袁媛，馮鴻杰，師勇強，趙麗紅，魏鋒，馮自力，朱荷琴

（棉花生物學(xué)國家重點實驗室/中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所，河南安陽455000）

棉花黃萎病自20世紀(jì)90年代以來在我國廣大棉區(qū)的發(fā)生為害日益加重，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，是制約我國棉花生產(chǎn)的主要因素之一，但目前仍無非常有效的防治方法。植物源農(nóng)藥是指利用植物有機體的全部或部分有機物質(zhì)及其次生代謝物質(zhì)加工而成的制劑，包括從植物中提取的活性成分、植物本身和按活性結(jié)構(gòu)合成的化合物及衍生物；因此，其具有安全無污染、環(huán)境友好的特點。目前，已經(jīng)有多種植物源活性成分的農(nóng)藥取得登記并成功應(yīng)用，如2.5%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同）魚藤酮乳油、0.5%楝素乳油等[1]。五倍子（Galla chinensis）系癭綿蚜科的蚜蟲在其寄主漆樹科鹽膚木屬植物的不同部位形成的蟲癭。五倍子的主要化學(xué)成分是鞣質(zhì)類，如五倍子鞣質(zhì)、縮合沒食子鞣質(zhì)等；還含有脂肪、樹脂、蠟質(zhì)、烏氨酸等[2]，這些化學(xué)成分具有較強的抑菌作用[3]。筆者室內(nèi)測定了五倍子粗提液對棉花黃萎病菌——大麗輪枝菌（Verticillium dahliaeKleb.）的抑菌活性，并于2016―2017年進(jìn)行田間試驗，研究其對棉花黃萎病的防治效果，為開發(fā)防治棉花黃萎病的新型植物源農(nóng)藥提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 棉花黃萎病致病菌菌株

分離自我國黃河流域棉區(qū)、長江流域棉區(qū)及新疆植棉區(qū)的大麗輪枝菌強致病力菌株Vd080（河北辛集）、Vd147（湖北荊州）和 Vd021（新疆庫爾勒）[4]，由本實驗室保存。

1.2 棉花品種

耐黃萎病棉花品種魯棉研21。

1.3 五倍子活性物質(zhì)提取

五倍子從當(dāng)?shù)刂兴幉拈T市購買。將五倍子在50℃的恒溫鼓風(fēng)干燥箱中烘干至質(zhì)量恒定，然后機械粉碎至粒徑0.425 mm。將上述粉碎的五倍子與水按比例混合（質(zhì)量比為1∶2），浸泡2 h后，于磁力攪拌加熱器上，300℃加熱煮沸30 min，冷卻后經(jīng)紗布濾出粗提液。向濾渣加入2倍體積的水，重復(fù)上述提取過程2遍，將3次所得粗提液合并，即獲得五倍子粗提液，于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 試驗方法

1.4.1五倍子粗提液對黃萎病菌菌落生長抑制效果測定。制備查氏培養(yǎng)液：蔗糖30 g、NaNO32 g、Mg-SO4·7H2O 0.5 g、K2HPO41.31 g、FeSO40.02 g、KCl 0.5g，加入800 mL蒸餾水?dāng)嚢枞芙?，調(diào)節(jié)pH至7.0，加蒸餾水定容至1 L，分裝后，121℃高壓滅菌20 min。用于制備大麗輪枝菌孢子液和收集菌絲（添加100 mg·L－1的硫酸鏈霉素，防止細(xì)菌污染）。取100 μL大麗輪枝菌菌液在馬鈴薯葡萄糖瓊脂平板培養(yǎng)基（Potato dextrose agar medium，PDA）上 25℃活化5 d，接入查氏培養(yǎng)液中，震蕩培養(yǎng)4～5 d，用血球計數(shù)板計數(shù)并用無菌水調(diào)配至菌液濃度為1×107CFU （Colony forming unit）·mL－1。 制作五倍子粗提液體積分?jǐn)?shù)為0.2%、0.6%和1.0%的PDA，在其中央加入5 μL大麗輪枝菌查氏培養(yǎng)液，于25℃恒溫培養(yǎng)，5次重復(fù)，分別于5 d、7 d、9 d和11 d后測定菌落直徑，以不含五倍子粗提取液的PDA為對照，計算菌落生長抑制率（IG）。計算公式：IG（%）＝（dCK－dT）/dCK×100。 式中：dCK為對照菌落直徑，dT為處理菌落直徑。

