王坤芃，彭志鋒，劉盼盼，王繼洋，王 艷，王川慶，楊 霞*

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 牧醫(yī)工程學(xué)院，河南 鄭州 450002； 2.河南牧業(yè)經(jīng)濟學(xué)院 動物醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450002)

鴨源雞桿菌(Gallibacteriumanatis,G.anatis)是巴氏桿菌科雞桿菌屬的一個代表性菌種[1-2]。G.anatis為條件性致病菌，常寄生于雞上呼吸道和下生殖道，主要引起雞輸卵管炎和腹膜炎等，導(dǎo)致蛋雞產(chǎn)蛋數(shù)量和質(zhì)量下降、死亡率增加，給養(yǎng)禽業(yè)帶來巨大經(jīng)濟損失[3-6]。濫用抗生素使得G.anatis多重耐藥嚴(yán)重[7-9]，目前尚無有效預(yù)防措施。為了預(yù)防G.anatis感染，探究其致病機制及研發(fā)新型疫苗是當(dāng)前的研究熱點。

菌毛是細(xì)菌表面的一種毛發(fā)樣的蛋白結(jié)構(gòu)，其在細(xì)菌粘附宿主過程中發(fā)揮重要作用，而且還是多種細(xì)菌的重要毒力因子[10-11]。Bager等[12]研究發(fā)現(xiàn)，G.anatis12565/12缺失flfA基因后，對雞只的致病力顯著下降。G.anatis可粘附于雞口咽原代上皮細(xì)胞[13-14]，菌毛在其中發(fā)揮的作用還不得而知。探明菌毛的作用不僅對G.anatis致病機制的研究具有重要意義，而且可為新型疫苗的研發(fā)提供候選方向。為此，采用PCR方法檢測了18株G.anatis的菌毛基因flfA，并對其進行克隆及功能區(qū)域分析，以期為G.anatis防控及新型疫苗的研發(fā)提供參考。

1 材料和方法

1.1 菌株

PDS-RZ-1-SLG等18株G.anatis由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)傳染病教研室保存[3]；pMD18-T載體購于寶生物工程(大連)有限公司。18株參試G.anatis信息具體見表1。

1.2 主要試劑

綿羊血瓊脂平板購自鄭州安圖生物工程有限公司；蛋白胨、酵母提取物購自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；DL2000 DNA Marker、TaqDNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶NcoⅠ和XhoⅠ、T4 DNA連接酶等購自寶生物工程(大連)有限公司；DNA膠回收試劑盒、DNA產(chǎn)物純化試劑盒、質(zhì)粒DNA小量抽提試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

表1 18株參試G.anatis菌株信息

1.3 引物設(shè)計

參考G.anatisUMN179的flfA基因序列，使用Primer Premier 5.0設(shè)計1對擴增flfA全基因的特異性引物，上游引物flfA-F：5′-TAATTCTGGAGGAGTATTTAAAAAATG-3′，下游引物flfA-R：5′-AATCTGCCCGATAAGTGGAAAAAG-3′，預(yù)期片段大小為620 bp左右。

1.4 菌株培養(yǎng)

取-70 ℃保存的18株G.anatis甘油菌分別劃線接種于綿羊血瓊脂平板，37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)18 h，分別挑單菌落接種于含5%血清的BHI液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min過夜培養(yǎng)18 h。

1.5 細(xì)菌基因組提取

采用煮沸法粗提細(xì)菌基因組：分別取1 mL的供試菌株過夜培養(yǎng)物，8 000 r/min離心5 min；棄去上清液，用100 μL ddH2O重懸菌體，沸水煮10 min，再冰浴5 min，10 000 r/min離心5 min；取上清于新的EP管內(nèi)，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 flfA基因的克隆及序列分析

PCR擴增采用50 μL反應(yīng)體系。反應(yīng)條件為：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，共35個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。并將參考菌株UMN179擴增產(chǎn)物設(shè)置為陽性對照。PCR擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。將膠回收純化的PCR產(chǎn)物連接到pMD18-T載體上，再轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞，將PCR和雙酶切鑒定為陽性的質(zhì)粒進行測序鑒定。

將18株G.anatisflfA基因核苷酸序列及UMN179的flfA核苷酸序列進行比對，通過MEGA 5.2軟件繪制系統(tǒng)發(fā)育進化樹并對其進行遺傳進化分析。

1.7 FlfA氨基酸序列同源性分析

從18株G.anatis中挑選ZZ-HL-1-SLG、YZ-11-XZ、SHAN-XY-4-SLG、ZZ-XY-1-SLG和PDS-RZ-1-SLG 5株進行FlfA氨基酸序列比對分析，使用MEGA 5.05軟件對5株G.anatis進行遺傳進化分析。

