楊成行，李曉婷，袁建振，馬 清

(蘭州大學草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點實驗室 蘭州大學草地農(nóng)業(yè)科技學院，甘肅 蘭州 730020)

金線蓮 (Anoectochilusroxburghii)為蘭科(Orchidaceae)開唇蘭屬多年生草本植物，主要分布于福建、浙江、廣東、海南、臺灣等東南沿海省(區(qū))及貴州、四川、湖南、云南、西藏等內(nèi)陸地區(qū)[1]。金線蓮作為珍惜名貴中草藥，其藥性平和，常用于治療幼兒發(fā)熱、急性腎炎等疾病[2-4]，在民間有“金耳環(huán)”、“鳥人參”、“金錢草”等美譽[5]；此外，由于金線蓮株形小巧優(yōu)美，葉脈金黃、呈網(wǎng)狀排列，常作為高端盆栽，或與蘭草(Eupatoriumfortunei)等盆景鑲嵌搭配，是名貴的室內(nèi)觀葉、觀花盆栽珍品[6]。因此，金線蓮具有極高的藥用價值與經(jīng)濟價值[2,6]。金線蓮屬于典型的陰生植物，零星分布于陰蔽闊葉林下肥沃的腐植土中，對生長環(huán)境要求嚴格，自然環(huán)境下難以大量繁殖[7]；加之近年來自然環(huán)境惡化以及私采濫挖泛濫，導致其野生資源瀕臨滅絕[8]。目前，利用組織培養(yǎng)技術快繁植株，不僅有利于解決野生金線蓮資源緊缺問題，而且對于該物種的種質(zhì)資源保護也發(fā)揮了積極的作用。為此，從外植體的選擇、愈傷及芽的誘導、增殖培養(yǎng)等方面對金線蓮組織培養(yǎng)快繁體系進行綜述，以期為相關科研工作者和生產(chǎn)者提供參考。

1 外植體的培養(yǎng)

1.1 外植體的選擇

外植體的選擇是影響植物組織培養(yǎng)成功與否的重要因素，不同植物的不同外植體建立組織培養(yǎng)快繁體系難易不同[9-10]。金線蓮組織培養(yǎng)外植體材料通常有種子[11]、具節(jié)莖段[12-14]、莖尖[14-15]、莖片[16-17]與葉片[14]等，各自經(jīng)過相應的滅菌方法，建立無菌體系。

1.2 消毒處理

植物組培過程中的三大難題之一即菌類污染，降低污染率是建立植物組織培養(yǎng)快繁體系的前提[18]。蘭科植物組織培養(yǎng)常用的外植體消毒試劑有75%酒精、0.1%升汞、次氯酸鈉、10%次氯酸鈣、飽和漂白粉溶液以及吐溫等[19-20]。目前，金線蓮組培消毒配合使用75%酒精和0.1%的升汞，能有效降低種子污染率。先加入75%的酒精浸泡30～60 s，用無菌水沖洗3次，再用0.1%的升汞溶液消毒15～20 min，最后用無菌水沖洗5次，可使滅菌率達到100%，且種子萌發(fā)生長良好[21-22]。

1.3 基本培養(yǎng)基的選擇

基本培養(yǎng)基是植物生長發(fā)育的主要能量來源，篩選合適的基本培養(yǎng)基是植物組織培養(yǎng)成功的基礎。目前金線蓮組培試驗使用的基本培養(yǎng)基有MS、1/2MS、N6、B5、VW等[23-24]，其中，MS培養(yǎng)基對于金線蓮愈傷組織生長的促進作用優(yōu)于其他培養(yǎng)基[25]，這可能是由于MS培養(yǎng)基相較于B5培養(yǎng)基含有更全面的營養(yǎng)成分。目前除了較為通用的MS基本培養(yǎng)基外，還有營養(yǎng)成分全減半的1/2MS基本培養(yǎng)基[26]和大量元素減少、微量元素增加的改進配方[16]。

2 金線蓮組織培養(yǎng)體系

金線蓮組織培養(yǎng)體系的建立一般通過3條途徑：一是由外植體脫分化形成愈傷組織，再誘導愈傷組織分化形成不定芽，之后將不定芽進行繼代增殖培養(yǎng)使其形成大量叢生芽，最后誘導生芽愈傷組織產(chǎn)生不定根形成新的幼苗[27]；二是誘導帶節(jié)莖段直接長出腋芽或頂芽，再對其二次繼代培養(yǎng)，最后進行生根培養(yǎng)[28]；三是在無菌條件下誘導種子萌發(fā)或通過莖尖、莖段等外植體產(chǎn)生原球莖，再由原球莖分化，進而獲得完整幼苗[26]。其中，以原球莖和帶節(jié)莖段出芽兩種方式進行增殖憑借耗時短、技術簡便的優(yōu)勢成為金線蓮大規(guī)?？旆钡闹髁鱗29](表1)。