1.4.2五倍子粗提液對大麗輪枝菌孢子產(chǎn)量的抑制效果測定。將含大麗輪枝菌的查氏培養(yǎng)液50 μL接入25 mL含有不同體積分?jǐn)?shù) （0.2%、0.6%和1.0%）五倍子粗提液的查氏培養(yǎng)液中，于150 r·min－1振蕩培養(yǎng)6 d，用血球計數(shù)板（每重復(fù)查80個小格）測定產(chǎn)孢量，計算產(chǎn)孢量抑制率（IS）。計算公式：IS（%）＝（NCK－NT）/NCK×100。 式中：NCK為對照產(chǎn)孢量，NT為處理產(chǎn)孢量。

1.4.3五倍子粗提液對棉花黃萎病的防治效果試驗。2016年以50倍的五倍子粗提液（配以一定比例的分散劑）在棉花黃萎病的發(fā)生期7月4日、7月14日、7月24日和8月4日在同一小區(qū)持續(xù)進(jìn)行葉面噴霧，于7月14日、7月24日和8月7日和8月17日對棉花黃萎病的發(fā)病情況進(jìn)行調(diào)查。在2016年試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，2017年采用40倍、80倍和160倍的五倍子粗提液 （配以一定比例的分散劑）于5月31日、6月12日、6月22日、7月21日進(jìn)行噴霧，6月29日和7月28日調(diào)查黃萎病發(fā)生情況。棉花黃萎病苗期病害調(diào)查分級標(biāo)準(zhǔn)：0級，健康植株，無病狀；1級，1或2片子葉發(fā)病，真葉無病狀；2級，子葉和1片棉苗真葉表現(xiàn)病狀；3級，2片棉苗真葉表現(xiàn)病狀；4級，葉片全部都表現(xiàn)病狀，頂心枯死[5]。大田試驗均在中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所南場（河南省安陽縣）病圃進(jìn)行，2年試驗每次處理均為4行區(qū)，小區(qū)面積25.6 m2，3次重復(fù)，用水量為 450 L·hm－2。

1.4.4五倍子粗提液對棉花產(chǎn)量和纖維品質(zhì)的影響。2017年棉花吐絮后實收測產(chǎn)，選取30鈴檢測纖維品質(zhì)。纖維樣品送農(nóng)業(yè)部棉花品質(zhì)監(jiān)督檢驗測試中心進(jìn)行纖維品質(zhì)5項指標(biāo) （上半部平均長度、長度整齊度指數(shù)、斷裂比強度、馬克隆值和斷裂伸長率）檢測（HVICC校準(zhǔn)）。

1.5 藥效計算方法

病株率（rDP）計算公式：rDP（%）＝NDP/NTP×100。式中：NDP為病株總數(shù)，NTP為調(diào)查總株數(shù)。病情指數(shù)（ID，簡稱“病指”）計算公式：ID＝[∑（NDP(i)×i）/（NTP×5）]×100。 式中：NDP(i)為某一病級病株數(shù)，i為相對病級值。

2016年田間試驗在棉花黃萎病發(fā)生初期噴藥，噴藥前調(diào)查黃萎病發(fā)生情況，計算校正防效（EA）。 公式：EA（%）＝[1－（ID(T1)×ID(CK0)）/（ID(T0)×ID(CK1)）]×100。 式中：ID(T0)為施藥區(qū)藥前病指，ID(T1)為施藥區(qū)藥后病指，ID(CK0)為對照區(qū)藥前病指，ID(CK1)為對照區(qū)藥后病指。

