胡曉華 王寧 王雅杰

[摘要] 目的 研究在浸潤(rùn)性乳腺癌組織中磷酸化細(xì)胞周期檢查點(diǎn)激酶2（p-CHEK2Thr68）的表達(dá)情況，并探討其臨床意義。 方法 收集2007年1月～2011年12月第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)海醫(yī)院及黃浦區(qū)中心醫(yī)院289例乳腺癌改良根治術(shù)后病理標(biāo)本。采用免疫組化方法檢測(cè)組織中p-CHEK2Thr68的表達(dá)情況，分析其與臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系。 結(jié)果 在乳腺癌組織中p-CHEK2Thr68陽(yáng)性表達(dá)率為26.0%（75/289），癌旁組織的陽(yáng)性表達(dá)率為0%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。p-CHEK2Thr68表達(dá)率在無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組高于有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，在ER陰性組高于ER陽(yáng)性組，PR陰性組高于PR陽(yáng)性組，HER2陰性組高于HER2陽(yáng)性組，三陰性乳腺癌組高于非三陰性乳腺癌組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），而p-CHEK2Thr68的表達(dá)與患者的發(fā)病年齡、月經(jīng)狀態(tài)、組織分級(jí)、腫瘤大小、TNM分期、P53狀態(tài)無(wú)關(guān)（P > 0.05）。 結(jié)論 采用免疫組化方法檢測(cè)乳腺癌組織中p-CHEK2Thr68的表達(dá)情況以觀察其生物學(xué)行為，將有助于制訂乳腺癌患者的個(gè)體化治療方案。

[關(guān)鍵詞] 乳腺癌；p-CHEK2；免疫組織化學(xué)

[中圖分類號(hào)] R73 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2018）03（b）-0092-04

Expression and clinical significance of p-CHEK2 in invasive breast cancer

HU Xiaohua WANG Ning WANG Yajie

Department of Oncology， Changhai Hospital Affiliated to Second Military Medical University， Shanghai 200433， China

[Abstract] Objective To detect protein expression of phosphorylated chekpoint kinase 2 （P-CHEK2Thr68） in invasive breast cancer tissues and reveal the relevant clinical significance. Methods Totally 289 cases of invasive ductal breast cancer tissues were collected from January 2007 to December 2011 in Changhai Hospital Affiliated to Second Military Medical University and Shanghai Huangpu District Central Hospital. The expression of p-CHEK2Thr68 was analyzed by immunohistochemistry， and its relationship with clinicopathological parameters was analyzed. Results The positive expression rate of p-CHEK2Thr68 in breast cancer tissues was 26.0% （75/289）， the positive expression rate of the adjacent tissues was 0%， the difference was statistically significant （P < 0.05）. P-CHEK2Thr68 expression rate in the non-lymph node metastasis group was higher than the lymph node metastasis group， the ER negative group was higher than the ER positive group， the PR negative group was higher than the PR positive group， the HER2 negative group was higher than the HER2 positive group. P-CHEK2Thr68 expression rate in the tri-negative breast cancer group was higher than non-tri-negative breast cancer group， the difference was statistically significant （P < 0.05）. There was no relationships between p-CHEK2Thr68 expression and the age， menstrual status， histological grade， pathological type， tumor size， TNM stage and p53 status. Conclusion Detection of p-CHEK2Thr68 protein expression by immunohistochemistry may help to investigate the biological behavior of invasive breast cancer and to develop individualized treatment strategy.

[Key words] Breast cancer； P-CHEK2； Immunohistochemistry

乳腺癌是當(dāng)今世界范圍內(nèi)危害女性健康的惡性腫瘤之一，發(fā)病率和病死率在發(fā)展中國(guó)家逐年上升，成為當(dāng)前社會(huì)重大的公共衛(wèi)生問(wèn)題[1]。細(xì)胞周期檢測(cè)點(diǎn)激酶2（cell cycle checkpoint kinase 2，CHEK2）是由抑癌基因CHEK2編碼的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在組織細(xì)胞DNA損傷修復(fù)通路中，CHEK2是細(xì)胞DNA雙鏈斷裂損傷信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的一個(gè)重要成員，其關(guān)鍵氨基酸殘基發(fā)生磷酸化后形成p-CHEK2Thr68，通過(guò)檢查點(diǎn)機(jī)制激活下游相關(guān)分子以調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，同時(shí)激活修復(fù)相關(guān)基因使DNA損傷得以修復(fù)[2]。本研究采用乳腺癌組織芯片，通過(guò)免疫組化方法了解乳腺癌組織中p-CHEK2Thr68的表達(dá)狀況，進(jìn)而分析臨床病理參數(shù)與其相關(guān)性，并初步探討其臨床意義。