表1 金線蓮組織培養(yǎng)快繁途徑Table 1 Tissue culture fast propagation route of Anoectochilus roxburghii

2.1 原球莖分化成芽

金線蓮原球莖的誘導與分化不僅與培養(yǎng)基組成相關，還與植株基因型有關[31]。在對金線蓮原球莖的增殖進行研究時發(fā)現(xiàn)，選擇合適的基本培養(yǎng)基能明顯促進原球莖的增殖，其中以B5培養(yǎng)基效果最優(yōu)，且附加一定量的天然有機物也有利于增殖，如加入椰汁培養(yǎng)45 d后原球莖重量平均增加6倍以上[24]。劉丹[26]卻發(fā)現(xiàn)，MS更適合于金線蓮原球莖的分化培養(yǎng)。楊柏云等[30]也認為，MS基本培養(yǎng)基更適合金線蓮原球莖的分化培養(yǎng)，并且以金線蓮莖段為外植體，添加不同濃度的6-BA(6-芐氨基腺嘌呤)、NAA(萘乙酸)、TDZ(噻苯隆)和S-3307(烯效唑)開展正交試驗，尋找原球莖誘導、增殖、分化與生根的最佳培養(yǎng)基及影響原球莖增殖與分化的主要因子，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在最適激素配比下原球莖的誘導率達93.3%，原球莖增殖的系數(shù)達9.4，芽分化率達91.7%，最適培養(yǎng)基為MS+0.4 mg·L-1TDZ+0.2 mg·L-1NAA。并且，S-3307是影響金線蓮原球莖增殖的主要因子，TDZ是影響原球莖芽分化的關鍵因子。

研究表明，在相同的培養(yǎng)條件下，不同產(chǎn)地金線蓮之間誘導原球莖的結(jié)果差異較明顯[25]，誘導容易程度以廣西金線蓮最易，臺灣金線蓮最難(表2)；此外，同種金線蓮的不同外植體誘導原球莖效果同樣差異顯著(P<0.01)，以莖段作為外植體誘導原球莖，誘導率只有66%，而以成熟種子作為外植體誘導原球莖效果最佳，在90%以上。雖然以種子作為外植體誘導原球莖最易而且產(chǎn)量較多，但以它誘導的原球莖成苗率只有51%[32]。

表2 不同產(chǎn)地金線蓮在相同激素濃度下的原球莖和芽的誘導率Table 2 Protocorm and shoot induction rate Anoectochilus roxburghii plants of different origins

2.2 帶節(jié)莖段誘導叢生芽

對金線蓮組織培養(yǎng)與快繁研究表明，與莖片、頂芽作為外植體相比，以金線蓮帶節(jié)莖段為外植體誘導叢生芽效果最佳[13,33]，且以莖段為外植體誘導產(chǎn)生的叢生芽的增殖能力明顯優(yōu)于頂芽產(chǎn)生的叢生芽[17]。

對于帶節(jié)莖段誘導叢生芽增殖這一途徑，劉潤東等[34]在添加6-BA 1.0 mg·L-1的MS培養(yǎng)基上，附加低濃度的玉米素(ZT)能明顯促進叢生芽的產(chǎn)生。郝麗麗等[35]也認為適量濃度的ZT能顯著(P<0.05)促進腋芽的發(fā)生與增殖，當添加的玉米素濃度達到0.6 mg·L-1時最有利于芽的增殖。目前對于金線蓮帶節(jié)莖段誘導叢生芽這一途徑中6-BA與NAA的作用積極與否尚存爭議，但大多傾向于6-BA/NAA在6～10倍范圍內(nèi)與有機物配合使用能有效促進腋芽的誘導與增殖[27,34-38](表3)。李艷冬等[27]發(fā)現(xiàn)，6-BA和NAA與有機物香蕉泥搭配使用時可以有效促進腋芽的誘導與增殖。羅曉青等[28]研究發(fā)現(xiàn)，6-BA和ZT激素對叢生芽增殖的效果優(yōu)于KT，增殖系數(shù)達4.3。

2.3 通過愈傷組織分化成芽

外植體和激素配比同時作用于金線蓮愈傷組織分化過程[16,39]。馮亦平等[16]以金線蓮葉和莖片作為外植體誘導愈傷組織，結(jié)果表明，莖片誘導效果遠好于葉片，并且以MS為基本培養(yǎng)基可形成大量叢生芽，在合適激素配比下誘導率可在60%以上，而以葉片誘導愈傷組織不僅時間長而且誘導率低。也有研究[39]同樣證實，以葉片作為外植體幾乎不能誘導出愈傷組織，相反莖段和莖片誘導的愈傷組織均能長出大量的不定芽。這表明金線蓮葉片難以誘導出愈傷組織，并不適合大規(guī)模應用。

