曹晶晶，楊衛(wèi)杰，曹 軼

(1. 河南醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，鄭州 451191； 2. 河南科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院，河南 洛陽 471003)

過度運動易導(dǎo)致葡萄糖和糖原等能源耗盡，并會誘發(fā)血清乳酸(Lac)和血尿素 (BUN) 等代謝物過度積累從而引起疲勞[1]。另外人體在劇烈運動時也易產(chǎn)生過多的自由基，破壞細胞結(jié)構(gòu)尤其是線粒體，并通過變性、交聯(lián)、斷裂或解聚等影響生物大小分子活性，加重運動性疲勞。近年來，尋找天然藥用食用植物來緩減疲勞成為熱點。研究顯示，蘆筍、黃秋葵和繡線菊都具有抗疲勞效果[2-4]。

刺梨又名文先果、送春歸、繅絲花，是薔薇科薔薇屬落葉灌木，原產(chǎn)云貴高原，四川、江西、湖北等省也有引種栽培，含有豐富的維生素C(Vc)、超氧化物歧化酶(SOD)、黃酮、多糖及多種人體必需的氨基酸。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)主要以根和果實入藥，用于消食、止瀉、解暑及積食腹脹、痢疾、腸炎、高血壓、血管破裂出血、維生素C缺乏癥等疾病的治療。此外，刺梨還具有調(diào)節(jié)機體免疫功能、解毒、鎮(zhèn)靜、延緩衰老、抗動脈粥樣硬化、抗腫瘤、清除體內(nèi)自由基等功能[5-6]。本文利用刺梨多糖對小鼠抗疲勞進行研究，為刺梨的可持續(xù)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 KM小鼠體質(zhì)量(16±2)g，購自中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院(合格證號湘檢證字2008-0002)。在溫度(23±3) ℃、相對濕度為50%的動物房中飼養(yǎng)，實驗20 d期間每天秤量小鼠的體質(zhì)量并記錄。

1.1.2 藥物和試劑 刺梨采集于貴州貴陽、青巖等地，經(jīng)漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校趙喜蘭副教授鑒定為RosaroxburghiiTratt.f.normalisRehd.etWils的果實；血糖試劑盒(北京博邁斯生物科技有限公司，批號20140412)；糖原檢測試劑盒(北京博邁斯生物科技有限公司，批號20140908)；乳酸試劑盒(武漢艾美捷科技有限公司，批號141102)；乳酸脫氫酶試劑盒(LDH)、磷酸肌酸激酶(CK)、尿素氮(BUN)、超氧化歧物酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽(GSH)和丙二醛 (MDA) 測定試劑盒(南京建成生物工程有限公司，批號150312、141209、150918、151204、150823、150728、150926)，其他均為分析純。

1.1.3 儀器 TGL-16 M 高速臺式冷凍離心機(湖南湘儀有限公司)；RE2000 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；SHB-III循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工有限公司)；UV power 紫外可見光分光光度計(北京萊伯泰科儀器股份有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 刺梨多糖的制備 精密稱量干燥刺梨10 kg，烘干粉碎后按照1∶5固液比加蒸餾水煎煮1 h，煎煮3次過濾合并提取液，減壓濃縮后加入5倍體積的無水乙醇進行沉淀，過濾得粗多糖和上清液。上清液離心、減壓濃縮得上清液多糖(Supernatant polysaccharide ofRosaroxburghiiTratt.f.normalisRehd.etWils，SRR)，而粗多糖蒸餾水溶解，加15%的三氯乙酸沉淀蛋白質(zhì)過濾，濃縮上清液，冷凍干燥得刺梨多糖(Polysaccharide ofRosaroxburghiiTratt.f.normalisRehd.etWils,PRR)。SRR和PRR都保存在4 ℃冰箱中備用。

