沈祥麗張勇柳怡 張勇武

(1.成都市錦江區(qū)婦幼保健院婦產(chǎn)科，四川 成都 610016; 2.西南醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，四川 瀘州 646000; 3.綿陽市中心醫(yī)院婦產(chǎn)科，四川 綿陽 621000)

細(xì)胞分裂素活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)p38是細(xì)胞生理及病理條件下重要的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)控激酶。該家族蛋白主要包括四個亞型，即p38α(MAPK14)、p38β(MAPK11)、p38γ(MAPK12)和p38δ(MAPK13)[1]。其中，p38α是研究最廣泛的一個亞型，其在細(xì)胞胞增殖、細(xì)胞分裂、細(xì)胞凋亡及腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中具有重要的調(diào)控作用[2]。雖然人們現(xiàn)在已發(fā)現(xiàn)p38δ也參與多種細(xì)胞行為活動的調(diào)控，但是對p38δ具體調(diào)控功能還知之甚少。p38δ在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中的調(diào)控功能是目前研究較為深入的領(lǐng)域。人們發(fā)現(xiàn)，不同的腫瘤組織細(xì)胞中，p38δ的調(diào)控功能不同。在人類原發(fā)性皮膚鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞、膽管癌細(xì)胞及肝癌細(xì)胞中，p38δ的表達(dá)量上升，并且促進(jìn)腫瘤的增殖、遷移與侵襲[3-5]；而在食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞、惡性胸膜間皮瘤和原發(fā)性皮膚黑色素瘤中，p38δ表達(dá)水平特異性降低。并且在這些腫瘤細(xì)胞中過表達(dá)p38δ將會促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡或抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移[6-8]。在宮頸癌細(xì)胞系HeLa細(xì)胞中，研究者發(fā)現(xiàn)p38δ表達(dá)水平降低[9]。但是目前還沒有報道指出p38δ對宮頸癌發(fā)生發(fā)展的調(diào)控作用。順鉑是一種被廣泛用于各種腫瘤治療的化療藥物，其通過與細(xì)胞內(nèi)親核大分子相互作用來抑制細(xì)胞循環(huán)、促進(jìn)細(xì)胞凋亡，具有抗癌譜廣、作用強的特點。在宮頸癌治療過程中，順鉑常被作為基礎(chǔ)化療藥物。但是，患者接受順鉑治療的過程中，容易產(chǎn)生耐藥性,該過程與胞內(nèi)蓄積藥物流出、DNA修復(fù)過程中順鉑物過度消除及細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)蛋白表達(dá)異常等病理變化相關(guān)。增強癌細(xì)胞對順鉑的敏感度將會有效提高治療效果。目前，促進(jìn)細(xì)胞凋亡是降低順鉑耐藥性的主要手段。本實驗通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染的方法在HeLa細(xì)胞中過表達(dá)p38δ，探討在順鉑處理條件下p38δ對HeLa細(xì)胞凋亡的影響，從而為降低宮頸癌治療過程中順鉑耐藥性提供新的思路和方法。

