李甲，陳寶安

(東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院 血液內(nèi)科，江蘇 南京 210009)

腫瘤因其高發(fā)病率及死亡率嚴(yán)重影響著人類的健康，在其所有的治療手段中，化療是其中一種主要的治療手段。隨著醫(yī)學(xué)及科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，越來越多的化療藥物被不斷研制及開發(fā)，但不幸的是，在治療過程中腫瘤會對化療藥物逐漸產(chǎn)生耐藥性[1]。多藥耐藥(multidrug resistance)定義為對多種具有不同結(jié)構(gòu)及藥動力學(xué)作用的藥物產(chǎn)生交叉耐藥性[2]，從而影響藥物療效及患者預(yù)后[3]。

涉及腫瘤多藥耐藥作用的其中一個重要機制[4]即為P- 糖蛋白(P- glycoprotein)的過表達。P- 糖蛋白屬于ATP結(jié)合盒(ATP- binding cassette)轉(zhuǎn)運載體蛋白家族中一員，ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運載體蛋白具有一個共同的膜內(nèi)結(jié)合域，它被叫做核苷酸結(jié)合域，這個結(jié)構(gòu)域可以整合并利用水解ATP的能量主動從細(xì)胞內(nèi)將藥物泵出至胞外從而降低細(xì)胞內(nèi)藥物濃度[5- 6](圖1)。在所有的ABC膜轉(zhuǎn)運蛋白家族中，P- 糖蛋白(ABCB1)、多藥耐藥相關(guān)蛋白(ABCC1)和乳腺癌耐藥蛋白(BRCP/ABCG2)是與腫瘤多藥耐藥作用聯(lián)系最為緊密的。

TMD.跨膜結(jié)合域；NBD.核苷酸結(jié)合域

圖1P-糖蛋白結(jié)構(gòu)示意圖

1 P- 糖蛋白在腫瘤多藥耐藥中的作用

P- 糖蛋白是一種由1 280個氨基酸組成、大小約為170 kDa的跨膜糖蛋白并首次在耐藥的中國倉鼠卵巢細(xì)胞中被發(fā)現(xiàn)[7]，它是由位于第7號染色體上的MDR1基因編碼[8]。這種糖蛋白包括兩個跨膜結(jié)合域(transmembrane domain)及兩個核苷酸結(jié)合域(nucleotide- binding domain)[9]，它由兩個相似的部分組成，其中每一部分包含6個轉(zhuǎn)運膜區(qū)和一個ATP結(jié)合利用區(qū)[10]?？缒そY(jié)合域與藥物轉(zhuǎn)運有關(guān)，而ATP結(jié)合利用區(qū)則是與ATP結(jié)合從而為轉(zhuǎn)運藥物提供能量。據(jù)我們所知，一旦藥物與P- 糖蛋白結(jié)合，這些藥物可誘導(dǎo)P- 糖蛋白結(jié)合ATP并發(fā)生巨大的構(gòu)象變化，從而使其呈現(xiàn)出一個面向胞外的內(nèi)腔并將藥物從胞內(nèi)泵出[11]。值得我們注意的是，核苷酸結(jié)合域的二聚化、藥物與P- 糖蛋白的結(jié)合能力及ATP分子的合理利用程度是影響P- 糖蛋白功能充分發(fā)揮的三大重要影響因素[12]。P- 糖蛋白主要存在于上皮細(xì)胞上，包括結(jié)腸、小腸、胰腺、腎近端小管上皮及腎上腺上皮頂端部分等[13]，同時，它也被發(fā)現(xiàn)存在于血腦屏障內(nèi)皮細(xì)胞上。作為一種能量依賴性“藥泵”，它可將細(xì)胞內(nèi)有毒物質(zhì)泵出胞外從而保護細(xì)胞免受傷害[14]。與此同時，研究者發(fā)現(xiàn)在腎細(xì)胞癌、結(jié)腸癌、肝細(xì)胞癌和胰腺細(xì)胞癌等腫瘤中可見P- 糖蛋白的過表達；同時，像乳腺癌及神經(jīng)母細(xì)胞瘤等腫瘤中P- 糖蛋白的表達無明顯增加；然而，另一些腫瘤如卵巢癌、肺癌等檢測出P- 糖蛋白低水平表達，這些腫瘤可能存在著除P- 糖蛋白介導(dǎo)的多藥耐藥以外的其他機制進而影響治療效果[15]。并且，研究者還發(fā)現(xiàn)P- 糖蛋白具有抑制凋亡的作用，但其具體機制尚不明確。到目前為止許多相關(guān)理論已被提出，如干擾死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合體(death- inducing signaling complex, DISC)和抑制caspase- 8激活等。此外，也有研究者提出P- 糖蛋白通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)影響細(xì)胞凋亡通路的相關(guān)脂質(zhì)因子水平如鞘脂類及其代謝產(chǎn)物，尤其是神經(jīng)酰胺及1- 磷酸鞘氨醇，從而防止細(xì)胞凋亡發(fā)生[16]。

