魏婧瑤， 尤 佳， 盧會(huì)奇， 宋悅陽， 張 玲

（錦州醫(yī)科大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧錦州 121001）

豬鏈球菌作為一種人畜共患病病原菌，其引發(fā)的豬鏈球菌病一直是困擾我國養(yǎng)豬業(yè)的主要傳染病之一。有報(bào)道指出，從帶菌豬體內(nèi)分離出的豬鏈球菌對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類、林可酰胺類和四環(huán)素類等抗生素已產(chǎn)生了高度耐藥性；人體內(nèi)分離出的豬鏈球菌也對(duì)諾氟沙星產(chǎn)生了耐藥性 （何彩美，2012)。尋找對(duì)該菌既有抗菌作用又不易產(chǎn)生耐藥性的天然中藥，將為防治豬鏈球菌病提供新方案，其結(jié)果勢(shì)必具有重大的臨床意義。厚樸酚作為中藥厚樸的有效提取成分（國家藥典委員會(huì)，2010)，已證實(shí)對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏桿菌、枯草芽孢桿菌等都有較好的抑制作用 （付云賀，2013），并且研究發(fā)現(xiàn)厚樸酚對(duì)豬鏈球菌感染的動(dòng)物模型有治療作用（張玲等，2016）。本研究體外觀察厚樸酚對(duì)豬鏈球菌的抑制作用及對(duì)其感染巨噬細(xì)胞的影響，旨在進(jìn)一步完善厚樸酚的藥理作用和抗菌機(jī)制，為獸醫(yī)臨床挑選防治豬鏈球菌病的獸藥提供理論依據(jù)和試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器 SPX-250生化培養(yǎng)箱，購自上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠；SW-CJ-1G超凈工作臺(tái)，購自蘇州凈化設(shè)備有限公司；Thermo science 3111型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，賽默飛世爾科技實(shí)驗(yàn)室；THZ-300恒溫培養(yǎng)搖床，上海一恒科技有限公司；Bio-Rad iMarkTM型酶標(biāo)檢測(cè)儀，購自美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.1.2 主要試劑和菌種 厚樸酚（批號(hào)：563421），購自西安開來生物工程有限公司（純度為98%），試驗(yàn)前，取適量甲醇將其溶解，接著用蒸餾水稀釋至試驗(yàn)所需濃度，最后在超凈臺(tái)下將溶液經(jīng)0.2μm微孔濾膜過濾，備用；MTT，購自美國Sigma公司；腦心浸液培養(yǎng)基，購自中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院北京陸橋技術(shù)有限公司；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清（FBS），購自Gibco公司；豬鏈球菌2型臨床分離株，從遼寧省錦州市屠宰場(chǎng)的50頭豬病料中分離得到，并由中國獸藥監(jiān)察所鑒定；小鼠巨噬細(xì)胞系RAW264.7細(xì)胞株，購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。

1.2 細(xì)菌培養(yǎng) 取臨床分離的豬鏈球菌菌種接種于含血清的腦心浸液固體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)18～24 h，挑單個(gè)菌落接種于含血清的腦心浸液液體培養(yǎng)基中，再37℃靜置培養(yǎng)13～14 h，待用。

1.3 豬鏈球菌生長曲線的測(cè)定 調(diào)整厚樸酚藥液終濃度為50μmol/L，與豬鏈球菌接觸后，每隔4 h取樣一次，然后每孔加入5 mg/mL的MTT溶液20μL，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h后加入100μL DMSO，用酶標(biāo)儀振蕩10 min，在波長為580 nm處測(cè)定培養(yǎng)液的OD值，每個(gè)取樣點(diǎn)重復(fù)3次，取平均值。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪制不同組別的豬鏈球菌生長曲線。

1.4 豬鏈球菌細(xì)胞膜通透性的測(cè)定 調(diào)整厚樸酚藥液終濃度為50μmol/L，與豬鏈球菌接觸后，分別在培養(yǎng) 0、1、2、3、4、5、6、7 h 和 8 h 后取上清液，用電導(dǎo)儀測(cè)定其電導(dǎo)率值，以等體積的無水乙醇作對(duì)照。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)重復(fù)3次，取平均值。

1.5 DNA、RNA等大分子物質(zhì)的測(cè)定 按Chen等（2002）所述方法，測(cè)定終濃度為 50μmol/L厚樸酚溶液與豬鏈球菌分別接觸 0、1、2、3、4、5、6、7 h和 8 h，取上清液，檢測(cè)其中的DNA、RNA等大分子物質(zhì)的吸光值。以不加藥組為對(duì)照。重復(fù)3次，取平均值。