1 材料與方法

1.1 材料和主要試劑 HeLa細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫；DMEM培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶和胎牛血清購自美國Gibco公司；細(xì)胞蛋白提取試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；p38δ野生型表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-p38δ(WT)、p38δ激酶失活突變體(第54位賴氨酸突變?yōu)榫彼?表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-p38δ(K54R)[10]及對照質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-Vector購自上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司；PVDF膜、Protein A/G磁珠及蛋白酶抑制劑Cocktail購自美國Millipore公司； p38δ兔單克隆抗體、Bax兔多克隆抗體、p53兔單克隆抗體、Bcl-2兔多克隆抗體及β-actin鼠單克隆抗體皆購自美國Abcam公司；p38磷酸化(phospho p38(T180/Y182))兔單克隆抗體購自美國cell signal 公司；細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑lipofectamine 3000、羊抗兔熒光二抗、羊抗鼠熒光二抗、BCA法蛋白濃度測定試劑盒、預(yù)染蛋白Maker皆購自美國Thermo 公司；Annexin V-異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate, FITC)/碘化丙啶 (Propidium Iodide，PI)雙染色細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；順鉑購自美國Sigma公司；5810R 型離心機購自德國Eppendorf 公司；ChemiDoc MP全能型凝膠成像分析系統(tǒng)購自美國Bio-Rad 公司；Nikon 50i正置顯微鏡(帶高清CCD DP72攝像頭)購自日本尼康公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 液氮中取出細(xì)胞后迅速置于37℃水浴鍋中解凍，然后與5 ml細(xì)胞培養(yǎng)液(10%胎牛血清 DMEM培養(yǎng)液)混勻，500 ×g離心5 min，將細(xì)胞重懸于8 ml細(xì)胞培養(yǎng)液后移至10cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，細(xì)胞培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)(37℃, 5% CO2)。每天更換一次培養(yǎng)液。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將HeLa細(xì)胞接種至24孔板(1×105細(xì)胞/孔)或6孔板(4×105細(xì)胞/孔)中，培養(yǎng)過夜。細(xì)胞接種12-16 h后，進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染；按照lipofectamine 3000說明書配制質(zhì)粒-轉(zhuǎn)染試劑混合液，24孔板細(xì)胞每孔轉(zhuǎn)染質(zhì)粒1μg，6孔板細(xì)胞每孔轉(zhuǎn)染質(zhì)粒4 μg。質(zhì)粒-轉(zhuǎn)染試劑混合液室溫放置20 min后加入培養(yǎng)板內(nèi)(細(xì)胞培養(yǎng)液提前更換為DMEM培養(yǎng)液)；細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，將DMEM培養(yǎng)液更換為細(xì)胞完全培養(yǎng)液，正常培養(yǎng)。

1.2.3 順鉑處理 HeLa細(xì)胞按細(xì)胞轉(zhuǎn)染過后正常培養(yǎng)24 h，將細(xì)胞培養(yǎng)液更換為含有對照藥物溶劑二甲亞砜(Dimethyl Sulphoxide，DMSO)或含有DMSO-順鉑的新鮮完全培養(yǎng)液，其中順鉑終濃度為10 μg/ml，繼續(xù)培養(yǎng)24 h；取出順鉑處理后的細(xì)胞，進(jìn)行蛋白提取或細(xì)胞凋亡檢測。

1.2.4 蛋白質(zhì)印跡法檢測蛋白表達(dá)水平 按照蛋白提取試劑盒說明書提取細(xì)胞蛋白后，采用BCA法測定蛋白濃度。依照蛋白質(zhì)印跡法電泳系統(tǒng)進(jìn)行SDS-PAGE分離蛋白，每孔上樣50 μg。蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜后5% 脫脂奶粉 TBST溶液室溫封閉1 h，一抗(1:500)4℃孵育過夜，TBST漂洗3次，每次15 min。二抗(1:1000)避光室溫孵育1 h，TBST漂洗3次，每次15 min。采用百樂ChemiDoc MP全能型凝膠成像分析系統(tǒng)掃摸拍照。利用image J軟件分析目的條帶灰度值，目的蛋白表達(dá)水平以目的蛋白與β-actin的比值表示。