2 P- 糖蛋白抑制劑逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥

迄今為止，許多具有抑制P- 糖蛋白功能的藥物已被相繼研發(fā)出來[17]。通常來說，我們將P- 糖蛋白抑制劑分為3代[18]，第1代抑制劑代表藥物如維拉帕米、環(huán)孢素A和他莫昔芬等，這些藥物均為P- 糖蛋白作用底物。然而，為了達到有效血清藥物濃度，它們的毒性作用會大大增加從而限制其臨床應(yīng)用[19]。第2代P- 糖蛋白抑制劑，如biricodar和valspodar等，這些藥物參與細(xì)胞色素P450同工酶代謝過程并影響化療藥物在體內(nèi)的正常代謝，從而導(dǎo)致嚴(yán)重的毒性[20]。然而，第3代抑制劑如tariquidar和zosuquidar等藥物并不影響CYP3A4代謝同時可逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥作用，但同樣的，之所以限制推廣應(yīng)用于臨床還是因為不可避免的毒性作用[21]。

到目前為止，P- 糖蛋白作為一類“藥物泵”將藥物泵出胞外的具體機制尚不清楚，一些相關(guān)假設(shè)及理論已被提出。最先被提出的理論中假設(shè)P- 糖蛋白作為一類細(xì)胞膜上孔狀結(jié)構(gòu)[22]，將細(xì)胞內(nèi)藥物通過此通道泵出至胞外，隨后的一些研究發(fā)現(xiàn)P- 糖蛋白作用機制類似翻轉(zhuǎn)酶(flippase)[23]。然而，最被大眾廣泛認(rèn)可的理論闡述了P- 糖蛋白作用方式類比“真空吸塵器”作用方式，它可將胞內(nèi)藥物通過其疏水中心排出至胞外[24]。

綜合上述關(guān)于3代P- 糖蛋白抑制劑面臨的相關(guān)問題，一種針對逆轉(zhuǎn)腫瘤化療多藥耐藥作用的有效并安全的P- 糖蛋白抑制劑亟待被發(fā)現(xiàn)。

3 逆轉(zhuǎn)P- 糖蛋白介導(dǎo)的腫瘤多藥耐藥機制相關(guān)策略

考慮到P- 糖蛋白過表達是引起腫瘤多藥耐藥的一個重要原因，因此抑制P- 糖蛋白的表達及功能是克服腫瘤多藥耐藥作用最為直接的一種方法。除了上面談到的3代P- 糖蛋白抑制劑以外，一般來說有以下3種作用機制抑制P- 糖蛋白功能：(1) 通過競爭性、非競爭性及變構(gòu)調(diào)節(jié)抑制藥物結(jié)合位點，從而增加胞內(nèi)藥物濃度；(2) 干擾ATP水解作用；(3) 改變細(xì)胞膜脂質(zhì)構(gòu)成完整性[25]。