1 資料和方法

1.1 一般資料

收集2007年1月～2011年12月第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)海醫(yī)院及黃浦區(qū)中心醫(yī)院289例乳腺癌改良根治術(shù)后病理標(biāo)本。經(jīng)甲醛固定、石蠟包埋后構(gòu)建組織芯片4張。納入研究患者均為女性，年齡31～85歲，未絕經(jīng)患者119例，絕經(jīng)患者170例。腫瘤直徑≤ 2 cm共106例，腫瘤直徑> 2 cm共183例；組織學(xué)分級(jí)Ⅰ～Ⅱ級(jí)202例，Ⅲ級(jí)87例；區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽(yáng)性106例，陰性183例；ER陽(yáng)性145例，ER陰性44例；PR陽(yáng)性172例，PR陰性117例；HER2陽(yáng)性176例，HER2陰性113例。按照AJCC（american joint committee on cancer）乳腺癌TNM分期系統(tǒng)，I期70例，Ⅱ～Ⅲ期219例；ER、PR、HER2均陰性的三陰性乳腺癌患者51例。術(shù)后病理確診為單側(cè)乳房原發(fā)性乳腺癌，排除遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及炎性乳腺癌，未進(jìn)行過(guò)術(shù)前放療、化療及內(nèi)分泌和分子靶向治療，均行腋淋巴結(jié)清掃，術(shù)后病理進(jìn)行組織學(xué)分級(jí)和P53、ER、PR、HER2免疫組化檢測(cè)。90例經(jīng)同期病理確診的乳腺癌旁組織進(jìn)行對(duì)照，按相同方法制成組織芯片2張。

1.2 試劑和方法

兔抗人單克隆p-CHEK2Thr68抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology 公司，采用SP免疫組化法檢測(cè)p-CHEK2Thr68表達(dá)。標(biāo)本病理診斷經(jīng)筆者醫(yī)院兩位以上病理科醫(yī)師確定。免疫組化檢測(cè)按照試劑盒說(shuō)明書要求操作，經(jīng)脫蠟至水、pH6.0檸檬酸鹽高壓鍋熱處理抗原修復(fù)、3%H2O2阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，分別加一抗、二抗、DAB顯色、蘇木精復(fù)染。用已知p-CHEK2Thr68陽(yáng)性的乳腺癌切片作為陽(yáng)性對(duì)照，用PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.3 結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)

免疫組化染色結(jié)果均由兩位病理科醫(yī)師盲態(tài)評(píng)估確定。p-CHEK2Thr68表達(dá)定位于細(xì)胞核，結(jié)果判定采用二級(jí)計(jì)分法，按細(xì)胞核染色強(qiáng)度分為：不著色（0分）、淡黃色（1分）、棕黃色（2分）、棕褐色（3分）；按陽(yáng)性細(xì)胞百分率分別為：≤ 5%為0分，>5%～25%為1分，>25%～50%為2分，>50%～75%為3分，>75%為4分。結(jié)果綜合判定取二者分值之積：0～4分判定為p-CHEK2Thr68陰性，5～12分判定為p-CHEK2陽(yáng)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件行數(shù)據(jù)處理，p-CHEK2Thr68蛋白表達(dá)與病理參數(shù)相關(guān)性的比較采用Pearson χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 p-CHEK2Thr68在乳腺癌組織中及癌旁組織中的表達(dá)

本研究觀察到在乳腺癌組織和癌旁組織中p-CHEK2Thr68染色均在細(xì)胞核中分布，未見細(xì)胞漿染色現(xiàn)象，乳腺癌組織中p-CHEK2Thr68染色強(qiáng)度相對(duì)高于癌旁組織。見圖1（封四）。

以p-CHEK2Thr68定位于細(xì)胞核來(lái)評(píng)估表達(dá)情況，經(jīng)二級(jí)計(jì)分法判定p-CHEK2Thr68在乳腺癌中的表達(dá)率明顯高于癌旁組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見表1。

2.2 p-CHEK2Thr68表達(dá)水平與乳腺癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系

p-CHEK2Thr68在無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組的表達(dá)率高于有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，在ER陰性組高于ER陽(yáng)性組，PR陰性組高于PR陽(yáng)性組，HER2陰性組高于HER2陽(yáng)性組，在三陰性乳腺癌中高于非三陰性乳腺癌，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），而p-CHEK2Thr68的表達(dá)與患者的發(fā)病年齡、月經(jīng)狀態(tài)、組織分級(jí)、腫瘤大小、TNM分期、P53狀態(tài)之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見表2。

3 討論

CHEK2（chenkpoint kinase 2）基因位于染色體22q12.1，包含14個(gè)外顯子，編碼蛋白為543個(gè)氨基酸。激酶區(qū)位于靠近C端的功能區(qū)，很多與腫瘤相關(guān)并且影響CHEK2激酶活性的突變都位于該區(qū)[3]。在無(wú)細(xì)胞DNA損傷時(shí)，CHEK2通常以無(wú)活性的單體分布于細(xì)胞核中。當(dāng)DNA發(fā)生損傷時(shí)，尤其是發(fā)生DNA雙鏈斷裂損傷時(shí)，毛細(xì)血管擴(kuò)張性共濟(jì)失調(diào)突變（ataxia telangiectasia mutation，ATM）基因激活，進(jìn)而誘導(dǎo)CHEK2聚集到受損染色體，促進(jìn)CHEK2激酶的Thr68、Thr383和Thr387等一些關(guān)鍵氨基酸殘基的磷酸化[4-5]。