1.2.5 p38δ蛋白磷酸化水平檢測 HeLa細(xì)胞接種于6孔板后，按照細(xì)胞轉(zhuǎn)染所述轉(zhuǎn)染p38δ表達(dá)質(zhì)粒，然后按照1.2.3所述進(jìn)行順鉑處理。順鉑處理后，除去培養(yǎng)液，冷PBS洗3次, 每孔加入200 μl NP-40 細(xì)胞裂解液(1% NP-40，150 mM NaCl，50 mM Tris，1 mM EDTA， pH 8.0，用前加入蛋白酶抑制劑Cocktail)，冰浴裂解30 min。收集裂解液， 4℃，14000 ×g，離心15 min。收集上清，取10 μl上清液加入10 μl 2×SDS 上樣緩沖液，作為全細(xì)胞裂解液(Lysate)；其余上清液移入另一EP管中，加入p38δ兔單克隆抗體2 μg，4℃ 旋轉(zhuǎn)結(jié)合2 h。加入10 μl protein A/G 磁珠，4℃ 旋轉(zhuǎn)結(jié)合1 h。NP-40細(xì)胞裂解液洗珠子3次后，加入10 μl 2×SDS 上樣緩沖液，振蕩混勻，作為免疫沉淀(immuoprecipitation，IP)產(chǎn)物。蛋白質(zhì)印跡法檢測IP產(chǎn)物中p38δ磷酸化蛋白量(p-p38δ)和總p38δ(p38δ)蛋白表達(dá)量。p38δ蛋白磷酸化水平以p-p38δ與p38δ比值表示。

1.2.6 Annexin V-FITC/PI 雙染熒光顯微鏡檢測細(xì)胞凋亡 將HeLa細(xì)胞接種于24孔板(105細(xì)胞/孔)，進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及順鉑處理。按照Annexin V-FITC/PI染色細(xì)胞凋亡檢測試劑盒收集細(xì)胞。細(xì)胞經(jīng)PBS清洗后重懸于400 μl Binding buffer(試劑盒提供)，然后加入5 μl Annexin V-FITC和10 μl PI染色液，室溫染色15 min。按照試劑盒說明書將染色后的細(xì)胞重懸于50 μl Binding buffer，取5 μl重懸液滴于干凈載玻片并扣蓋蓋玻片，熒光顯微鏡下觀察并拍照，其中Annexin V-FITC采用波長488 nm激發(fā)光，PI采用波長568 nm激發(fā)光。Anneixn V陽性細(xì)胞代表凋亡發(fā)生細(xì)胞。采用image J軟件對細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)。本實驗細(xì)胞凋亡水平以Anneixn V陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)表示。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 數(shù)據(jù)處理用SPSS17.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((x ±s)表示，比較采用t檢驗，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HeLa細(xì)胞轉(zhuǎn)染后其p38δ蛋白表達(dá)水平升高 蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染對照質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-Vector HeLa細(xì)胞中，p38δ表達(dá)水平極低；轉(zhuǎn)染p38δ表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-p38δ HeLa細(xì)胞中，p38δ成功高表達(dá)，見圖1。

2.2 p38δ過表達(dá)促進(jìn)HeLa細(xì)胞凋亡 Annexin V-FITC/PI雙染色熒光顯微鏡細(xì)胞凋亡檢測實驗結(jié)果顯示：在對照處理條件下(DMSO組)，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-Vector 質(zhì)粒 的HeLa細(xì)胞和轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-p38δ質(zhì)粒的HeLa細(xì)胞凋亡水平分別是(7.95±2.33)%和(37.19±4.71)%，經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=18.043，p =0.003)，后者細(xì)胞凋亡水平顯著上升。在順鉑處理條件下(Cisplatin組)，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-Vector質(zhì)粒的 HeLa細(xì)胞和轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-p38δ質(zhì)粒的HeLa細(xì)胞凋亡水平分別是(23.14±2.71)%和(53.02±4.69)%，經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=7.095，p =0.019)，后者細(xì)胞凋亡水平也顯著上升，見圖2。

