劉睿 鄒蕾蕾 劉望原 錢一鋒 戴錦暉

眼球在發(fā)育過程中屈光度和眼軸之間互相協(xié)調(diào)匹配，最終消除出生時的遠視狀態(tài)形成正視眼的動態(tài)過程稱為眼球的正視化。眾所周知，視覺信息在眼球的正視化過程中發(fā)揮重要作用,視覺信息的反饋機制調(diào)控眼球的生長發(fā)育[1-4]。色覺作為視覺信息的重要組成部分，在眼正視化過程中同樣發(fā)揮重要作用。在單色光干預(yù)的豚鼠屈光發(fā)育模型中發(fā)現(xiàn)，藍光引起正視化進程延緩，同時眼軸增長延緩；綠光引起正視化進程加速，同時伴有眼軸增長加速[5-6]。

對于單色光引起的屈光度及眼軸的改變原因主要有2方面解釋：①縱向色相差導(dǎo)致的光學(xué)離焦。即藍光波長較短，聚焦在視網(wǎng)膜之前導(dǎo)致近視性離焦；綠光波長較長，成像在視網(wǎng)膜之后導(dǎo)致遠視性離焦。②不同類型視錐細胞信號輸入的差異。這種信號輸入的差異可能導(dǎo)致430 nm短波長光與530 nm中波長光形成的屈光度差異可達6.00 D，遠遠大于2種波長光之間的縱向色相差(約1.5 D)[7]。

豚鼠是一種二色視動物，在屈光發(fā)育過程中有著與人類相似的正視化進程。豚鼠視網(wǎng)膜上的S視錐細胞和M視錐細胞有著特征性的分布，即背側(cè)以M視錐細胞為主，到腹側(cè)逐漸減少；腹側(cè)以S視錐細胞為主，到背側(cè)逐漸減少，中間為2種視錐細胞的過渡區(qū)[8]。

我們在單色光干預(yù)的豚鼠屈光發(fā)育模型中，發(fā)現(xiàn)豚鼠不同視錐細胞密度也發(fā)生變化[9]。然而，不同單色光引起的豚鼠屈光變化是否受豚鼠視網(wǎng)膜上M和S視錐細胞特征性分布的影響，而導(dǎo)致背側(cè)和腹側(cè)屈光度發(fā)生不同程度改變，需進一步研究。在本研究中，我們觀察在不同波長的單色光光照下，豚鼠眼球不同部位(背側(cè)和腹側(cè))的屈光度和眼軸的改變，探討2種視錐細胞分布與屈光發(fā)育之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 飼養(yǎng)籠具和照明設(shè)置 豚鼠飼養(yǎng)于暗室環(huán)境中，飼養(yǎng)房間透光處用遮光布遮光，室內(nèi)環(huán)境保證適宜的溫度及濕度。飼養(yǎng)籠具壁內(nèi)面的四周、上方安置LED燈管，每面安裝2～3支(圖1)。將各組不同色光光照度設(shè)置為與光量子數(shù)一致。在籠具正中位置進行光量子數(shù)測量，并與籠內(nèi)豚鼠眼球基本處于同一水平面。采用電子定時器統(tǒng)一控制各組光照時間，光照周期設(shè)置為燈光交替亮滅12 h(亮燈時間8:00～20:00)。其中短波長藍光組所用LED波峰值為430 nm，半波寬為30 nm；綠光組LED波峰值為530 nm，半波寬為40 nm。對照白光組LED為色溫5 000 K的廣譜光。

