（石河子大學(xué)動物科技學(xué)院，新疆 石河子 832003）

牛輪狀病毒是引起犢牛腹瀉的主要病原之一，感染輪狀病毒的犢牛表現(xiàn)為消瘦、脫水、排蛋花狀水樣糞便，病情嚴(yán)重者常并發(fā)或繼發(fā)其他病毒、細(xì)菌、寄生蟲等感染[1]，導(dǎo)致規(guī)?；鰻倥Ｋ劳雎噬遊2]，目前輪狀病毒的檢測方法主要是病毒的分離鑒定[3-4]、RT-PCR[5-6]、半巢氏 RT-CR[7]、ELISA[8]等。張坤[9]等通過RT-PCR等方法對新疆北疆地區(qū)致犢牛腹瀉輪狀病毒病的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，規(guī)模化牛場中犢牛存在感染。輪狀病毒結(jié)構(gòu)蛋白中VP6蛋白構(gòu)成輪狀病毒內(nèi)衣殼[10]，具有良好的免疫原性和抗原性[11]。本研究利用VP6設(shè)計引物，運用RT-PCR和ELISA方法對新疆規(guī)?；鲋聽倥８篂a病原輪狀病毒病進(jìn)行調(diào)查研究，以便為犢牛腹瀉采取防控措施提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 主要試劑與儀器

ELISA雙抗體夾心檢測試劑盒購自上海潤裕生物技術(shù)有限公司，pMD19-T克隆載體、T4 DNA連接酶、DNA Marker均購自寶生物工程大連公司（Takara），RNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒均購自康為世紀(jì)生物科技有限公司，2×Taq PCR MAsterMix溶液、DH5a菌株制備的感受態(tài)細(xì)胞均購自北京天根生物科技有限公司。試驗儀器主要有酶標(biāo)儀、微量震蕩儀器和離心機（Costar公司）。

1.1.2 樣本采集

采集石河子地區(qū)奶牛場、石河子地區(qū)某肉牛場、昌吉奶牛場、奎屯地區(qū)奶牛場等地區(qū)腹瀉犢牛糞便共172份，于-80℃冰箱保存待檢。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品處理

將腹瀉犢牛糞便樣品與等體積的PBS于冰上充分研磨，進(jìn)行超聲破碎，反復(fù)凍融，最后12 000 r離心30 min，取上清液用于PCR模板檢測和牛輪狀病毒ELISA試劑盒檢測。

1.2.2 牛輪狀病毒VP6基因的引物設(shè)計

根據(jù)GenBank公布的BRV基因序列VP6設(shè)計引物（見表1）。

1.2.3 總RNA的提取

按照說明書Trizol法，處理后的樣品加入適量的Trizol后，用無RNA酶槍頭反復(fù)吹打混勻，使樣品充分裂解，分離蛋白核酸復(fù)合物，靜置10 min后加入1/5 Trizol量的氯仿，震蕩混勻后靜置5 min，在預(yù)冷的4℃離心機中12 000 r離心15 min，EP管中的液體分為3層，提取的RNA主要在上層的無色液體中，利用特制的帶收集管的吸附柱，將無色液體和等量的無水乙醇全部加入吸附柱中，進(jìn)行離心，用無RNA酶水進(jìn)行洗脫收集得到的RNA，提取RNA后，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，具體反應(yīng)體系如表2。

表1 牛輪狀病毒VP6基因PCR擴增引物信息

表2 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系

1.2.4 PCR反應(yīng)

PCR 反應(yīng)體系 （20 μL）：2 × Es Taq Master mix 10.0 μL，上、下游引物各 0.4 μL，模板 2.0 μL，ddH2O 7.2 μL。PCR 反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性 5 min，94℃變性 30 s，55℃退火 30 s，72℃延伸 30 s，35 個循環(huán)后，72℃延伸10 min。擴增反應(yīng)結(jié)束后，將PCR產(chǎn)物在2%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測，同時瓊脂糖凝膠試劑盒回收目的片段。

1.2.5 瓊脂糖凝膠電泳和目的條帶回收

稱取瓊脂糖1.2 g、1×TBE電泳緩沖液60 mL，配置成2%的瓊脂糖凝膠溶液，經(jīng)微波爐加熱，完全溶解，室溫靜置，滴加EB染液后充分混勻，將其倒入制膠槽中，約30 min后凝固，20 uL點樣，180 V、120 mA進(jìn)行電泳，結(jié)束后將膠放入凝膠成像儀器中，進(jìn)行拍照保存。

