劉 瓊， 羅青平， 左家華， 王學(xué)東，胡駿鵬， 段勝浩， 鄭紅生，胡先勤*

（1.武漢輕工大學(xué)，湖北武漢 430023；2.農(nóng)業(yè)部畜禽細(xì)菌病防治制劑創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢 430064；3安琪酵母股份有限公司，湖北宜昌443003；4.武漢永生鴨業(yè)有限公司，湖北武漢 430077）

膽酸鹽是膽汁中由膽固醇衍生而來的，是人和動(dòng)物體中具有甾核結(jié)構(gòu)的一類兩性大分子，肉鴨腸道中膽酸鹽的濃度約為0.3%，其對(duì)于腸道菌群如釀酒酵母菌、乳酸桿菌的生存和生長具有抑制作用（Adebola 等，2014）。 García-Hernández 等（2012）對(duì)雞排泄物中的酵母益生菌進(jìn)行耐膽酸鹽試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，部分釀酒酵母菌能夠耐受0.3%～0.6%的膽酸鹽濃度。由此可見，在消化道正常膽汁濃度下，酵母益生菌具有良好的抗膽酸鹽能力。海藻糖是一類非還原性的二糖（Jules，2008），是酵母細(xì)胞在應(yīng)對(duì)外界環(huán)境變化時(shí)，保護(hù)自身所形成的一種具有高抗性的應(yīng)激狀態(tài)物質(zhì)，在生物圈內(nèi)的表達(dá)無所不在。其由兩個(gè)葡萄糖分子經(jīng)過α1-1糖苷鍵相連，具有其他糖類所不具有的一系列特殊的物理特征，如高親水性和化學(xué)穩(wěn)定性，不形成分子內(nèi)氫鍵。當(dāng)酵母細(xì)胞處于高濃度膽酸鹽環(huán)境中時(shí)，細(xì)胞內(nèi)鹽濃度變化，會(huì)引起蛋白質(zhì)變性、改變細(xì)胞膜構(gòu)造等危害酵母細(xì)胞生長代謝的變化。海藻糖對(duì)酵母細(xì)胞處于高濃度膽酸鹽環(huán)境中的保護(hù)機(jī)理可能是由于其具有很強(qiáng)的水分子束縛能力，使得膜蛋白的親水性部分與水結(jié)合，最終防止了酵母細(xì)胞膜的變性（Argüelles，2000）。 本試驗(yàn)旨在從肉鴨消化道內(nèi)分離篩選出的7株釀酒酵母中，通過高濃度膽酸鹽應(yīng)激處理選取高抗性菌株，并探究高濃度膽酸鹽與酵母細(xì)胞質(zhì)膜ATPase活性及胞內(nèi)海藻糖積累量的相關(guān)性，為開發(fā)高抗性、專一型的酵母益生菌制劑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源 本實(shí)驗(yàn)室從肉鴨腸道分離保存的7株釀酒酵母（張霞等，2015）。

1.1.2 培養(yǎng)基 瓊脂培養(yǎng)基、YPD培養(yǎng)基均為國產(chǎn)。

1.1.3 試劑 GENMED Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒 （Genmed Scientifics INC.U.S.A），GEN-MED酵母ATP酶（ATPase）活性酶連續(xù)反應(yīng)光譜法定量檢測(cè)試劑盒 （Genmed Scientifics INC.U.S.A），牛膽鹽、三氯乙酸、硫酸、蒽酮等均為國產(chǎn)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 酵母菌的培養(yǎng) 將7株釀酒酵母分別接種于YPD培養(yǎng)基中，28℃、150 r/min 2次培養(yǎng)（以獲得第二代酵母細(xì)胞）至對(duì)數(shù)期（107～108cfu/mL）。1.2.2 酵母菌膽酸鹽耐受性 取適量制備好的菌懸液，在600 nm波長處用液體YPD培養(yǎng)基調(diào)節(jié)其OD值為 （0.8±0.02）， 在膽鹽濃度為0%、0.30%、0.60%（牛膽鹽，Solarbio，中國）的液體YPD中培養(yǎng)24 h后，參考國標(biāo)GB4789.15-2010，計(jì)算其存活率，計(jì)算公式為：