圖1蛋白印跡法檢測HeLa細(xì)胞轉(zhuǎn)染后p38δ表達(dá)水平

Figure1Theexpressionofp38δinHeLacellsaftertransfectedindicatedplasmids

注：pcDNA3.1(+)-Vector： 對照質(zhì)粒； pcDNA3.1(+)-p38δ： p38δ表達(dá)質(zhì)粒

2.3 HeLa細(xì)胞中p38δ過表達(dá)上調(diào)順鉑處理條件下Bax和p53蛋白表達(dá)水平，同時下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)水平 蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果顯示：在對照處理條件下(DMSO組)，與轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-Vector HeLa細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-p38δ HeLa細(xì)胞中Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)水平變化不大，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，而p53蛋白表達(dá)水平增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=9.123，P=0.012)；在順鉑處理條件下(Cisplatin組)，與轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-Vector HeLa細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-p38δ HeLa細(xì)胞中: Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=100.736，P<0.001); Bax蛋白表達(dá)水平顯著上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=17.761，P=0.003)(圖3A、表1); p53蛋白表達(dá)水平顯著上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=13.524，p =0.005)(見圖3A、表1)。此外，不同濃度順鉑處理結(jié)果顯示，隨著順鉑作用濃度增高，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)-p38δ HeLa細(xì)胞中Bax、p53蛋白表達(dá)水平隨之增加，而Bcl-2蛋白表達(dá)水平變化不大，見圖3B。

圖2 p38δ過表達(dá)對HeLa細(xì)胞凋亡的影響Figure 2 The effect of p38δ overexpression on apoptosis of HeLa cells

注： pcDNA3.1(+)-Vector. 轉(zhuǎn)染對照質(zhì)粒； pcDNA3.1(+)-p38δ.轉(zhuǎn)染p38δ表達(dá)質(zhì)粒 ；DMSO.對照處理；Cisplatin.順鉑處理(10 ug/ml，24h)；標(biāo)尺長度代表300 uM

圖3 p38δ過表達(dá)對HeLa 細(xì)胞凋亡相關(guān)基因蛋白表達(dá)水平的影響Figure 3 The effect of p38δ overexpression on the protein expression of apoptosis related genes in HeLa cells

注：A. 轉(zhuǎn)染不同質(zhì)粒的HeLa細(xì)胞經(jīng)對照處理或順鉑處理(10 ug/ml，24 h)后，蛋白印跡法檢測Bcl-2、Bax和p53蛋白表達(dá)水平；B.轉(zhuǎn)染不同質(zhì)粒的HeLa細(xì)胞經(jīng)不同濃度順鉑處理24 h后，蛋白印跡法檢測Bcl-2、Bax和p53蛋白表達(dá)水平; pcDNA3.1(+)-Vector： 轉(zhuǎn)染對照質(zhì)粒； pcDNA3.1(+)-p38δ： 轉(zhuǎn)染p38δ表達(dá)質(zhì)粒 ；DMSO：對照處理；Cisplatin：順鉑處理

2.4 順鉑處理上調(diào)p38δ磷酸化水平 對照處理HeLa細(xì)胞中(DMSO組)，p38δ第180位蘇氨酸/ 182位酪氨酸(T180/Y182)磷酸化水平(p-p38δ(T180/Y182)/ p38δ)為0.28±0.02；順鉑處理HeLa細(xì)胞中(Cisplatin 組)，p38δ T180/Y182磷酸化水平為0.83±0.01。經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=34.676, p =0.001)，Cisplatin 處理后p38δ T180/Y182磷酸化水平顯著上升，見圖4。

圖4 順鉑處理對 p38δ磷酸化水平的影響Figure 4 the effect of cisplatin on p38δphosphorylation

注：IP.免疫沉淀組分；Lysate.全細(xì)胞裂解液組分； DMSO.對照處理；Cisplatin.順鉑處理(10 ug/ml，24h)

