趙 丹，楊禹宸，楊志峰，蘇婧暄

（山西農業(yè)大學信息學院，山西太谷030800）

現(xiàn)代研究表明，腸道中的有益菌群對人類健康有重要影響，可以增強人體識別和排除異己的反應、加快腸道蠕動等[1-3]。腸道中重要的生理性菌群有乳桿菌、雙歧桿菌、鏈球菌等[4]。在人體胃腸內有著400多類微生物，數(shù)量超過1.0×1015個，雙歧桿菌是其中之一，它擁有加強免疫和防備患病的生理作用，例如，生物屏障、加強免疫、增強胃腸動力、加快維生素分解等多類生理功效[5-6]。酸奶的營養(yǎng)價值受到大眾越來越多的關注，降低血清膽固醇水平、緩解乳糖不耐癥、控制腹瀉癥狀、增強免疫系統(tǒng)、控制炎癥性腸病以及結腸癌及防止便秘的功能都離不開益生菌的存在[7-8]。因此，建立一種及時有效的檢測酸奶中雙歧桿菌濃度的方法對消費者具有重要的意義。

傳統(tǒng)方法原理簡單，但分離種類復雜，檢測靈敏度偏低[9-11]。熒光定量PCR可以準確地檢測雙歧桿菌含量，但成本較高[12-15]。本研究采用聚合酶鏈式反應來檢測雙歧桿菌，該檢測方式是以雙歧桿菌的基因為模板，驗證引物的可行性及靈敏度，然后再通過使用凝膠成像分析系統(tǒng)圖像分析法檢測灰度值，根據(jù)已知雙歧桿菌的濃度和灰度值進行相關性分析，建立線性方程式[16-17]。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料 乳雙歧桿菌菌屬來源于山西農業(yè)大學信息學院微生物實驗室；蒙牛冠益乳、天潤酸奶、伊利大果粒、伊利優(yōu)酸乳、君樂寶每日活菌均購自超市。

1.1.2 試劑 PCR引物，DNA Maker，TRIS，Goldeen view，EDTA，瓊脂糖，電泳緩沖液，DNA提取試劑盒全部購自上海生工公司；氯仿、異丙醇、乙醇均為分析純。

1.1.3 主要儀器 培養(yǎng)箱、PCR儀、-20℃冰箱、冷凍離心機、滅菌鍋、電子天平、pH計、電泳儀、凝膠成像系統(tǒng)。

1.2 方法

1.2.1 引物設計 根據(jù)NCBI網(wǎng)站查找的雙歧桿菌16S rDNA的特異基因序列，通過生物信息學網(wǎng)站Primer3 Input（http://primer3.ut.ee/）設計引物，上游引物為：TCTGGCTCAGGATGAACGC；下游引物為：CACCGTTACACCGGGAATTC，目的擴增區(qū)間1 500 bp。

1.2.2 酸奶中總DNA提取 在研缽中放入5 mL檸檬酸鹽溶液 （含 10.0 mg蛋白酶及 8.0%的SDS）和1 mL發(fā)酵乳混合研磨，充分混合后移入EP管中，搖動混勻；在60℃水浴保溫30 min；拿出離心管，以13 000 r/min離心10 min，取上面液體放入新的離心管；棄上清液，用DNA提取試劑盒提取DNA，分別在260，280 nm波長處評估DNA純度。-20℃保存。

1.2.3 擴增方法 利用試驗引物，PCR擴增體系共 25 μL。10×PCRbuffer 2.5 μL，上下游引物各1.0 μL，dNTP Mixture 2.0 μL，去離子水補足 25 μL。PCR反應條件：94℃（30 s）→56℃（30 s）→68 ℃（1.5 min）進行35個循環(huán)。

2 結果與分析

2.1 基因組DNA的提取

通過DNA提取試劑盒進行雙歧桿菌基因組DNA的提取，提取的DNA通過分光光度計檢測OD值，并在260，280 nm波長處進行OD260/280比值檢測，以鑒定DNA純度。經(jīng)測定，提取的DNA OD260/280比值均在1.8左右，說明DNA純度良好。