1.2 驗光 實驗開始及開始后2周、4周、6周、8周及10周進行散瞳驗光，檢測均由同一位熟練的專業(yè)驗光人員完成。在驗光前進行睫狀肌麻痹去除調(diào)節(jié)，結(jié)膜囊內(nèi)每5 min滴睫狀肌麻痹藥(1%鹽酸環(huán)戊通)1次，共5次。最后一次完成后等待1 h，在暗環(huán)境中進行帶狀光檢影驗光。驗光前滴用人工淚液避免角膜干燥。每只豚鼠進行3個部位驗光：正前方(眼球中央屈光度)，上方30°(眼球背側(cè)屈光度)和下方30°(眼球腹側(cè)屈光度)。驗光時以豚鼠眼球與驗光技術(shù)人員眼之間的連線為基準(zhǔn)(手臂長度)，根據(jù)上、下方30°夾角計算出偏離基準(zhǔn)線的垂直距離，并在該距離方向上進行驗光。具體示意圖如圖2所示。保證每只豚鼠驗光時檢影鏡在眼球前同樣距離及同樣角度。每只眼重復(fù)測量3次取平均值，采用等效球鏡度(球鏡+1/2柱鏡)計入最終結(jié)果。

圖1. 豚鼠飼養(yǎng)于不同光照籠具中，光照周期為12 h/12 h(光照時間8:00～20:00)

圖2. 豚鼠腹側(cè)及背側(cè)屈光度測量示意圖 S：上方，代表背測屈光度；I：下方，代表腹側(cè)屈光度；T：顳側(cè)；N：鼻側(cè)

1.3 眼軸的測量

1.3.1 使用A超測量各組眼軸長度 測量前0.4%鹽酸奧布卡因滴眼液滴眼行角膜表面麻醉。測量時一手固定動物，一手持探頭。根據(jù)探頭前部發(fā)出的激光光點找到角膜中心，垂直于角膜表面進行測量。調(diào)整波形，選擇理想的數(shù)值記錄。重復(fù)10次取平均值。眼軸長度定義為從角膜前表面頂點到視網(wǎng)膜前表面的距離，記錄數(shù)據(jù)包括前房深度、晶狀體厚度和眼軸長度。分別于光照干預(yù)前及干預(yù)后2周、4周、6周、8周及10周進行測量。由于豚鼠及背側(cè)眼軸長度無法用A超探頭準(zhǔn)確定位，故改用冷凍切片的方式測量。

1.3.2 冷凍切片測量豚鼠背側(cè)和腹側(cè)眼軸長度 每組各取6只豚鼠過量乙醚肌內(nèi)注射麻醉后頸椎脫臼法處死，立即小心摘出眼球, 磷酸鹽緩沖液(phosphate-buffered saline, PBS)沖洗后置于冰上，顯微剪剪除眼球周圍結(jié)膜及其他結(jié)締組織。根據(jù)眼球背部鞏膜上的血管壓跡(圖3)確定眼球的鐘點方向，在12：00和6：00位置用10-0縫線標(biāo)記后放入盛滿冷凍切片包埋劑(OCT)的自制容器中。

圖3. 豚鼠眼球背面血管壓跡 TR：顳側(cè)視網(wǎng)膜；NR：鼻側(cè)視網(wǎng)膜

將眼球調(diào)整好位置，小心放入-80 ℃冰箱中冷凍，隔天取出放入切片機進行切片。在切片機上擺好眼球位置，沿矢狀面切開眼球，仔細找到縫線位置即為眼球正中。將該切面置于顯微鏡下拍照，得到眼球的矢狀位切面照片。采用Image J作圖，將晶狀體赤道部中點作為眼球的節(jié)點位置，經(jīng)過該節(jié)點及角膜頂點的連線為中央眼軸，同時取經(jīng)過該點與中央眼軸夾角為30°的直線長度作為眼球腹側(cè)與背側(cè)的眼軸長度(圖4)。

圖4. 冷凍切片眼球切面

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 13. 0 統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，實驗組及對照組數(shù)據(jù)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。2組數(shù)據(jù)的相關(guān)性檢驗采用Pearson相關(guān)分析，白光組與單色光組間差異分別做成組t檢驗，組間差異行完全隨機單因素方差分析，有差異時組間兩兩比較采用Bonferroni法。當(dāng)方差不齊時，改用Games-Howell 法，以P< 0. 05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 眼軸A超與冷凍切片法 所測中央眼軸做相關(guān)性分析，結(jié)果顯示2種檢查結(jié)果相關(guān) (R2=0.966，圖5)，2種眼軸測量方法所得結(jié)果差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=12.46,P>0.05)。