S/%=[（cfu/mL）YPD+膽鹽×100]/（cfu/mL)YPD。

1.2.3 酵母菌細(xì)胞膜ATPase活性測(cè)定 取10 mL待測(cè)的新鮮真菌/酵母細(xì)胞 （OD600=0.4～0.8），移入到預(yù)冷的15mL錐形離心管中，置于冰槽中5min，離心（1000 g，4 ℃，5 min），抽去上清液，加入 250 μL GENMED裂解液，充分混勻，移入預(yù)冷的1.5 mL離心管中，加入100 mg GENMED強(qiáng)化液，強(qiáng)力渦旋振蕩15 s，置于冰槽中1 min（重復(fù)五次），加入250μLGENMED裂解液，充分混勻，離心（16000 g，4℃，15 min），移取500μL上清液到新的預(yù)冷的1.5 mL離心管，移取10μL進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)（使用GENMED Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒-MS30030.1）。移取730μL GENMED緩沖液到新的比色皿，加入20μL ENMED酶促液，100μL GENMED反應(yīng)液，100μL GENMED底物液，放進(jìn)28℃培養(yǎng)箱里靜置3 min，加入50μL待測(cè)樣品，混勻，即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)：340 nm讀數(shù)0～30 min。樣品ATPase活性計(jì)算公式為：

式中：A 為樣品活性，mg；r1為樣品讀數(shù)；r0為背景讀數(shù)；為x為樣品稀釋倍數(shù)；6.22為毫摩爾吸光系數(shù)；t為反應(yīng)時(shí)間，min。

1.2.4 酵母細(xì)胞胞內(nèi)海藻糖含量測(cè)定 精確稱取鮮酵母0.1 g（稱準(zhǔn)至0.0002 g）于離心管中，加入4.0 mL 0.5 mol/L三氯乙酸溶液于振蕩器振蕩混勻后置于帶有冰塊的冰水中，每15 min振蕩一次，共1 h，于離心機(jī)3000 r/min離心5 min，將上清液倒入50 mL容量瓶中，用冰水洗滌離心管及沉淀，振蕩混勻后，再放如高速離心機(jī)中3000 r/min離心5 min，將上清液倒入50 mL容量瓶中，然后用冰水稀釋至刻度，搖勻。于50 mL容量瓶中加入4.0 mL 0.5 mol/L三氯乙酸溶液，用冰水稀釋至刻度，搖勻，作為空白溶液。吸取空白及樣品1.00 mL于兩個(gè)潔凈干燥的試管中，再分別精確加入蒽酮試液5 mL，振蕩搖勻，沸水浴中反應(yīng)時(shí)間為10 min，拿出立即將樣液溫度冷卻至室溫，再次搖勻，放于分光光度計(jì)630 nm處，用1 cm比色皿測(cè)定吸光度，以空白作對(duì)照。試驗(yàn)樣品中海藻糖積累量的計(jì)算公式為：

式中：X為試樣中海藻糖的百分含量，%；E為試樣的吸光度；6.29為當(dāng)E=1時(shí)，每毫升溶液中含海藻糖的質(zhì)量，mg；W試樣質(zhì)量，g；Ds為試樣干物質(zhì)的百分含量，%。