大多數(shù)P- 糖蛋白調(diào)節(jié)劑是通過競爭性或非競爭性抑制藥物結(jié)合位點進一步達到抑制P- 糖蛋白功能。在體外研究中證實P- 糖蛋白介導(dǎo)的底物運輸可被飽和并對滲透壓的變化敏感，而其底物濃度階梯的維持又依賴于ATP水解作用。許多P- 糖蛋白抑制劑直接競爭性與位于蛋白上的藥物結(jié)合位點結(jié)合從而減少具有細(xì)胞毒作用的藥物被泵出，提高胞內(nèi)藥物濃度，進一步逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥作用。有研究人員證實了續(xù)隨二萜酯(epoxylathyrol)衍生物在人結(jié)腸腺癌和小鼠T細(xì)胞淋巴瘤細(xì)胞中可逆轉(zhuǎn)P- 糖蛋白介導(dǎo)的多藥耐藥作用。文章指出，通過功能學(xué)及化學(xué)敏感性分析均證實了所研究的23種衍生物針對人直腸腺癌和人ABCB1基因轉(zhuǎn)染的L5178Y小鼠淋巴瘤細(xì)胞均具有逆轉(zhuǎn)多藥耐藥的潛能。在這個實驗中，研究者還通過ATPase酶活力分析進一步證明了這些衍生物在較高濃度水平下可抑制P- 糖蛋白運輸?shù)孜锞S拉帕米，也從側(cè)面驗證了這些衍生物可通過P- 糖蛋白被緩慢地運輸，進而降低其他底物如維拉帕米的運輸效率，同時，研究者還發(fā)現(xiàn)了其中一種續(xù)隨二萜酯衍生物epoxyboetirane R在其高濃度下可呈現(xiàn)一種非競爭性抑制現(xiàn)象，它可以同時抑制受激與基線的對釩酸鹽敏感的ATPase活力。這個現(xiàn)象也暗示了可能存在變構(gòu)效應(yīng)，此衍生物本身對P- 糖蛋白變構(gòu)位置具有較低的親和力，但當(dāng)它維持到一個較高濃度時則可引起對ATP水解具有重要影響的分子內(nèi)運動，從而引起變構(gòu)效應(yīng)[26]。Kim等[27]通過實驗證實了槲皮素- 7- O- 多聚甲醛偶合物(quercetin- 7- O- POM conjugates, 7- O- POM- Q)針對來源于藥物敏感的人子宮肉瘤細(xì)胞(MES- SA)相對應(yīng)的耐藥細(xì)胞株MES- SA/Dx5具有顯著的逆轉(zhuǎn)多藥耐藥作用。通過ATPase活力及Rh123染色分析表明7- O- POM- Q可競爭性結(jié)合在P- 糖蛋白上的維拉帕米的藥物結(jié)合位點，從而減少經(jīng)P- 糖蛋白介導(dǎo)的相關(guān)藥物泵出至胞外，同時，7- O- POM- Q與槲皮素相比，前者具有更緩慢的水解過程，相對穩(wěn)定。

除此以外，還有一些調(diào)節(jié)劑具有刺激P- 糖蛋白上ATPase活力的功能從而抑制其“藥物泵”的功能發(fā)揮。有研究人員發(fā)現(xiàn)NVP- TAE684針對人骨肉瘤細(xì)胞具有逆轉(zhuǎn)多藥耐藥的作用，這項實驗證實了NVP- TAE684作為一種激酶抑制劑同時也是一種有效的多藥耐藥逆轉(zhuǎn)劑。它本身不屬于P- 糖蛋白底物競爭性抑制劑，而是通過刺激ATPase活性進而抑制P- 糖蛋白功能，蛋白激酶常常通過抑制P- 糖蛋白功能或增強化療藥物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用逆轉(zhuǎn)耐藥。此實驗也證實了NVP- TAE684對化療常用藥物如阿霉素、紫杉醇和ET- 743等均有逆轉(zhuǎn)耐藥作用[28]。同樣地，Wang等[29]證實了西妥昔單抗——一種EGFR單克隆抗體，能以濃度依賴的方式激活P- 糖蛋白上ATPase活性，從而抑制了P- 糖蛋白介導(dǎo)的多藥耐藥作用。有趣的是，在實驗中還發(fā)現(xiàn)了西妥昔單抗可減低細(xì)胞的流動性進而抑制P- 糖蛋白功能。