2.2 不同單色光對豚鼠視網(wǎng)膜不同部位屈光度及眼軸的影響 與白光組背側(cè)、中央以及腹側(cè)屈光度相比較，藍光組相應(yīng)部位屈光度向遠視偏移，屈光度差異從第4周開始出現(xiàn)，到第6周時趨于穩(wěn)定，第10周達到峰值。藍光組背側(cè)、中央、腹側(cè)分別偏遠視(1.75±0.21)D、(1.83±0.07)D和(2.68±0.13)D；到第10周時，冷凍切片顯示：藍光組眼軸較白光組短，背側(cè)、中央以及腹側(cè)眼軸差值分別為(0.020±0.002)mm、(0.080±0.008)mm和(0.160±0.001)mm。綠光組與白光組相比，第6周開始出現(xiàn)屈光度的差異；到第10周時，背側(cè)、中央和腹側(cè)分別為近視偏移(1.48±0.12)D、(1.23±0.02)D和(1.43±0.01)D，眼軸增長變快，差值分別為(0.090±0.005)mm、(0.050±0.005)mm和(0.020±0.003)mm。詳見圖6～9。

圖5. A超與冷凍切片所測量中央眼軸的相關(guān)性分析

圖6. 白光、藍光及綠光組各時間點背側(cè)屈光度變化

圖7. 白光、藍光及綠光組各時間點中央屈光度變化

圖8. 白光、藍光及綠光組各時間點腹側(cè)屈光度變化

圖9. 單色光照10周后豚鼠不同部位眼軸長度比較

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，不同波長的單色光干預(yù)后，豚鼠屈光度和眼軸有區(qū)域性改變，藍光干預(yù)后豚鼠屈光狀態(tài)在腹側(cè)、中央及背側(cè)均偏遠視，在S視錐細胞分布比較密集的腹側(cè)視網(wǎng)膜，豚鼠遠視更加明顯。同時冷凍切片結(jié)果提示背側(cè)、中央、腹側(cè)眼軸出現(xiàn)了相同的趨勢變化，而腹側(cè)視網(wǎng)膜方向眼軸增長延緩程度更加明顯。綠光干預(yù)后豚鼠屈光狀態(tài)在腹側(cè)、中央及背側(cè)均偏近視，相反，在M視錐細胞分布比較密集的背側(cè)區(qū)域視網(wǎng)膜，豚鼠近視更加明顯。同樣，冷凍切片分析豚鼠眼軸改變趨勢同屈光狀態(tài)改變相同，背側(cè)眼軸增長程度更顯著。

已有文獻[10-13]報道，小雞、狐貍、蟾蜍、豬、鴿子等多種動物屈光度并不是單一不變的，即隨著視網(wǎng)膜區(qū)域的不同會有不同的屈光度數(shù)。有學(xué)者[14]認(rèn)為這種屈光差異的改變與動物視網(wǎng)膜檢測位置有關(guān)，也有學(xué)者認(rèn)為與調(diào)節(jié)功能有關(guān)，即動物看地面(對應(yīng)背側(cè)視網(wǎng)膜)與看天空(對應(yīng)腹側(cè)視網(wǎng)膜)使用的調(diào)節(jié)力不同。在豚鼠中同樣出現(xiàn)了不同眼球部位屈光度與眼軸有差異的情況。豚鼠在37 d左右的正視化過程中，鼻側(cè)屈光度相對顳側(cè)偏近視約-1.70 D，背側(cè)相對于腹側(cè)偏近視約-5.20 D[15]。在本研究中發(fā)現(xiàn)，豚鼠腹側(cè)和背側(cè)的屈光度差異在出生后2周即存在，背側(cè)相對腹側(cè)近視約為-2.00 D。豚鼠在白光中經(jīng)過10周的正視化過程后，視網(wǎng)膜腹側(cè)和背側(cè)的屈光度差異增加，約為3.00 D。在經(jīng)過單色光干預(yù)10周后，豚鼠背腹側(cè)視網(wǎng)膜屈光度發(fā)生了不同的變化。我們推測這種變化的發(fā)生與豚鼠視網(wǎng)膜上視錐細胞的特征性分布以及S與M視錐細胞感受不同波長光線的敏感度不同有關(guān)。光照10周時，與白光組相比，藍光腹側(cè)視網(wǎng)膜偏遠視約為+2.68 D，眼軸長度延緩約0.16 mm，綠光組背側(cè)視網(wǎng)膜偏近視約-1.48 D，眼軸增長約0.09 mm。