2 結(jié)果和分析

2.1 不同膽酸鹽濃度環(huán)境培養(yǎng)酵母菌存活率通過高濃度膽酸鹽沖擊試驗(yàn)，采用平板涂布計(jì)算釀酒酵母在不同膽酸鹽濃度環(huán)境的存活率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)7株釀酒酵母均可在高濃度膽酸鹽環(huán)境中生長，7株菌株的存活率都隨膽酸鹽濃度的增加而減小，釀酒酵母培養(yǎng)環(huán)境膽酸鹽濃度對(duì)酵母生長有顯著影響，不同酵母菌株對(duì)環(huán)境膽酸鹽耐受性有差異（表1）。且Y-2、Y-6和Y-7三株釀酒酵母菌株在不同膽酸鹽濃度環(huán)境中的存活率均高于其他菌株。

表1 不同膽酸鹽濃度環(huán)境中菌株的存活率%

2.2 不同膽酸鹽濃度環(huán)境中酵母菌細(xì)胞膜ATPase活性 酵母細(xì)胞質(zhì)膜ATPase屬于膜結(jié)合蛋白，高濃度膽酸鹽脅迫下，酵母細(xì)胞質(zhì)膜結(jié)構(gòu)及其穩(wěn)定性發(fā)生變化從而影響ATPase活性。酵母細(xì)胞處于高濃度膽酸鹽脅迫環(huán)境中時(shí)，通過加強(qiáng)細(xì)胞質(zhì)膜ATPase活性，促進(jìn)Na+/H+的逆向轉(zhuǎn)運(yùn)，從而避免細(xì)胞內(nèi)膽酸鹽濃度過高，保護(hù)其細(xì)胞免受惡劣外界環(huán)境的損害。從表2可知，7株釀酒酵母細(xì)胞質(zhì)膜ATPase活性隨著膽酸鹽的濃度增加而增加，在膽酸鹽的濃度為0.3%時(shí)該酶活性增長較快，隨著膽鹽濃度繼續(xù)增加，酶活性增加幅度變小。且Y-2、Y-6和Y-7這3株菌株在高濃度膽酸鹽環(huán)境培養(yǎng)時(shí)的ATPase活性均高于其他菌株，這一結(jié)果與其細(xì)胞存活率試驗(yàn)結(jié)果一致，因此認(rèn)為，酵母細(xì)胞質(zhì)膜ATPase在維持其細(xì)胞結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定中起到重要作用。由于高濃度膽酸鹽環(huán)境下酵母菌株存活率降低，但其ATPase活性增加，推斷是由于存活的釀酒酵母細(xì)胞在處于高濃度膽酸鹽環(huán)境中時(shí)，其細(xì)胞質(zhì)膜ATPase表達(dá)量增加所致。

表2 7株酵母不同膽酸鹽濃度培養(yǎng)24 h后細(xì)胞質(zhì)膜ATPase活性 μmol/mg

2.3 不同膽酸鹽濃度環(huán)境中酵母菌株胞內(nèi)海藻糖含量 海藻糖不僅是釀酒酵母中重要的貯藏性碳源，還對(duì)細(xì)胞生物膜、蛋白質(zhì)、核酸等大分子物質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性起到重要的作用 （張和笙等，1999）。在惡劣的環(huán)境中，海藻糖可以保護(hù)酵母細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，這得益于其獨(dú)特的物理性質(zhì) （咼于明等，2014）。海藻糖的含量對(duì)高濃度膽酸鹽條件下酵母的存活率起著至關(guān)重要的作用 （黃國宏等，2007）。從表3可知，7株釀酒酵母胞內(nèi)海藻糖積累量隨膽酸鹽濃度的增加而降低，但膽酸鹽耐受性較好的菌株其胞內(nèi)海藻糖積累量始終高于耐受性較差的菌株，說明酵母細(xì)胞內(nèi)的海藻糖確實(shí)對(duì)其細(xì)胞處于高濃度膽酸鹽環(huán)境中起到一定的保護(hù)作用，隨著酵母細(xì)胞生長環(huán)境膽酸鹽濃度的增加，其胞內(nèi)海藻糖積累量降低，可能是由于酵母細(xì)胞處于高濃度膽酸鹽環(huán)境中時(shí)部分酵母細(xì)胞死亡所致。供試的7株釀酒酵母菌株Y-2、Y-6和Y-7胞內(nèi)海藻糖積累量始終高于其余幾株，這與其細(xì)胞存活率試驗(yàn)結(jié)果一致。