2.5 p38δ調(diào)控HeLa細(xì)胞凋亡依賴于其蛋白激酶活性 蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果顯示，HeLa細(xì)胞轉(zhuǎn)染p38δ野生型表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-p38δ(WT)和p38δ激酶失活突變體表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-p38δ(K54R)后， p38δ(WT/K54R)在HeLa細(xì)胞中成功高表達(dá)(見圖5A)。Annexin V-FITC/PI雙染色熒光顯微鏡細(xì)胞凋亡檢測實驗結(jié)果顯示：在正常培養(yǎng)條件下，HeLa細(xì)胞轉(zhuǎn)染p38δ野生型表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-p38δ(WT)和p38δ激酶失活突變體表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-p38δ(K54R)后細(xì)胞凋亡水平分別是(36.88±2.69)%和(9.32±2.03)%，經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=43.899，p =0.001)，激酶失活突變體p38δ(K54R)能夠顯著降低HeLa細(xì)胞凋亡水平(見圖5B)；在順鉑處理條件下，轉(zhuǎn)染p38δ野生型表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-p38δ(WT)的HeLa細(xì)胞凋亡水平和轉(zhuǎn)染p38δ激酶失活突變體表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-p38δ(K54R)的HeLa細(xì)胞凋亡水平分別是(54.88±4.21)%和(25.71±3.23)%，經(jīng)t檢驗，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=15.932， p =0.004)，激酶失活突變體p38δ(K54R)同樣能夠顯著降低HeLa細(xì)胞凋亡水平(見圖5C)。

3 討論

3.1 p38δ促進(jìn)HeLa細(xì)胞凋亡并增強其對順鉑的敏感性 Yong 等[9]克隆鑒定p38δ時指出，在宮頸癌HeLa細(xì)胞中p38δ低表達(dá)。本實驗采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染表達(dá)質(zhì)粒的方法，在HeLa細(xì)胞中成功高表達(dá)p38δ；同時發(fā)現(xiàn)在HeLa細(xì)胞中內(nèi)源性p38δ表達(dá)水平極低，這與Yong 等[9]研究結(jié)果一致。p38家族蛋白激酶參與眾多細(xì)胞行為的調(diào)控，如細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡等等。最近研究表明p38δ在細(xì)胞凋亡方面也有重要的調(diào)控作用。在角質(zhì)細(xì)胞中，軟海綿酸可以激活p38δ，并且誘導(dǎo)角質(zhì)細(xì)胞凋亡[11]。另外，在食管鱗狀細(xì)胞癌中過表達(dá)p38δ將會提高細(xì)胞在順鉑處理條件下的凋亡水平，從而提高細(xì)胞對順鉑的敏感度[7]。本研究結(jié)果顯示，當(dāng)HeLa細(xì)胞中過表達(dá)p38δ蛋白時，細(xì)胞的凋亡水平明顯上升，這與p38δ在角質(zhì)細(xì)胞中調(diào)控細(xì)胞凋亡的功能一致。在腫瘤治療方面，癌細(xì)胞對化療藥物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的耐受，一直是困擾癌癥治療的臨床問題[12]。本研究中檢測了p38δ對順鉑誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡的影響，實驗結(jié)果表明，HeLa細(xì)胞中過表達(dá)p38δ能夠顯著提高細(xì)胞對順鉑的敏感度，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。該結(jié)果與p38δ對食管鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞凋亡的調(diào)控一致。在腫瘤治療過程中，增強癌細(xì)胞對治療藥物的敏感度，提高癌細(xì)胞凋亡水平，是獲得良好治療效果的關(guān)鍵。p38δ有望成為宮頸癌輔助治療的新靶點。

圖5 p38δ激酶失活突變體對HeLa細(xì)胞凋亡的影響Figure 5 The effect of Kinase-dead mutant of p38δ on HeLa cell apoptosis

注：A.蛋白印跡法檢測轉(zhuǎn)染不同質(zhì)粒的HeLa細(xì)胞中p38δ表達(dá)水平；B.HeLa細(xì)胞轉(zhuǎn)染不同質(zhì)粒后，Annexin V-FITC/PI雙染色和熒光顯微鏡檢測細(xì)胞凋亡(標(biāo)尺長度代表300 uM)；C.轉(zhuǎn)染不同質(zhì)粒的HeLa細(xì)胞經(jīng)順鉑處理(10 ug/ml 24 h)后，Annexin V-FITC/PI雙染色和熒光顯微鏡檢測細(xì)胞凋亡(標(biāo)尺長度代表300 uM)； pcDNA3.1(+)-Vector. 轉(zhuǎn)染對照質(zhì)粒； pcDNA3.1(+)-p38δ(WT). 轉(zhuǎn)染野生型p38δ表達(dá)質(zhì)粒 ； pcDNA3.1(+)-p38δ(K54R).轉(zhuǎn)染激酶失活突變體p38δ表達(dá)質(zhì)粒