豚鼠在不同單色光干預(yù)下出現(xiàn)了屈光度的過補償現(xiàn)象，這種現(xiàn)象的出現(xiàn)可能是由于S視錐細胞的過度調(diào)節(jié)以及M視錐細胞的調(diào)節(jié)不足引起[16]。本研究提示豚鼠屈光度與眼軸的變化與視錐細胞的特征性分布相一致，與視網(wǎng)膜不同部位的視錐細胞分布不同有關(guān)。M視錐細胞主要分布在背側(cè)視網(wǎng)膜，對中波長綠光比較敏感；S視錐細胞主要分布在腹側(cè)視網(wǎng)膜，對短波長綠光比較敏感。外界視覺環(huán)境會引起哺乳動物以及魚類視錐細胞色素表達和密度的改變[17-18]，我們既往研究也發(fā)現(xiàn)單色光照、形覺剝奪和光學(xué)離焦對豚鼠視錐細胞密度的影響[19-20]。豚鼠視網(wǎng)膜2種視錐細胞在單色光光照后，分布和數(shù)量均發(fā)生了相應(yīng)的改變，M視蛋白在長波長光環(huán)境中表達增加而在短波長光環(huán)境中表達減少[9]。我們推測由于不同類型的視錐細胞對短波長和中波長單色光的敏感度不同，導(dǎo)致眼球背側(cè)和腹側(cè)屈光度和眼軸出現(xiàn)不同程度的變化趨勢。

單色光可能改變了不同視錐細胞的信號對比強度，從而通過可能的以視錐細胞為主導(dǎo)的下游信號傳導(dǎo)通路進一步影響屈光發(fā)育，最終導(dǎo)致鞏膜和脈絡(luò)膜厚度的變化，引起眼軸的改變。視錐細胞影響屈光發(fā)育的機制可能包括以下2種：一是單色光直接被不同波長敏感的視錐細胞感知，再經(jīng)過光電轉(zhuǎn)換將不同波長的單色光信號轉(zhuǎn)化成電信號從而引起下游信號通路的改變；二是單色光刺激不同感光細胞數(shù)量和分布發(fā)生改變，不同的視錐細胞產(chǎn)生代謝產(chǎn)物的類型和數(shù)量可能有所不同，從而引起下游近視相關(guān)信號通路的改變。已有研究[21-22]證實，視錐細胞數(shù)量和分布的變化會直接導(dǎo)致視覺系統(tǒng)信號強度的相應(yīng)變化。

綜上所述，光照10周后，藍光組豚鼠腹側(cè)和背側(cè)視網(wǎng)膜屈光度與白光組相比均偏遠視，眼軸增長延緩，腹側(cè)視網(wǎng)膜屈光度和眼軸的改變更加明顯；綠光組腹側(cè)和背側(cè)視網(wǎng)膜屈光度均偏近視，眼軸增長加快，背側(cè)改變更明顯。這些提示豚鼠視錐細胞分布與屈光發(fā)育之間有著密切的關(guān)系，其具體信號通路有待進一步研究。

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