1.6 巨噬細(xì)胞細(xì)胞活性的測(cè)定 用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液調(diào)整RAW264.7濃度（1.0×106個(gè)/mL）接種到6孔板，培養(yǎng)過夜。將菌液濃度按感染復(fù)數(shù)（MOI）為 1∶100 的比例加入培養(yǎng)板，以 1000 r/min室溫離心細(xì)胞培養(yǎng)板 5 min（Wood，2001），置 37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，即為豬鏈球菌組；細(xì)胞與細(xì)菌混合后分別再加入厚樸酚，調(diào)至終濃度為 25、50、100 μmol/L，即為 25 μmol/L 厚樸酚組、50μmol/L厚樸酚組和100μmol/L厚樸酚組，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。按1.3中的方法，在波長為570 nm處測(cè)定各組光密度OD值，每組重復(fù)3次。將對(duì)照組的細(xì)胞活性設(shè)為100%，其他處理組OD值與對(duì)照組相比較計(jì)算其細(xì)胞活性。細(xì)胞活力按照下列公式計(jì)算：

1.7 巨噬細(xì)胞吞噬細(xì)菌數(shù)量的測(cè)定 按1.6中的方法將細(xì)胞進(jìn)行分組培養(yǎng)。培養(yǎng)到期后，用PBS洗掉細(xì)胞外游離細(xì)菌，并添加青霉素至100 U/mL，繼續(xù)培養(yǎng)1 h殺滅細(xì)胞外細(xì)菌。棄上清，用細(xì)胞刮子刮取細(xì)胞，收集細(xì)胞懸液并混勻，取1 mL，以2000 r/min離心10 min，去上清，加入1 mL 0.1%Triton X-100 PBS混勻并裂解細(xì)胞20 min（Zhou等，2007）。 將混懸液（中菌落數(shù))做 1∶10 的倍比稀釋，取各稀釋度10μL接種到固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)過夜。計(jì)數(shù)平板菌落數(shù)。

1.8 炎癥因子水平的測(cè)定 按1.6中方法分組培養(yǎng)細(xì)胞24 h，然后取細(xì)胞上清液，待測(cè)。所有試劑使用前置于室溫，標(biāo)準(zhǔn)品及樣品至少做三個(gè)重復(fù)，而且每次分析均做標(biāo)準(zhǔn)曲線。向每個(gè)酶標(biāo)板孔中加入100μL標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液或樣品，再各加入50μL抗體稀釋液，封板，振蕩孵育3 h。每孔加入100μL辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗生物素蛋白，封板，室溫孵育30 min。棄液，洗板，每孔依次加入顯色劑底物TMB和終止液。反應(yīng)終止后30 min內(nèi)讀取吸光值，檢測(cè)炎癥因子：腫瘤壞死因子（TNF-α）、 白細(xì)胞介素-1β （IL-1β）、 白細(xì)胞介素-6（IL-6）和白細(xì)胞介素-8（IL-8）的水平。

2 結(jié)果

2.1 厚樸酚對(duì)豬鏈球菌生長曲線的影響 由圖1可知，豬鏈球菌經(jīng)過培養(yǎng)初期的遲緩生長后，快速進(jìn)入對(duì)數(shù)期；而被厚樸酚干預(yù)的細(xì)菌的生長幅度則較豬鏈球菌組低約68.8%，差異具有顯著性（P＜0.05)，說明厚樸酚可以顯著抑制豬鏈球菌生長，使其不能進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期。

2.2 厚樸酚對(duì)豬鏈球菌細(xì)胞膜通透性的影響由圖 2a可知，厚樸酚作用豬鏈球菌后，培養(yǎng)液的電導(dǎo)率隨時(shí)間增加而增大，且除0 h外，厚樸酚組各時(shí)間點(diǎn)的電導(dǎo)率較豬鏈球菌組均有4.2%左右的增加，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 （P＜0.05）；在厚樸酚作用后的培養(yǎng)液內(nèi)，大分子物質(zhì)的吸光值并沒有與細(xì)菌組有明顯差別，如圖2b所示。上述結(jié)果表明，厚樸酚能夠改變豬鏈球菌細(xì)胞膜的通透性，但并不能將其破壞，說明豬鏈球菌細(xì)胞膜不是厚樸酚作用的靶點(diǎn)。