目的條帶的回收：用切膠刀將目的條帶在紫外燈下切除，置于無RNA酶的EP中加入適量的溶膠液，進(jìn)行50℃水浴溶解，充分溶解后加入特制的吸附柱中，離心后，加入無水乙醇進(jìn)行洗脫，最后用無RNA酶水進(jìn)行洗脫，收集得到的洗脫液。

1.2.6 目的基因的連接（表3）

表3 目的基因的連接反應(yīng)體系

1.2.7 轉(zhuǎn)化及菌液PCR鑒定

轉(zhuǎn)化按照說明書進(jìn)行操作，采用經(jīng)特殊工藝制作的DH5α感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行DNA的熱激轉(zhuǎn)化，將連接產(chǎn)物加入置于冰上緩慢融化的DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，用移液器吹打混勻后，置于冰上30 min，進(jìn)行42℃水浴熱激90 s后迅速置于冰上，加入適量的LB液體后，37℃、170 r搖床上搖4 h，離心取沉淀涂于固體LB平板上。

菌液PCR的鑒定及測序：從轉(zhuǎn)化平皿中挑取單菌落加入氨芐抗性的LB液體培養(yǎng)基，37℃、180 r搖床培養(yǎng)4 h，進(jìn)行菌液PCR鑒定。將鑒定為陽性的菌，擴大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒送上海生工測序。

1.2.8 牛輪狀病毒抗原ELISA檢測

按照牛輪狀病毒抗原ELISA說明書進(jìn)行。試劑盒原理是雙抗體夾心法，將處理好的樣品上清液吸取200 μL加入已經(jīng)預(yù)先包被牛輪狀病毒捕獲抗體的微孔中，同時設(shè)置陰、陽性對照孔和空白孔，除空白孔外，樣品孔中加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的檢測抗體100 μL，微量震蕩儀器上震蕩混勻，用封板膜封好后置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中作用1 h，取出棄掉微孔中的液體，每孔用洗滌液洗板5次，每次2 min，加入底物后避光孵育15 min，用終止液進(jìn)行終止，在450 nm的酶標(biāo)儀上進(jìn)行讀數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR檢測的牛輪狀病毒感染情況

表4 新疆部分地區(qū)規(guī)?；雠］啝畈《緳z測結(jié)果

經(jīng)PCR方法對新疆部分地區(qū)規(guī)?；?72份腹瀉犢牛糞便樣品進(jìn)行檢測，檢出陽性份數(shù)127份，陽性率73.83%（表4）。犢牛糞便中VP6基因檢測的結(jié)果（圖1、圖2）運用DNAMAN軟件將牛輪狀病毒VP6基因測序結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行在線比對，發(fā)現(xiàn)兩者同源性達(dá)到100%（部分圖）。

圖1 某規(guī)?；龈篂a犢牛糞便輪狀病毒VP6基因檢測結(jié)果

2.2 ELISA檢測結(jié)果

表5 ELISA方法檢測結(jié)果

經(jīng)ELISA方法對新疆部分地區(qū)規(guī)?；?72份腹瀉犢牛糞便樣品進(jìn)行檢測，陽性份數(shù)100份，陽性率 72%（表5）。

圖2 牛輪狀病毒VP6基因與標(biāo)準(zhǔn)序列比對結(jié)果

3 討論

牛輪狀病毒VP6基因，是診斷牛輪狀病毒感染的常用基因，本研究通過設(shè)計牛輪狀病毒VP6基因引物，通過測序，將測序結(jié)果分別與牛輪狀病毒VP6基因標(biāo)準(zhǔn)序列通過DNAMAN軟件進(jìn)行在線比對，發(fā)現(xiàn)擴增出的牛輪狀病毒VP6基因與標(biāo)準(zhǔn)序列的同源性為100%，可以判定被調(diào)查牛場犢牛遭受輪狀病毒病感染。

ELISA方法是進(jìn)行大量樣本檢測的首選，本調(diào)查經(jīng)ELISA方法對新疆部分地區(qū)規(guī)?；龈篂a犢牛糞便樣品進(jìn)行檢測，陽性率72%（100/172），經(jīng)RT-PCR方法檢測犢牛糞便樣品，陽性率73.83%（127/172），這比張坤[9，12]等應(yīng)用 RT-PCR 和 ELISA方法檢測報道的調(diào)查結(jié)果略高。綜合PCR和ELISA方法各自的優(yōu)點，可對腹瀉犢牛的輪狀病毒感染提供較為準(zhǔn)確的診斷。

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