1.8 FlfA理化性質(zhì)分析

使用在線軟件Protparam(http://www.expasy.org/tools/protparam.html)分別分析FlfA的分子質(zhì)量、等電點及氨基酸組成等。使用 Proscale(http://web.expasy.org/protscale/)在線軟件分析FlfA的親水性與疏水性。

1.9 FlfA蛋白B細(xì)胞抗原表位的預(yù)測

使用DNAStar軟件中的MegAlign程序?qū)lfA基因推導(dǎo)氨基酸序列進行同源性比對分析，使用Protean程序預(yù)測FlfA可能存在的線性B細(xì)胞優(yōu)勢抗原表位。

2 結(jié)果與分析

2.1 flfA基因PCR擴增結(jié)果

分別以18株G.anatis分離株的基因組為模板，擴增flfA全基因。擴增產(chǎn)物經(jīng)1%凝膠電泳檢測，在約620 bp處均有1條特異條帶(圖1)。測序結(jié)果顯示，18株G.anatis均具有F17樣菌毛結(jié)構(gòu)蛋白編碼基因。18株G.anatisflfA基因核苷酸序列登錄號分別為KX268327.1—KX268344.1。

M：DL2000 DNA Marker；1—18:國內(nèi)18株G.anatis分離株的擴增結(jié)果；19：陽性對照；20：空白對照

2.2 基于flfA核苷酸序列的G.anatis系統(tǒng)進化分析

基于flfA核苷酸序列，分析18株G.anatis分離株系統(tǒng)進化關(guān)系，并分析其核苷酸同源性。結(jié)果顯示，18株G.anatis分離株flfA基因核苷酸同源性為70.2%～99.8%。不同地區(qū)的18株G.anatisflfA核苷酸序列與UMN179的核苷酸序列對比，同源性為34.6%～69.0%。從構(gòu)建的進化樹可以看出，18株國內(nèi)分離株與參考菌株UMN179分布于3個基因進化群。第一大分支上有10株G.anatis，其中UMN179與SHAN-XY-1-QG在此分支上，其同源性為100%；第二大分支上只有SHAN-XY-4-SLG和ZZ-XY-1-SLG，兩者同源性為100%；第三大分支包括PDS-RZ-1-SLG在內(nèi)的7株G.anatis，其中LH-BJT-11-SLG、XX-HJ-4-SLG、YQ-2-5-SLG和PDS-RZ-1-SLG的同源性為100%(圖2)。

2.3 FlfA氨基酸序列同源性分析

選取ZZ-HL-1-SLG、YZ-11-XZ、SHAN-XY-4-SLG、ZZ-XY-1-SLG和PDS-RZ-1-SLG等5株G.anatis分離株進行flfA編碼氨基酸序列分析。5株國內(nèi)分離株間氨基酸序列同源性為63.1%～98.8%，與參考株UMN179的FIfA氨基酸同源性為13.1%～58.6%。FlfA氨基酸存在6個高變區(qū)，分別是17、25—30、123、125、164—165位氨基酸及169—170位氨基酸(圖3)。

2.4 FlfA的理化性質(zhì)

通過使用在線軟件對G.anatisPDS-RZ-1-SLG菌毛蛋白FIfA的理化性質(zhì)進行分析，結(jié)果表明，F(xiàn)lfA由190個氨基酸殘基組成，等電點為6.72，其理論分子質(zhì)量為19.79 ku；FlfA由19種氨基酸組成，含量最高的氨基酸殘基有A(14.2%)、T(13.7%)、L(10.0%)，含量較低的氨基酸殘基有R(1.1%)、C(1.1%)、H(1.1%)。FIfA理論半衰期為30 h，不穩(wěn)定系數(shù)為12.42，屬于穩(wěn)定性蛋白；其主要疏水性部位是21—27、42—50、98—106、109—120、137—170位氨基酸，主要親水性部位是1—20、32—37、92—98、121—129、172—181位氨基酸。

2.5 FlfA線性B細(xì)胞抗原表位預(yù)測

通過預(yù)測FlfA蛋白不同同系物的B細(xì)胞抗原表位可得，主要線性B細(xì)胞抗原表位有6～8個，分別位于23—35、50—60、65—75、85—95、100—110、115—125、140—160、175—185位氨基酸。這些抗原表位均處于較保守的區(qū)域(圖4)。

?：從flfA基因群的不同分支中選取的進行氨基酸序列比對和B細(xì)胞抗原表位預(yù)測的菌株序列圖2 基于G.anatis flfA全基因序列的系統(tǒng)進化分析

圖3 G.anatis FlfA氨基酸序列的6個高變區(qū)