1.2.2 PRR和SRR中多糖含量的多糖含量的測定 (1)多糖標準曲線的繪制：精密秤定蒽酮0.1 g置于50 mL 量瓶中，乙酸乙酯定容、搖勻，即得0.20%蒽酮-乙酸乙酯顯色劑。精密秤定無水葡糖糖100 mg，溶于50 ml的蒸餾水，配置成2 mg/ml 的葡萄糖溶液。準確吸取葡萄糖標準溶液0、1、2、3、4、5 ml，分別置于25 ml的據(jù)塞試管中，蒸餾水定容。精密量取1 ml，加4 ml 濃硫酸搖勻，5 min 后加1 mL 顯色劑搖勻。置于100 ℃水浴加熱10 min，取出速冷至室溫后，以6 mL 對照品溶液為空白試劑，波長600 nm測定吸光度。以吸光值為縱坐標，濃度為橫坐標繪制標準曲線，回歸方程Y=3.956X-0.0078，r=0.9997(線性范圍為0.040～0.20 mg/mL)。(2)PRR和SRR中多糖含量測定：取PRR和SRR各0.1 g加入100 ml容量瓶中，蒸餾水定容得供試液。精密量取供試液1 mL，同“2.1”項下顯色，在波長600 nm測定吸光度計算多糖含量。

1.2.3 小鼠負重游泳實驗 72只雌性小鼠隨機分為正常組、陽性對照(靈芝西洋參口服液，3 ml/kg)組、PRR(200、400、800 mg/kg)組、SRR(200、400、800 mg/kg)組，正常組灌胃給予相同體積的生理鹽水，給藥組給予相應(yīng)的藥物，每日1次。連續(xù)灌胃20 d，最后1 d灌胃結(jié)束后將小鼠置游泳箱中游泳。水深不少于30 cm，水溫(25±1.0) ℃，鼠尾根部負荷5%體質(zhì)量的鉛皮。記錄小鼠自游泳開始至沉入水底10s不動為小鼠游泳時間。

1.2.4 小鼠自由游泳實驗 54只小鼠隨機分為正常組、模型組、陽性對照(靈芝西洋參口服液，3 ml/kg)組、PRR組(200、400、800 mg/kg)。正常組、模型組灌胃給予相同體積的生理鹽水，給藥組給予相應(yīng)的藥物，每日1次。連續(xù)灌胃PRR 20 d，最后1次灌胃后，將小鼠置游泳箱中自由游泳30 min，麻醉小鼠摘除眼球取血，離心得血清，4 ℃保存待測磷酸肌酸激酶(CK)、血清尿素氮(BUN)、乳酸(Lac)、乳酸脫氫(LDH)等生化指標。另取小鼠右腿腓腸肌測定肌糖原，同時迅速取肝臟，生理鹽水清洗，測定肝糖原和SOD、CAT、GSH和MDA等生化指標。

2 結(jié)果

2.1 多糖含量的測定

硫酸-蒽酮顯色法顯示，PRR中的多糖含量為(72.13%±0.45)%，SRR中的多糖含量為(12.45%±0.15)%。

2.2 PRR和SRR對小鼠體質(zhì)量的影響

表1顯示，PRR和SRR給藥組小鼠體質(zhì)量與正常組小鼠體質(zhì)量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明PRR和SRR對小鼠的體質(zhì)量不會產(chǎn)生影響。陽性對照組、PRR各劑量組小鼠負重游泳時間明顯長于正常組 (P<0.01)，并呈劑量依賴性。SRR 800 mg/kg劑量組小鼠負重游泳時間明顯長于正常組 (P<0.05)，其余劑量組的負重游泳時間有所提高，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 PRR和SRR對小鼠體質(zhì)量的影響

注：與正常組比較:*P<0.05,**P<0.01

2.3 PRR對自由游泳小鼠的血糖、肌糖原和血清尿素的影響

表2顯示，模型組小鼠血清中的血糖和肌糖原較正常組明顯降低，而血清尿素明顯升高(P<0.01)，靈芝西洋參口服液組和PRR不同劑量組小鼠血清中的血糖和肌糖原較模型組均明顯升高，血清尿素明顯降低 (P<0.05)并呈劑量依賴性。

表2 PRR對小鼠血糖、肌糖原和血清尿素的影響

注：與正常組比較:##P<0.01；與模型組比較:*P<0.05,**P<0.01

2.4 PRR對自由游泳小鼠的乳酸、乳酸脫氫酶和肌酸激酶的影響

表3顯示，模型組小鼠經(jīng)過自由游泳30 min后，乳酸、乳酸脫氫酶和肌酸激酶含量較正常組顯著增加(P<0.01)；靈芝西洋參口服液組、PRR不同劑量組小鼠血清中的乳酸、乳酸脫氫酶和肌酸激酶含量較模型組明顯下降(P<0.01)。