2017年在黃萎病發(fā)生之前噴藥，計算相對防效（ER）。 公式：ER（%）＝（ID(T)－ID(CK)）/ID(CK)×100。 式中：ID(T)為施藥區(qū)病指，ID(CK)為對照區(qū)病指。

1.6 數(shù)據(jù)處理軟件及方法

采用Statistix 8進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 五倍子粗提液對大麗輪枝菌生長抑制效果

五倍子粗提液對來自三大棉區(qū)的3個強致病力菌株均有較好的抑制效果，而且其菌落生長抑制率（IG）均隨著體積分?jǐn)?shù)的增加逐漸提高，到0.6%時，IG均達(dá)到100%。不同體積分?jǐn)?shù)五倍子粗提液處理的IG均在第7 d達(dá)到最高，第9 d和第11 d，基本維持不變或略下降。在第7 d，0.1%、0.2%和0.6%的五倍子粗提液對Vd080的IG分別為23.2%、59.8%、100%， 對 Vd147的IG分別為31.5%、59.7%、100%， 對 Vd021的IG分別為25.6%、51.8%、100%（表1）。以上結(jié)果表明，五倍子粗提液對大麗輪枝菌的生長具有明顯的抑制作用，體積分?jǐn)?shù)在0.2%以上時，抑菌效果超過50%；達(dá)到0.6%時，能完全抑制大麗輪枝菌菌落的生長。

2.2 五倍子粗提液對大麗輪枝菌孢子產(chǎn)量的抑制效果

五倍子粗提液對3個大麗輪枝菌菌株的產(chǎn)孢量抑制率（IS）均隨著其體積分?jǐn)?shù)的增加而提高（表2）。結(jié)果表明，五倍子粗提液對大麗輪枝菌的孢子產(chǎn)生具有較好的抑制效果，當(dāng)體積分?jǐn)?shù)在0.2%以上時，IS超過80%；達(dá)到0.6%時，能夠完全抑制孢子的產(chǎn)生。

表1 不同體積分?jǐn)?shù)五倍子粗提液處理的大麗輪枝菌菌落生長情況及抑制率

表2 不同體積分?jǐn)?shù)五倍子粗提液對大麗輪枝菌產(chǎn)孢量的抑制作用

2.3 五倍子粗提液對棉花黃萎病防效

2016年采用50倍五倍子粗提液在黃萎病發(fā)生期進(jìn)行葉面噴施，對黃萎病的校正防效為46.5%～55.4%，平均為51.6%，噴施3次后的效果最好（表3）。2017年采用五倍子粗提液40倍液、80倍液和160倍液在黃萎病發(fā)生之前開始進(jìn)行葉片噴施，噴施3次后，3個處理對黃萎病的相對防效分別為25.2%、37.8%和21.2%，80倍液處理顯著高于160倍液處理；噴施4次后，3個處理相對防效分別為58.8%、54.3%和25.1%，其中40倍液處理和80倍液處理的相對防效均顯著高于160倍液處理，且二者之間差異不顯著（表4）。上述結(jié)果表明，在黃萎病發(fā)生之前或初期采用五倍子粗提液進(jìn)行葉面噴施，能有效控制棉花黃萎病病情的發(fā)展，以40～80倍液效果較好。

表3 2016年五倍子粗提液50倍液葉面噴霧對棉花黃萎病校正防效

表4 2017年五倍子粗提液不同劑量葉面噴霧對黃萎病的相對防效

2.4 五倍子粗提液對棉花產(chǎn)量和纖維品質(zhì)的影響

五倍子粗提液各處理的棉纖維品質(zhì)主要指標(biāo)上半部平均長度、長度整齊度指數(shù)、斷裂比強度和斷裂伸長率大多比空白對照有所增加，其中40、80倍液能顯著提高棉纖維的斷裂伸長率，且對其他指標(biāo)無顯著影響（表5）。五倍子粗提液各處理對棉花鈴重、衣分、霜前花率無顯著影響，但40倍液處理籽棉產(chǎn)量較空白對照提高6.0%，差異達(dá)顯著水平（表5）。表明，葉面噴施五倍子粗提液能顯著提高棉纖維的斷裂伸長率和籽棉產(chǎn)量。