作為一種蛋白激酶，CHEK2的活化起始于Thr68位點(diǎn)的磷酸化，而后進(jìn)一步激活T-Loop環(huán)上的Thr383和Thr387位點(diǎn)，啟動(dòng)CHEK2蛋白的自磷酸化過(guò)程，形成能夠發(fā)揮生物學(xué)作用的二聚體[6]。Thr68磷酸化是CHEK2蛋白活化的重要始動(dòng)環(huán)節(jié)，最能反映CHEK2激酶的活性[7]。Carlessi等[8]發(fā)現(xiàn)多種腫瘤組織中都存在著不同程度的p-CHEK2 Thr68位點(diǎn)的磷酸化，而在正常組織、增生組織和炎性組織中未能檢測(cè)到相同現(xiàn)象。Oka[9]等也發(fā)現(xiàn)，p-CHEK2Thr68蛋白在晚期腸癌患者腫瘤組織中的表達(dá)高于正常組織和腺瘤組織。在本研究中，應(yīng)用CST公司的Phospho-Chk2（Thr68、C13C1）抗體檢測(cè)人大腸癌組織的p-CHEK2Thr68蛋白表達(dá)，該抗體被廣泛應(yīng)用于前列腺癌、口腔鱗癌、胰腺上皮內(nèi)瘤變等組織的p-CHEK2Thr68蛋白組織學(xué)檢測(cè)，具有可信的靈敏度和特異性[10-12]。本研究發(fā)現(xiàn)p-CHEK2Thr68蛋白在乳腺癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁組織，提示腫瘤組織中存在CHEK2激酶Thr68位點(diǎn)的活化。

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，CHEK2基因多態(tài)性可能是食道癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的保護(hù)性因素，但關(guān)于p-CHEK2Thr68在乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中的作用尚不明確[13-14]。本研究發(fā)現(xiàn)，p-CHEK2Thr68陽(yáng)性表達(dá)率在無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組顯著高于有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組，提示其與乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有潛在的相關(guān)性。在臨床上三陰性乳腺癌的無(wú)疾病生存時(shí)間和無(wú)進(jìn)展生存時(shí)間都相對(duì)較短，復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移性三陰性乳腺癌在治療早期緩解后很容易出現(xiàn)疾病的再次進(jìn)展[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，三陰性乳腺癌中p-CHEK2Thr68蛋白水平明顯高于非三陰性乳腺癌，提示CHEK2激酶活化和DNA損傷修復(fù)通路可能參與三陰性乳腺癌的疾病進(jìn)展。有研究表明，靶向抑制CHEK2明顯降低腫瘤細(xì)胞的DNA損傷修復(fù)功能，并且使腫瘤對(duì)化療藥物重新獲得敏感，提示CHEK2和其調(diào)節(jié)的細(xì)胞DNA損傷修復(fù)通路與腫瘤化療的耐受性密切相關(guān)[16]。Liang等[17]發(fā)現(xiàn)順鉑誘導(dǎo)的卵巢癌細(xì)胞CHEK2磷酸化依賴于野生型P53；在P53缺陷細(xì)胞，順鉑不能誘導(dǎo)CHEK2蛋白磷酸化。CHEK2抑制劑可提高順鉑對(duì)p53缺陷腫瘤細(xì)胞的療效。因此有望通過(guò)CHEK2抑制劑的聯(lián)合使用以實(shí)現(xiàn)鉑類藥物耐藥的逆轉(zhuǎn)。

相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌患者中p-CHEK2Thr68蛋白陽(yáng)性的患者較陰性患者總生存期短，提示CHEK2激酶的活化可能參與放、化療耐受，p-CHEK2Thr68表達(dá)陽(yáng)性的乳腺癌可能更易于發(fā)生放化療耐藥[18]。抑制CHEK2的功能可能會(huì)提高腫瘤治療的反應(yīng)性，逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥，改善預(yù)后[19]。近年來(lái)，針對(duì)細(xì)胞周期檢查點(diǎn)的分子靶向藥物臨床試驗(yàn)已經(jīng)在進(jìn)行中，靶向抑制CHEK2激酶將有望成為乳腺癌治療的新方向[20]。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，p-CHEK2Thr68蛋白在乳腺癌組織中的表達(dá)明顯高于癌旁組織，且與臨床病理參數(shù)相關(guān)。提示采用免疫組化方法檢測(cè)乳腺癌組織中p-CHEK2Thr68的表達(dá)情況以觀察其生物學(xué)行為，將有助于制定乳腺癌患者的個(gè)體化治療方案。

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