表3 PRR對小鼠的乳酸、乳酸脫氫酶和肌酸激酶的影響

注：與正常組比較:##P<0.01；與模型組比較:*P<0.05,**P<0.01

2.5 PRR對游泳小鼠體內(nèi)抗氧化效果

表4顯示，模型組小鼠經(jīng)30 min游泳后，與正常組小鼠比較，MDA的含量明顯升高(P<0.01)，SOD、CAT和GSH的含量顯著降低(P<0.01)；靈芝西洋參口服液組、PRR不同劑量組MDA含量較模型組明顯下降(P<0.01)， SOD、CAT和GSH的含量明顯增加(P<0.01)并呈劑量依賴性。

表4 PRR對小鼠體內(nèi)抗氧化的影響

注：與正常組比較:##P<0.01；與模型組比較:*P<0.05,**P<0.01

3 討論

眾所周知，肌肉運動易引起ATP的快速消耗，而能量缺乏是身體疲勞的一個關(guān)鍵的表現(xiàn)因素。在中度至高強度運動期間，血清葡萄糖主要用于支持能量需求且很快耗盡，而連續(xù)運動通常導(dǎo)致低血糖，并抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)的功能，進而降低連續(xù)運動能力。因此，血清葡萄糖的量可用于表示疲勞發(fā)展的速度和程度。此外，在體育鍛煉期間，能量也可以源自糖原的分解。因此，恢復(fù)肌糖原對延長運動是有益的[5]。當身體不能從碳水化合物和脂肪中獲得維持機體必須的能量時，蛋白質(zhì)和氨基酸可以作為能源需求的替代能源，但是蛋白質(zhì)和氨基酸的分解代謝會產(chǎn)生大量的尿氮素，并進一步影響肌肉的收縮力，嚴重時出現(xiàn)疲勞。本研究結(jié)果表明，PRR可以提高肌糖原的積累作用，提高血糖，降低尿素氮水平，這種能量代謝的調(diào)節(jié)方式在長時間的運動中是有利的。

乳酸是體內(nèi)葡萄糖的代謝過程中產(chǎn)生的中間產(chǎn)物。當運動相對過度時，肌肉產(chǎn)生的乳酸不能在短時間內(nèi)進一步分解，同時氧氣供應(yīng)不足將導(dǎo)致大量乳酸的堆積[6]。乳酸的積累將導(dǎo)致肌肉組織的pH降低從而導(dǎo)致疲勞，并阻礙運動性能。本研究中，PRR能顯著降低小鼠血清乳酸，表明PRR能有效抑制乳酸的積累，從而延緩疲勞的發(fā)生。研究顯示，劇烈運動易產(chǎn)生過量的自由基，并導(dǎo)致肌細胞產(chǎn)生損傷，部分LDH和CK滲入血漿[7]。 其中LDH是參與厭氧糖酵解和糖異生的重要酶，能促進丙酮酸和L-乳酸之間的氧化還原反應(yīng)[8]。CK可以參與磷酸肌酸的合成，為細胞中快速的能量來源。在本研究中，PRR組中LDH和CK的水平顯著降低，表明PRR的抗疲勞作用可能是由于其在強烈運動期間保護細胞免受損傷。

文獻顯示，脂質(zhì)過氧化能直接反映細胞膜的氧化損傷，其中MDA是自由基膜脂質(zhì)過氧化的主要產(chǎn)物[9]，而 SOD是一種抗活性氧的重要抗氧化酶[10]。另外GSH可通過清除自由基將有毒物質(zhì)轉(zhuǎn)化為無害的產(chǎn)物。因此，增加SOD活性、提高GSH水平、降低MDA的含量可以減輕氧化應(yīng)激和改善運動誘發(fā)的疲勞。在本研究中，PRR能顯著改善SOD活性，提高GSH水平，同時減少MDA含量，表明PRR能夠保護細胞免受脂質(zhì)氧化。

總之，刺梨多糖能通過提供能源物質(zhì)和減少不利物質(zhì)過多代謝，并通過較強的抗氧化共同消除疲勞，可以為刺梨的開發(fā)提供參考。

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