圖1 厚樸酚對(duì)豬鏈球菌生長曲線的影響

圖2 厚樸酚對(duì)豬鏈球菌培養(yǎng)液電導(dǎo)率（a）和大分子物質(zhì)吸光值（b）的影響

2.3 厚樸酚對(duì)感染豬鏈球菌巨噬細(xì)胞活性的影響 由圖3可知，各組細(xì)胞處理24 h后，豬鏈球菌組的細(xì)胞活性較空白組降低38.4%（P＜0.01），而三個(gè)厚樸酚處理組的細(xì)胞活性均較豬鏈球菌組有顯著性改善（P＜0.05），分別提升了9.8%、19.19%和26.8%，且細(xì)胞活性的改善與厚樸酚濃度呈正相關(guān)，但與空白組仍存在差異（P ＜ 0.05）。

2.4 厚樸酚對(duì)染菌巨噬細(xì)胞吞噬細(xì)菌數(shù)量的影響 由表1可見，豬鏈球菌與厚樸酚接觸后，三個(gè)用藥組的巨噬細(xì)胞吞噬細(xì)菌數(shù)量較豬鏈球菌組分別有2倍、3倍和5倍量的增加，差異具有顯著性（P＜0.01)，且被吞噬細(xì)菌的數(shù)量與厚樸酚的濃度呈正相關(guān)，不同藥物組之間也有明顯差別。

圖3 厚樸酚對(duì)感染豬鏈球菌巨噬細(xì)胞活性的影響

表1 厚樸酚對(duì)染菌巨噬細(xì)胞吞噬細(xì)菌數(shù)量的影響（n=6)

2.5 厚樸酚對(duì)巨噬細(xì)胞炎癥因子水平的影響如表2所示，豬鏈球菌組TNF、IL-1β、IL-6和IL-8的水平分別較空白組提高4.6倍、19.7倍、40.31倍和2.85倍（P＜0.01）；使用不同劑量厚樸酚干預(yù)后，炎癥因子水平均較豬鏈球菌組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的下降（P＜0.01），其中最大劑量100μmol/L厚樸酚組的四個(gè)炎癥因子水平較豬鏈球菌組分別降低了65.5%、72.8%、69.5%和65.1%，但與空白組間仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.01）；炎癥因子水平隨著藥物濃度的增加而下降。

表2 厚樸酚對(duì)巨噬細(xì)胞炎癥因子水平的影響 （n=3） pg/mL

3 討論

本試驗(yàn)研究厚樸酚對(duì)豬鏈球菌的作用，發(fā)現(xiàn)該藥可通過改變細(xì)菌細(xì)胞膜的通透性發(fā)揮抑菌作用，但對(duì)細(xì)胞膜并沒有達(dá)到破壞效果，說明豬鏈球菌細(xì)胞膜并不是厚樸酚作用的靶點(diǎn)。本次研究還發(fā)現(xiàn)，厚樸酚可顯著改善被豬鏈球菌感染的巨噬細(xì)胞活性，可有效提高巨噬細(xì)胞對(duì)細(xì)菌的吞噬數(shù)量（P＜0.01)，且這些改善效果都與藥物濃度呈正相關(guān)。說明厚樸酚對(duì)豬鏈球菌感染的療效與改善巨噬細(xì)胞活性和吞噬力有關(guān)。

細(xì)胞因子是固有免疫應(yīng)答階段產(chǎn)生的免疫效應(yīng)分子，根據(jù)細(xì)胞因子的作用特點(diǎn)將其劃分為促炎細(xì)胞因子和抗炎細(xì)胞因子。TNF-α、IL-1β、IL-6和 IL-8等促炎細(xì)胞因子可增強(qiáng)機(jī)體或細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，其濃度變化是考察炎癥發(fā)生程度和藥物治療效果的一個(gè)重要指標(biāo)。受細(xì)菌或者病毒刺激的組織或細(xì)胞也通過釋放促炎細(xì)胞因子誘發(fā)炎癥（Tosi等，2005）。而抗炎介質(zhì)，如抗炎藥物及抗炎細(xì)胞因子等，在炎癥發(fā)生時(shí)可通過下調(diào)促炎因子的水平，降低炎癥反應(yīng)（仲偉婷等，2012）。本次研究發(fā)現(xiàn)厚樸酚可有效下調(diào)被豬鏈球菌感染的巨噬細(xì)胞釋放促炎細(xì)胞因子水平，與仲偉婷等（2012）的厚樸酚可下調(diào)LPS誘導(dǎo)細(xì)胞因子釋放的結(jié)果相一致。關(guān)于厚樸酚抑制豬鏈球菌感染的相關(guān)作用位點(diǎn)和信號(hào)通路還有待進(jìn)一步研究。

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