研究發(fā)現(xiàn)，6-BA較2,4-D、NAA、KT對金線蓮以莖段為外植體誘導愈傷組織有明顯效果，影響強弱順序為6-BA>2,4-D>NAA>KT，各激素最佳濃度依次為1.0、2.0、0.5和0.25 mg·L-1，特別是在3.0 mg·L-12,4-D、1.0 mg·L-16-BA、0.5 mg·L-1NAA和 0.25 mg·L-1KT 的激素配比條件下效果最佳[40]。王雅英等[39]采用正交試驗進一步發(fā)現(xiàn)，6-BA和ZT是誘導金線蓮愈傷組織的主要因素，附加適量的KT可明顯提高愈傷組織的誘導率，其中，以不定芽作為外植體時，在2.0 mg·L-16-BA、0.5 mg·L-1NAA 和0.2 mg·L-1KT的激素配比條件下的愈傷組織誘導率達95%。以上研究均表明，6-BA在金線蓮愈傷組織誘導過程中起關鍵性作用。

表3 金線蓮叢生芽增殖培養(yǎng)基Table 3 Anoectochilus roxburghii bud proliferation medium

研究[30]表明，一定濃度的6-BA和NAA能促進愈傷組織誘導成芽，且當6-BA和NAA濃度比例大于1時效果最為明顯。在6-BA和NAA濃度比例大于1的基礎上，添加適量的KT能夠更好地促進芽的誘導，進而產(chǎn)生叢生芽或原球莖[7]。

2.4 金線蓮生根

植物生根受多種因素影響，如激素比例、外源有機物種類與含量等[22]。取莖段粗壯、長勢好的金線蓮幼芽轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基上誘導生根時發(fā)現(xiàn)，在激素配比為0.5 mg·L-1NAA、4.0 mg·L-1IBA和0.1 mg·L-16-BA、并附加3 g·L-1活性碳和100 g·L-1香蕉汁的條件下，金線蓮的生根率可達97%；雖然添加6-BA對生根時間、生根率及根長有較大的促進作用，但對生根數(shù)量影響不大[17]。在NAA使用方面，對福建金線蓮的研究中，在培養(yǎng)基中加入3 g·L-1的NAA有利于生根[41]，但同樣認為對于金線蓮生根數(shù)沒有顯著(P>0.05)影響[42]。此外，添加活性炭有助于根的生長，其中活性炭濃度1 g·L-1時促進作用效果最好，可在保證生根所需營養(yǎng)的同時，獲得較好的生根率并能提高根的質(zhì)量，有利于組培苗移栽[43]。

3 影響金線蓮組織培養(yǎng)的其他重要因素

3.1 光照條件的影響

目前關于金線蓮組織培養(yǎng)的研究主要集中于培養(yǎng)基配方調(diào)整上，在金線蓮培養(yǎng)與外部環(huán)境相關性方面的研究較少。金線蓮屬陰生植物，適合在蔭蔽環(huán)境下生長[44]，因此光照條件是控制其生長發(fā)育以及組織培養(yǎng)及人工栽培成功與否的關鍵環(huán)境因素[45-46]。

在蘭科植物組織培養(yǎng)早期愈傷誘導過程中，光照強度過大會催化酚類物質(zhì)氧化形成醌，導致褐化[47-48]。金線蓮組培苗的生長發(fā)育對環(huán)境光照強度同樣非常敏感，在較高或較低光照強度下，植株株高、節(jié)間長度、葉面積及干鮮重等均會受到影響[46,49]。對金線蓮組培苗生長過程中光強對其產(chǎn)生的影響研究結(jié)果表明，光強高時不利于其植株生長發(fā)育[50]。

此外，光質(zhì)對于蘭科植物蘭花的愈傷組織誘導同樣有明顯的影響，紅光/藍光比例在一定范圍內(nèi)，值越大對愈傷組織的誘導效果越好，并在比例為3∶1時能促進愈傷組織生長[51]。但Tanaka等[52]認為，藍光能促進蘭科植物原球莖的發(fā)生。相關研究也表明，光質(zhì)對于金線蓮組培苗生長發(fā)育有重要影響[53-55]。在LED光質(zhì)對金線蓮組培苗生長發(fā)育、生理變化的影響研究中，分別釆用紅、黃、藍3種LED光對福建產(chǎn)金線蓮組培苗生長形態(tài)指標以及葉綠素含量、氣孔發(fā)育的影響進行比對，試驗結(jié)果顯示，紅光與黃光處理有利于金線蓮組培苗株高增長，但兩個處理的植株較為纖細，且植株的葉綠素a和葉綠素b含量較低；藍光處理下金線蓮組培苗生長情況優(yōu)于其他兩種光處理，葉綠素含量較高，且葉面積與對照組相比增長明顯[56]。光質(zhì)雖然能對植物生長產(chǎn)生一定作用，但并不能取代激素對植物的影響，兩者更多是一種補償。

