作用率均呈現(xiàn)顯著下降趨勢。在時(shí)間尺度上，進(jìn)入12月以后植物進(jìn)入衰敗期，因此葉綠素的水平大幅度降低，表明光合能力降低。本研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)前水流促進(jìn)了苦草的可溶性蛋白和可溶性糖合成。植物體內(nèi)的可溶性蛋白包含多種重要代謝相關(guān)酶類，常用于指示植物體總代謝變化[32]?？扇苄蕴呛客ǔＳ脕碇甘局参矬w內(nèi)的碳素營養(yǎng)狀況。為適應(yīng)逆境條件，植物會(huì)主動(dòng)積累一些可溶性還原糖，降低滲透勢，以適應(yīng)外界環(huán)境的變化[33]?？傮w來講，水流抑制了苦草光合作用，降低了苦草的生物量，但促進(jìn)了可溶性蛋白和可溶性糖含量以提高對外界脅迫的適應(yīng)能力。

MDA是細(xì)胞原生質(zhì)膜中的不飽和脂肪酸發(fā)生過氧化的產(chǎn)物，其含量常用來反映逆境或衰老過程中膜脂的破壞程度[33]。MDA含量變高，細(xì)胞膜的選擇透性降低，細(xì)胞內(nèi)電解質(zhì)外滲量增加，膜損傷會(huì)導(dǎo)致相對電導(dǎo)率發(fā)生變化[34]。水流條件下植物體內(nèi)MDA和相對電導(dǎo)率增加，說明植物受到傷害。動(dòng)水條件下，水流是水體的主要運(yùn)動(dòng)方式[35]，水體的快速流動(dòng)會(huì)裹挾泥沙，對沉水植物葉片的損傷較大，同時(shí)水流的剪切力也會(huì)損傷細(xì)胞[36]。因此相對于靜水，處在動(dòng)水中的植物細(xì)胞膜損傷更加嚴(yán)重，葉片相對電導(dǎo)率上升。在時(shí)間梯度上，溫度的降低使苦草受到環(huán)境脅迫以及衰老導(dǎo)致葉片破損加重，相對電導(dǎo)率逐月升高。

在逆境條件下，植物體內(nèi)的活性氧代謝平衡被打破，產(chǎn)生多種活性氧物質(zhì)，如H2O2，積累到一定程度之后會(huì)損傷細(xì)胞從而影響到植物的生長。SOD和CAT是植物抗氧化系統(tǒng)中的主要酶。在多種酶的共同作用下，共同維持活性氧在較低水平[37-39]。本研究中，苦草的CAT和SOD活性在動(dòng)水中更高，表明水流的作用使葉片產(chǎn)生脅迫，打破了原有的代謝平衡，過量的活性氧如H2O2誘導(dǎo)了這些酶類的合成。處于靜水區(qū)的植物由于生長不受脅迫，因此8—10月SOD活性提高不明顯，12月份以后受溫度脅迫明顯，SOD活性顯著提高。

總體上來講，與靜水區(qū)的苦草相比，本研究條件下水流降低了植物的葉綠素含量，這與植物形態(tài)變化相一致，說明植物光合系統(tǒng)受到抑制進(jìn)而對生物合成產(chǎn)生了顯著影響。另外，植物體內(nèi)H2O2含量增加，說明水流誘導(dǎo)了植物體內(nèi)活性氧合成?；钚匝跏侵参矬w內(nèi)的一種強(qiáng)氧化物質(zhì)，過量的活性氧產(chǎn)生會(huì)導(dǎo)致核酸、蛋白和生物膜受損，進(jìn)而影響植物的生長。本研究發(fā)現(xiàn)植物的MDA含量和電導(dǎo)率增加，進(jìn)一步表明植物受到了脅迫。然而，在長期進(jìn)化過程中，植物體內(nèi)也形成了一套應(yīng)對外界脅迫的機(jī)制。本研究發(fā)現(xiàn)水流條件下植物葉片可溶性還原糖和可溶性蛋白含量增加?？扇苄蕴堑脑黾涌梢蕴岣呒?xì)胞內(nèi)滲透壓，降低低溫脅迫及防止細(xì)胞溶質(zhì)泄漏，進(jìn)而對植物細(xì)胞起到一定保護(hù)作用。SOD的活性顯著增加，說明水流誘導(dǎo)植物細(xì)胞積極合成了此類蛋白，這與可溶性蛋白含量的增加相一致。由于受到水流脅迫，苦草體內(nèi)的活性氧代謝平衡被打破，活性氧物質(zhì)含量升高，引起SOD的活性升高，將過量的活性氧轉(zhuǎn)化成H2O2。H2O2可以在CAT酶的作用下分解成水和氧氣。這些物質(zhì)含量的增加，表明植物抗逆性的增加也會(huì)消耗大量的能量用于合成相關(guān)物質(zhì)，進(jìn)而對植物生長產(chǎn)生負(fù)面影響。然而，從總體來講，水流對苦草生長有一定的影響，但在當(dāng)前水流條件下并不影響其在河流生態(tài)修復(fù)中的應(yīng)用。

4 結(jié) 論

30～40 cm/s的水流速度會(huì)影響苦草生長，同時(shí)對植株形態(tài)和表面附著生物膜產(chǎn)生影響。在植物生長期間，動(dòng)水對植物葉片的可溶性蛋白和可溶性糖的合成有促進(jìn)作用。水流的脅迫作用誘導(dǎo)H2O2等活性氧上升，使得SOD、CAT等抗氧化酶活性隨之提高，以降低活性氧帶來的傷害?？傮w來講，動(dòng)水、靜水條件下沉水植物的生物量最終趨向一致，說明當(dāng)前流速對苦草生長有一定的影響，但不影響其在河道生態(tài)修復(fù)中的應(yīng)用。該結(jié)果通過植物生理指標(biāo)與水流間的響應(yīng)關(guān)系，可以更好地掌握沉水植物生長的適宜流速，這對苦草等沉水植物生態(tài)修復(fù)實(shí)踐中水流的調(diào)控具有重要的指導(dǎo)意義。由于沉水植物類型較多，植物的根系和植株結(jié)構(gòu)形態(tài)差異對水流的響應(yīng)會(huì)有較大差異，在實(shí)際河道修復(fù)過程中應(yīng)充分考慮水流流速對這些植物生長的影響。與植物的生理指標(biāo)(如過氧化氫和酶類型)相比，植物的形態(tài)指標(biāo)、葉綠素含量和葉片細(xì)胞電導(dǎo)率等指標(biāo)相對容易分析，在實(shí)踐過程中對快速判斷植物健康狀況具有重要意義。

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