表3 釀酒酵母在不同膽酸鹽濃度培養(yǎng)24 h后胞內(nèi)海藻糖積累量%

3 討論

動(dòng)物消化道高濃度膽酸鹽環(huán)境對(duì)釀酒酵母生長具有抑制損害作用，但部分釀酒酵母具有良好的膽酸鹽耐受性（王繼花，2008）。本試驗(yàn)對(duì)肉鴨消化道分離出的7株釀酒酵母進(jìn)行高濃度膽酸鹽沖擊試驗(yàn)，研究了7株肉鴨原籍酵母菌株的膽酸鹽耐受性，并對(duì)其可耐受高濃度膽酸鹽環(huán)境的機(jī)理進(jìn)行了初步探討。7株釀酒酵母菌株均可在高濃度膽酸鹽環(huán)境中生長，其存活率隨膽酸鹽濃度的增加而減小，不同酵母菌株對(duì)環(huán)境膽酸鹽耐受性有差異。這可能是由于酵母生長環(huán)境中高濃度的膽酸鹽對(duì)酵母細(xì)胞結(jié)構(gòu)產(chǎn)生破壞，導(dǎo)致耐受性較差的酵母菌生長繁殖受到抑制甚至死亡。

關(guān)于釀酒酵母細(xì)胞膽酸鹽耐受性機(jī)理研究中，有研究證實(shí)，當(dāng)酵母細(xì)胞長期處于不利于自身生長的惡劣環(huán)境條件中時(shí)，其細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)含量及組分往往會(huì)發(fā)生明顯變化（Bonhivers等，1998）。本試驗(yàn)對(duì)酵母細(xì)胞質(zhì)膜ATPase活性和胞內(nèi)海藻糖積累量進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，7株釀酒酵母細(xì)胞質(zhì)膜ATPase活性與其生長環(huán)境膽酸鹽濃度呈負(fù)相關(guān)，因此推斷隨環(huán)境膽酸鹽濃度的增加，釀酒酵母細(xì)胞質(zhì)膜ATPase大量表達(dá)，通過其自身構(gòu)象的變化保證了酵母細(xì)胞內(nèi)離子的平衡，但隨著膽酸鹽濃度的增加，由于酵母細(xì)胞膜遭到破壞而死亡，其ATPase活性增加幅度變小。7株釀酒酵母胞內(nèi)海藻糖積累量與其生長環(huán)境膽酸鹽濃度呈正相關(guān)，說明酵母細(xì)胞處于高濃度膽酸鹽環(huán)境中時(shí)，其細(xì)胞結(jié)構(gòu)遭到破壞大量死亡，但其存活率較高的菌株海藻糖含量也較高，因此推斷，釀酒酵母細(xì)胞處于高濃度膽酸鹽環(huán)境中時(shí)海藻糖對(duì)其細(xì)胞起到了保護(hù)作用。Y-2、Y-6和Y-7三株菌株細(xì)胞質(zhì)膜ATPase活性與其胞內(nèi)海藻糖積累量變化均與其存活率結(jié)果一致。

4 結(jié)論

肉鴨消化道酵母菌株的膽酸鹽耐受性存在差異，不同菌株的膽酸鹽耐受性與其細(xì)胞質(zhì)膜ATPase活性和胞內(nèi)海藻糖積累量密切相關(guān)。本研究中Y-2、Y-6和Y-7三株釀酒酵母菌株的膽酸鹽耐受性較其余幾株釀酒酵母菌株的膽酸鹽耐受性佳，可作為后續(xù)開發(fā)肉鴨專用飼用酵母益生菌的備選菌株。

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