3.2 p38δ通過上調(diào)促凋亡因子蛋白表達(dá)水平和下調(diào)抗凋亡因子蛋白表達(dá)水平調(diào)控HeLa細(xì)胞凋亡 調(diào)控細(xì)胞凋亡是眾多細(xì)胞信號通路相互作用的結(jié)果。Bcl-2是一個重要的抗凋亡因子，其表達(dá)量下調(diào)促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。與Bcl-2功能相反的Bax蛋白，也可以作為凋亡水平指示因子，其在凋亡信號刺激下，進(jìn)入線粒體，最終介導(dǎo)線粒體膜間隙的凋亡信使——細(xì)胞色素c進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，激活細(xì)胞凋亡進(jìn)程[13]。宮頸癌細(xì)胞經(jīng)放射治療后，Bax蛋白表達(dá)量升高和Bcl-2表達(dá)量降低將會顯著提高宮頸癌細(xì)胞的凋亡水平[14]。HeLa細(xì)胞中，順鉑對細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)依賴于Bcl-2基因表達(dá)水平的降低和Bax表達(dá)水平的上升[15]。毛蕊異黃酮-7--β--葡萄糖苷可以促進(jìn)HeLa細(xì)胞凋亡，同時誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞中Bcl-2表達(dá)量下調(diào)和Bax表達(dá)量上調(diào)[16]。那么，在HeLa細(xì)胞中，p38δ調(diào)控細(xì)胞凋亡是否也與Bcl-2/Bax相關(guān)？本實驗結(jié)果表明，在順鉑處理條件下，p38δ可以顯著降低Bcl-2蛋白表達(dá)水平，同時提高Bax蛋白表達(dá)水平。該結(jié)果與前述研究結(jié)論一致。該結(jié)果提示我們，在HeLa細(xì)胞中，p38δ可能通過調(diào)控Bcl-2/Bax信號通路來調(diào)控細(xì)胞的凋亡。線粒體膜間隙細(xì)胞色素c的釋放是Bcl-2/Bax調(diào)控細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵。有報道指出，在抗癌藥物去甲斑蝥素(norcantharidin)誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡的過程中，p38介導(dǎo)Bcl-2蛋白表達(dá)水平下調(diào)、Bax蛋白向線粒體轉(zhuǎn)運及細(xì)胞色素c的釋放[17]。至于p38δ介導(dǎo)的HeLa細(xì)胞凋亡，是否與Bax蛋白向線粒體轉(zhuǎn)運及細(xì)胞色素c的釋放有關(guān)，還需進(jìn)一步的研究來證明。除了Bcl-2、Bax外，p53蛋白也是一個重要的細(xì)胞凋亡調(diào)控因子。最近報道指出非編碼RNA VTRNA2-1-5p可以通過作用于p53 mRNA的非編碼區(qū)，而降低p53的表達(dá)水平，最終降低宮頸癌細(xì)胞的凋亡水平，促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞的增殖與侵襲[18]。雷公藤甲素可以誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞的凋亡，而這一過程依賴于p53和Bax蛋白的表達(dá)量上調(diào)[19]。另外，在宮頸癌組織中過表達(dá)p53蛋白，可以誘導(dǎo)宮頸癌細(xì)胞的凋亡，從而提高腫瘤的治療效果[20]。本實驗結(jié)果表明，HeLa細(xì)胞中過表達(dá)p38δ可以誘導(dǎo)p53蛋白表達(dá)水平的上升，提示我們在正常培養(yǎng)條件下，p38δ對HeLa細(xì)胞的調(diào)控可能與p53蛋白表達(dá)量的上調(diào)有關(guān)。另外，本實驗發(fā)現(xiàn)，在順鉑處理條件下，p38δ可以顯著上調(diào)HeLa細(xì)胞中p53蛋白水平。在紫外照射誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡過程中，p38可以磷酸化p53蛋白第33位絲氨酸和46位絲氨酸，促進(jìn)p53蛋白的穩(wěn)定，從而促進(jìn)p53依賴的細(xì)胞凋亡發(fā)生[21]。在HeLa細(xì)胞中，p53也可能是p38δ調(diào)控細(xì)胞凋亡過程中的直接作用底物。有報道指出，人乳頭瘤病毒HPV18基因序列中的癌基因E6可以抑制宮頸癌細(xì)胞中p53基因的表達(dá)和誘導(dǎo)p53蛋白水平的降低[22-24]。人乳頭瘤病毒是誘發(fā)宮頸癌的主要因素之一，p38δ表達(dá)水平的下調(diào)以及p38δ對p53表達(dá)水平的調(diào)控是否與人乳頭瘤病毒有關(guān),還需進(jìn)一步的研究證明。p53既可以進(jìn)入細(xì)胞核，作為轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控靶基因的表達(dá)，又可以游離于細(xì)胞質(zhì)或進(jìn)入其他細(xì)胞器調(diào)控其它效應(yīng)分子的活性或功能。定位于核中的p53蛋白可以誘導(dǎo)凋亡相關(guān)基因的表達(dá)(如Bax、Noxa)；細(xì)胞質(zhì)中的p53可以與抗凋亡因子(如Bcl-2蛋白家族成員)相互作用來減弱后者的抗凋亡功能[25]。這就提示我們，順鉑處理條件下，過表達(dá)p38δ的HeLa細(xì)胞中，Bcl-2、Bax表達(dá)水平的改變，可能是由于p53蛋白直接調(diào)控Bcl-2、Bax基因轉(zhuǎn)錄水平所致。