表5 不同劑量五倍子粗提液葉面噴霧對棉花纖維品質(zhì)指標(biāo)、產(chǎn)量性狀的影響

3 討論與結(jié)論

五倍子單寧的低聚體既能結(jié)合蛋白質(zhì)形成氫鍵,又可以進(jìn)入微生物的敏感部位從而產(chǎn)生抑制作用；因此，其對細(xì)菌和真菌的抑制效果顯著[6-7]。室內(nèi)抑菌試驗表明，五倍子粗提液對大麗輪枝菌菌落生長、產(chǎn)孢量的抑制率可達(dá)100%，且對不同菌株均具有非常好的抑制效果。田間試驗表明，噴施3～4次后其對棉花黃萎病防治效果可達(dá)到55.4%～58.8%，與生產(chǎn)上常用的氨基寡糖素、枯草芽孢桿菌和棉萎克防治效果相當(dāng)[8-10]，且能顯著提高棉花纖維的斷裂伸長率和籽棉產(chǎn)量。因此，五倍子粗提液在棉花黃萎病防治上具有良好的發(fā)展前景。推薦生產(chǎn)上在棉花黃萎病發(fā)生前或發(fā)生初期葉面噴施40～80倍的五倍子粗提液進(jìn)行防治。

參考文獻(xiàn)：

[1]邵仁志，劉小安，孫蘭，等.中國植物源農(nóng)藥的（袁媛，等）五倍子粗提液對棉花黃萎病的防治效果研究進(jìn)展[J].今日農(nóng)藥，2017（7）：21-24.

[2]江凱.五倍子單寧提取純化及生理活性的研究進(jìn)展[J].農(nóng)產(chǎn)品加工（學(xué)刊），2013(10)：53-56，60.

[3]朱荷琴，馮自力，宋曉軒，等.22種中藥提取物對棉花黃萎病菌的抑菌活性[J].棉花學(xué)報，2007，19(6)：489-492.

[4]朱荷琴，馮自力，尹志新，等.我國棉花黃萎病菌致病力分化及 ISSR指紋分析[J].植物病理學(xué)報，2012，42(3)：225-235.

[5]朱荷琴，馮自力，李志芳，等.蛭石沙土無底紙缽定量蘸菌液法鑒定棉花品種 （系）的抗黃萎病性 [J].中國棉花，2010，37(12)：15-17.

[6]Tian Fang,Li Bo,Ji Baoping,et al.Antioxidant and antimicrobial activities of consecutive extracts fromGalla chisensis:The polarity affects the bioactivities[J].Food Chemistry,2009,113(1):173-179.

[7]Chen J C,Ho T Y,Chang Y S,et al.Anti-diarrheal effect ofGalla chisensison theEscherichia coliheat-labile enterotoxin and ganglioside interaction[J].Journal of Ethnopharmacology,2005,103(3):385-391.

[8]馮自力，朱荷琴，李志芳，等.氨基寡糖素水劑對棉花黃萎病的防治效果及其使用技術(shù)[J].中國棉花，2014，41(7)：11-13.

[9]馮鴻杰，薛中立，郭紅甫，等.棉萎克對棉花黃萎病的防控效果及使用技術(shù)[J].中國棉花，2016，43(4)：35-37.

[10]師勇強，馮自力，馮鴻杰，等.枯草芽孢桿菌對南疆棉花黃萎病、產(chǎn)量及纖維品質(zhì)的影響[J].中國棉花，2017，44(12)：8-10.