除了直接抑制P- 糖蛋白功能外，其他一些可選的方法已逐漸應(yīng)用于實驗研究中試圖逆轉(zhuǎn)多藥耐藥作用，提高化療療效。許多研究者應(yīng)用基因沉默的方式去調(diào)節(jié)P- 糖蛋白表達水平。反義寡核苷酸(antisense ODNs)是一類可特異地與靶基因DNA或mRNA互補結(jié)合而抑制該基因表達的短序列DNA分子[30]。例如，Motomura等[31]研究發(fā)現(xiàn)在急性髓系白血病細(xì)胞和K562- ADR細(xì)胞系中加入反義寡核苷酸序列可直接影響MDR1 mRNA的表達水平，實驗數(shù)據(jù)顯示P- 糖蛋白功能被抑制，耐藥細(xì)胞株重新對化療藥物柔紅霉素反應(yīng)敏感。然而截至到目前，尚無一種MDR1相關(guān)的反義寡核苷酸應(yīng)用于臨床治療中。對于反義寡核苷酸來說，其本身存在諸多缺點進而降低了它的臨床應(yīng)用價值，如其毒性、不可避免的免疫原性及針對核酶的不穩(wěn)定性等[32]。與此同時，我們也應(yīng)該注意到反義寡核苷酸序列介導(dǎo)的P- 糖蛋白表達水平的降低是非特異性的，也就是說正常細(xì)胞的P- 糖蛋白表達水平也會受到影響，如表達在血腦屏障內(nèi)皮細(xì)胞上的P- 糖蛋白，其作用是保護腦組織避免受到有毒物質(zhì)的傷害，若降低了血腦屏障內(nèi)皮細(xì)胞上的P- 糖蛋白表達水平，我們有理由認(rèn)為腦組織可能會更容易受到外界不良因素的影響。

RNA干擾(RNA interference)技術(shù)是指由雙鏈RNA分子(double- stranded RNA)誘發(fā)的、同源mRNA特異性識別及高效降解從而下調(diào)特定靶基因表達水平的過程[33]。這項技術(shù)往往依賴2種RNA分子：小干擾RNA(small interfering RNA, siRNA)、小發(fā)卡RNA(small hairpin RNA)。Wu等[34]利用納米膠束共運輸P- 糖蛋白相關(guān)siRNA與多柔比星藥物致多柔比星耐藥乳腺癌細(xì)胞株(MCF- 7/ADR)，可發(fā)現(xiàn)多柔比星IC50及P- 糖蛋白表達顯著降低。RNA干擾技術(shù)同反義寡核苷酸序列一樣，具有相似的缺陷。然而，許多研究者利用脂質(zhì)體或納米膠束等技術(shù)試圖克服這些不足。Zhang等[35]通過體內(nèi)實驗證實了多柔比星- 小干擾RNA分子- 膠束復(fù)合體(Dox- siRNA- micelle)通過下調(diào)P- 糖蛋白水平進而顯著抑制了HepG2/ADR腫瘤細(xì)胞的生長。這個復(fù)合體可以避免藥物“藥物泵”轉(zhuǎn)運體的作用、提高胞內(nèi)化療藥物濃度，并同時下調(diào)P- 糖蛋白表達水平。