3.3 p38δ通過蛋白激酶活性調(diào)控HeLa細(xì)胞凋亡 蛋白激酶活性是p38家族蛋白行使其調(diào)控功能的關(guān)鍵。對于p38家族蛋白而言，位于激酶結(jié)構(gòu)域中蘇氨酸-甘氨酸-酪氨酸(TGY)模序的雙位點磷酸化(對應(yīng)于p38δ中第180位的蘇氨酸和182位的酪氨酸磷酸化)是其蛋白激酶活性獲得的關(guān)鍵[26]。被磷酸化的p38δ獲得激酶活性后，通過與底物相互作用，并將后者絲氨酸或蘇氨酸磷酸化，從而改變底物的活性或功能，完成對細(xì)胞信號的傳遞。所以，檢測p38δ蛋白第180位酪氨酸和182位絲氨酸的磷酸化水平，可以評估p38δ是否被激活。本實驗結(jié)果表明，順鉑處理可以誘導(dǎo)p38δ磷酸化水平的上調(diào)，提示p38δ對HeLa細(xì)胞凋亡可能與其蛋白激酶活性相關(guān)。另外，本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，激酶失活突變可以顯著降低p38δ對HeLa細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用。蛋白激酶對細(xì)胞信號的傳遞往往通過對底物的磷酸化來完成。綜上所述，p38δ對宮頸癌HeLa細(xì)胞順鉑敏感性的調(diào)控可能通過磷酸化Bcl-2、Bax及p53蛋白本身或其上游調(diào)控因子來完成，該調(diào)控通路的具體分子機制還需進(jìn)一步的研究來揭示。

4 結(jié)論

本研究通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染和藥物處理實驗，發(fā)現(xiàn)宮頸癌細(xì)胞系HeLa細(xì)胞中過表達(dá)p38δ可以提高HeLa細(xì)胞對順鉑的敏感度，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，從而為宮頸癌的治療提供新的方法和思路。

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