圖4 G.anatis FlfA蛋白的B細(xì)胞抗原表位預(yù)測

3 結(jié)論與討論

菌毛是大多數(shù)革蘭氏陰性菌及少數(shù)革蘭氏陽性菌菌體表面的絲狀蛋白附著物。G.anatis菌毛蛋白具有抗原性，與其致病性有關(guān)。為深入了解G.anatisFlfA功能，利用生物信息學(xué)技術(shù)進行分析，為進一步研究其致病機制及防控措施提供基礎(chǔ)。

菌毛在病原菌識別、粘附宿主細(xì)胞過程中發(fā)揮著重要作用，能使病原菌粘附于宿主細(xì)胞表面，如粘附于呼吸道、消化道和泌尿生殖道黏膜上皮細(xì)胞[15]。F17樣菌毛能夠結(jié)合宿主細(xì)胞的N-乙酰氨基葡萄糖(Glc-NAc)[10]。F17樣菌毛形成需要基因簇的表達(dá)，編碼F17樣菌毛的基因簇由4個基因構(gòu)成，分別為結(jié)構(gòu)蛋白編碼基因flfA(大小為5 070 bp)、導(dǎo)向蛋白編碼基因flfC、周質(zhì)伴侶蛋白編碼基因flfD和粘附素編碼基因flfG[12]。FlfA在FlfD和FlfC的輔助下分泌到胞外，并完成折疊、組裝，以此構(gòu)成了菌毛的主干；FlfG位于菌毛的頂部，主要作用是識別與結(jié)合受體[16]。在G.anatis基因組中鑒定到F17菌毛的基因簇[17]。本研究結(jié)果顯示，G.anatis分離株普遍含有F17樣菌毛結(jié)構(gòu)蛋白編碼基因flfA，提示F17樣菌毛可能在該菌致病過程中發(fā)揮重要的作用。

本研究中，18株G.anatis分離株的flfA基因同源性為70.2%～99.8%；系統(tǒng)發(fā)育進化樹分析顯示，18株G.anatis分布于三大分支。YZ-14-QG、ZK-XC-7-QG、LH-BJT-6-SLG和UMN179等構(gòu)成第一分支；SHAN-XY-4-SLG和ZZ-XY-1-SLG等構(gòu)成第二分支；YZ-11-XZ、ZZ-HL-2-GZ和 PDS-RZ-1-SLG等構(gòu)成第三分支；在第一分支中YZ-14-QG、ZZ-HL-1-SLG、XX-HJ-6-SLG與SHAN-XY-1-GZ的flfA核苷酸同源性為100%；第三分支中LH-BJT-11-SLG、XX-HJ-4-SLG、YQ-2-5-SLG和PDS-RZ-1-SLG的flfA核苷酸同源性為100%。SHAN-XY-1-QG株與UMN179株在同一分支且親緣關(guān)系較近，與PDS-RZ-1-SLG親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)。不同省份的菌株在三大分支上均有分布，以上結(jié)果提示，G.anatisflfA的保守性與菌株分離地域無關(guān)。對5株不同的flfA基因推導(dǎo)的氨基酸序列分析發(fā)現(xiàn)，氨基酸同源性為63.1%～98.8%，氨基酸序列變異區(qū)發(fā)生在同一位置，存在6個高變區(qū)，引起突變的主要原因是缺失，但是并未改變FlfA氨基酸編碼序列，因此保證了其功能的穩(wěn)定性。

Lucio等[13]發(fā)現(xiàn)，flfA基因編碼的菌毛蛋白在G.anatis粘附黏膜上皮細(xì)胞及生物被膜形成中發(fā)揮重要作用，是其重要毒力因子之一，并且具有良好的免疫原性[12]。因此，菌毛蛋白在疫苗研制和診斷試劑開發(fā)等方面具有重要意義，而抗原表位在免疫識別和結(jié)合過程中發(fā)揮著重要作用，可直接影響疫苗的免疫效果。動物免疫重組菌毛蛋白后可產(chǎn)生有效的保護性抗體，因此菌毛蛋白是G.anatis亞單位疫苗的潛在候選抗原[18-19]。本研究對G.anatisFlfA線性B細(xì)胞抗原表位進行預(yù)測發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)lfA蛋白具有6～8個優(yōu)勢抗原表位，且分布于序列保守區(qū)。由此推測，不同的FlfA蛋白間存在著較強的交叉免疫反應(yīng)，可作為疫苗候選抗原。

本研究成功克隆出G.anatis中國分離株flfA基因，并預(yù)測其分子生物學(xué)特征，其編碼蛋白是位于病原菌表面且保守性較高的蛋白質(zhì)。FlfA蛋白優(yōu)勢抗原表位均位于序列保守區(qū)，表明該蛋白質(zhì)可作為疫苗的候選蛋白之一。

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