2.2 引物特異性檢驗

以從自制純酸奶（未添加雙歧桿菌）、純種雙歧桿菌和人工接種乳雙歧桿菌的酸奶中提取的DNA為模板，進行PCR擴增及電泳檢測，結果如圖1所示。試驗設置空白對照組，對照組未添加任何DNA模板，結果顯示，對照組無條帶，表明本體系無外源DNA的干擾，能特異性擴增出雙歧桿菌的條帶。

2.3 引物靈敏性檢驗

為檢驗本PCR體系的檢驗精度，本試驗進行人為污染設置，即將不同濃度的雙歧桿菌接種于未污染的酸奶中，最終得到雙歧桿菌濃度為2×105cfu/mL（稀釋 5 倍），1.0×105CFU/mL（稀釋 10 倍），0.75×105cfu/mL（稀釋 15 倍），0.5×105cfu/mL（稀釋 20 倍），0.2×105cfu/mL（稀釋50倍）5種不同濃度的雙歧桿菌接種的酸奶，命名為1～5號樣品。

分別將試驗樣品進行DNA提取，以總基因為模板，進行PCR體外擴增及電泳檢測（圖2）。PCR結果顯示，隨著樣品中雙歧桿菌含量的減少，PCR擴增條帶亮度依次減弱，檢驗準確性降低。為了保證分子生物學手段檢測的準確性，本次試驗檢測雙歧桿菌含量的最低值為0.75×105cfu/mL。

2.4 標準方程的建立

利用凝膠成像系統(tǒng)IMAGE對圖2中5種樣品的泳帶圖像進行灰度值測試，以構建雙歧桿菌濃度與電泳條帶灰度值的對應關系，形成線性方程式。圖3以雙歧桿菌濃度為縱坐標，以灰度值為橫坐標，得到回歸方程 y＝0.142x＋0.078，R2＝0.995。根據(jù)此線性方程式，對待檢測樣品進行雙歧桿菌DNA的提取并擴增、電泳，根據(jù)電泳條帶灰度值，可知樣品中雙歧桿菌的濃度。

2.5 檢測體系的應用

速檢測酸奶中雙歧桿菌濃度，將市售的蒙牛冠益乳、天潤酸奶、伊利大果粒、伊利優(yōu)酸乳、君樂寶每日活菌5種發(fā)酵乳應用本體系進行實際檢測，結果表明，不同廠家生產(chǎn)的發(fā)酵乳中雙歧桿菌含量有所不同，有些產(chǎn)品（如伊利大果粒、伊利優(yōu)酸乳）中雙歧桿菌含量并未達到其產(chǎn)生生理功效的含量（表1）。

上述試驗建立了新型的分子生物學體系，以快

表1 不同品牌酸奶中雙歧桿菌濃度的檢測

3 結論

發(fā)酵乳中蛋白和脂肪含量較高，對提取其中所含乳酸菌DNA有一定影響，本試驗提取前處理中，加入蛋白酶E和SDS能有效水解乳蛋白，去除脂肪，以獲取高純度DNA。最終本試驗中使用DNA均為OD260/280比值在1.8左右的高純度、高質量DNA。

本試驗設計通用引物對雙歧桿菌16SrRNA基因進行擴增，結果表明，引物設計成功，且通過無模板對照試驗表明本體系無外源基因干擾。為了保證分子生物學手段檢測的準確性，引物靈敏性試驗表明，本試驗體系檢測雙歧桿菌含量的最低值為0.75×105cfu/mL。

最終，本試驗建立了基于凝膠成像系統(tǒng)灰度值的檢測體系：將待檢測發(fā)酵乳樣品進行雙歧桿菌DNA的提取，通過通用型引物進行PCR擴增后進行凝膠電泳，利用凝膠成像系統(tǒng)對樣品的泳帶圖像進行灰度值測試。根據(jù)線性方程式y(tǒng)＝0.142x＋0.078，R2＝0.995，可得樣品中雙歧桿菌的濃度。

將市售的5種發(fā)酵乳應用本體系進行檢測，結果表明，本試驗體系具有操作簡便、直接、節(jié)省樣本等特點，不同廠家生產(chǎn)的發(fā)酵乳中雙歧桿菌含量有所不同，有些產(chǎn)品中雙歧桿菌含量并未達到其產(chǎn)生生理功效的含量，消費者購買時需謹慎。

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