3.2 天然有機物的應用

在蘭科植物離體培養(yǎng)中常用的有機物有香蕉泥、土豆泥、椰子汁等[57-58]。它們含有豐富的有機營養(yǎng)物質(zhì)和生理活性物質(zhì)，如氨基酸、酶和激素等[59]。這些物質(zhì)對于植物發(fā)育不是必需的，但對于植物組織培養(yǎng)和再生期間細胞和組織的增殖與分化具有明顯的促進作用[60]。研究發(fā)現(xiàn)，在培養(yǎng)基中添加適量的土豆泥有利于金線蓮組培苗高度和莖直徑的增長[61](；添加適量的香蕉泥、椰子汁和蛋白胨有利于金線蓮組培苗莖和根系的生長，且香蕉泥會提高金線蓮增殖倍數(shù)[5](表4)。李艷冬等[27]研究同樣表明，在培養(yǎng)機中添加20%的香蕉泥和椰子汁能顯著促進金線蓮組培幼苗生長(P<0.01)。然而，繼代增殖培養(yǎng)基中若加入香蕉泥，則接入的莖段很容易爛掉；而在生根培養(yǎng)基中附加適量的香蕉泥，長出的植株則葉子較綠、莖部較粗壯、長勢也較好[62](表4)。因此，在金線蓮離體培養(yǎng)中可以添加適量的天然有機物，促進植株生長。但需要注意加入天然有機物質(zhì)的時間，不同階段加入有機物的效果不同。

表4 促進金線蓮組培苗生長的因素Table 4 Factors to promote the growth of the tissue culture seedlings of Anoectochilus roxburghii

4 小結(jié)

金線蓮自然繁殖效率低并且生長緩慢，因此隨著對其需求的日益增大，急需建立高效的金線蓮組織培養(yǎng)體系。金線蓮作為蘭科開唇蘭屬植物，雖然目前能從其莖段、類原球莖等途徑誘導愈傷組織，但花費時間長且誘導成功率低，因此目前金線蓮組培主要通過原球莖誘導途徑和具結(jié)莖段誘導叢生芽途徑實現(xiàn)，其中原球莖途徑增殖速度快、增殖系數(shù)高，是工廠化育苗的主要途徑。細胞分裂素和生長素是影響金線蓮外植體分化的關鍵因素，其中6-BA和NAA濃度比例在6～10范圍內(nèi)有利于外植體的分化，且TDZ對于金線蓮原球莖的誘導作用大于NAA。這與一些研究結(jié)果相同，未分化愈傷組織內(nèi)源生長素低于已分化出芽的愈傷組織[63]，內(nèi)源生長素含量升高時，其愈傷組織分化率降低，恰好與內(nèi)源細胞分裂素相反[64-65]。這表明，植物內(nèi)源激素含量調(diào)控細胞分化和生長的方向與進程，外源激素通過與內(nèi)源激素平衡調(diào)節(jié)發(fā)揮作用。因此，植物愈傷組織分化是內(nèi)源與外源激素調(diào)節(jié)下的生長素降低和細胞分裂素升高的結(jié)果。金線蓮組培過程中加入有機物不僅對外植體的分化和芽的誘導有促進作用，并且有利于組培苗的生根，但長時間加入香蕉泥等有機物則會導致植物爛根，這與有機物中的活性氧(ROS)消除相關酶有關，相關研究表明，愈傷組織分化以及不定根的誘導都與過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)等活性氧消除相關酶有關[66]。并且在植物愈傷組織分化過程中POD、CAT、SOD等ROS消除酶活性逐漸增強[67-69]?；钚匝踉诩毎l(fā)育過程中可以穿透細胞膜，對細胞造成損害[70]，不同植物細胞在分化過程中對活性氧抗性強弱不同，加入外源ROS消除相關酶能減少對細胞的損害[71]。但過量的有機物則會導致細胞缺氧，因此金線蓮組培過程中應適時適量添加有機物。此外，光照強度和光質(zhì)對金線蓮組培亦有顯著影響，其中紅光光強在一定范圍內(nèi)與愈傷組織生長呈正比，與原球莖發(fā)生呈反比，這可能與光誘導植物形態(tài)建成有關。上述研究對解決野生金線蓮資源緊缺和該物種的種質(zhì)資源保護具有積極意義。

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