核酶是一類具有催化作用的RNA分子，它可特異性識別mRNA中GUC序列從而剪切底物RNA分子，阻斷靶基因的表達[36]。同時，其本身的可重復(fù)利用性、特異性、高效率及副作用少促使它成為一種新興的逆轉(zhuǎn)P- 糖蛋白介導(dǎo)的腫瘤多藥耐藥的治療手段。許多相關(guān)研究表明應(yīng)用針對MDR1表達的核酶可顯著下調(diào)MDR1表達水平，從而使腫瘤細(xì)胞恢復(fù)對化療藥物的敏感性[37]。

另一個擁有廣闊治療前景的手段則是試圖在轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)MDR1過表達。相關(guān)研究表明，MDR1基因的表達受到與啟動子結(jié)合的多個轉(zhuǎn)錄因子的共同調(diào)控[38]。Chen等[39]發(fā)現(xiàn)達沙替尼可以通過抑制ERK信號通路的激活從而在轉(zhuǎn)錄及翻譯水平下抑制P- 糖蛋白的過表達現(xiàn)象，進一步逆轉(zhuǎn)MCF- 7乳腺癌細(xì)胞株對多柔比星的耐藥性。

值得我們注意的是，P- 糖蛋白的表達不僅僅位于胞漿內(nèi)膜，它也可以存在于各種細(xì)胞器上，如溶酶體。Jansson等[40]通過實驗發(fā)現(xiàn)了Dp44mT可作為一種新的抗腫瘤藥物，并利用細(xì)胞內(nèi)溶酶體上的P- 糖蛋白功能提高耐藥腫瘤細(xì)胞對化療藥物的敏感性。此實驗證實了Dp44mT是P- 糖蛋白的運輸?shù)孜?，并且逆轉(zhuǎn)多藥耐藥作用依賴于Dp44mT- 銅復(fù)合體的氧化還原反應(yīng)，此作用機制與上述所談到的化療藥物作為常規(guī)P- 糖蛋白底物作用原理完全不同。因此，這也為我們尋找克服腫瘤多藥耐藥的手段提供了新的方向。

許多研究表明，P- 糖蛋白上ATPase活力也很大程度上受到細(xì)胞膜脂質(zhì)組成變化的影響[41]。隨后的一些研究也陸續(xù)發(fā)現(xiàn)根據(jù)P- 糖蛋白位于細(xì)胞膜的位置不同及膜脂質(zhì)組成成分差異，其基底ATPase活力也隨之變化。所以，我們有理由假設(shè)改變細(xì)胞漿膜生物化學(xué)、生物物理等特性從而調(diào)節(jié)P- 糖蛋白功能。

正如我們所知，許多中藥也具有抗腫瘤作用，這些藥物往往具有復(fù)雜的成分及作用機制，如直接殺傷腫瘤細(xì)胞、免疫調(diào)節(jié)等作用。相關(guān)研究者也認(rèn)為中藥作為逆轉(zhuǎn)腫瘤耐藥作用的調(diào)節(jié)劑具有較好的治療前景，但目前注意力主要集中在探究中藥單體的作用機制及治療效果。

4 結(jié) 語

我們已經(jīng)知道眾多因素均可引起腫瘤多藥耐藥現(xiàn)象的發(fā)生，其中一個主要原因即為P- 糖蛋白的過度表達。P- 糖蛋白分布于許多組織細(xì)胞中，不可否認(rèn)的是，P- 糖蛋白在藥物吸收、分布、代謝及排泄方面發(fā)揮著重要功能，若只是一味地抑制P- 糖蛋白的功能則可能影響機體正常的生理功能[42]。目前尚無一種藥物應(yīng)用于臨床針對腫瘤耐藥的相關(guān)治療，尋求一種靶向特異性高、副作用少的逆轉(zhuǎn)劑對我們來說仍是一項艱難的挑戰(zhàn)。我們在利用現(xiàn)有的治療手段及方法克服腫瘤多藥耐藥現(xiàn)象的同時，更重要的是研究者們需深入探討腫瘤多藥耐藥現(xiàn)象發(fā)生的分子病理學(xué)機制，這樣才能促使我們更好、更科學(xué)地進行臨床治療。

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