李燕 潘小平 王海霞 仝東蒙 王琛 朱麗達(dá)

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是最常見的侵襲性惡性腫瘤之一。因肝內(nèi)轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)，在癌癥導(dǎo)致的死亡原因中，男性排名第二，女性排名第六[1-2]。最近十年，發(fā)展中國家的HCC發(fā)病率和死亡率一直在增加[3]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國2011年新增HCC患者355 595例，死亡322 416例[4]。由于目前常規(guī)治療效果不理想，尋找新藥已成為改善肝癌患者預(yù)后的迫切要求。MicroRNAs（miRNAs）是一類長約21～25個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼單鏈小RNAs，在多個(gè)生理活動(dòng)中發(fā)揮重要作用，可以通過轉(zhuǎn)錄前調(diào)節(jié)靶基因mRNA的表達(dá)來影響細(xì)胞的增殖、凋亡和分化等[5]。越來越多的證據(jù)表明，異常調(diào)節(jié)miRNAs與不同的人類惡性腫瘤的發(fā)展和預(yù)后有關(guān)[6]。如miR-148b的異常低表達(dá)與HCC的不良結(jié)果有關(guān)[7]。miR-522水平升高預(yù)示著HCC患者的預(yù)后較差[8]。在HCC細(xì)胞中，miR-370通過抑制遷移和侵襲發(fā)揮其抑制轉(zhuǎn)移的潛能[9]。有最新研究報(bào)道在體外增加miR-370表達(dá)會(huì)促進(jìn)肝癌細(xì)胞的死亡[10]。然而，miR-370對HCC細(xì)胞生物學(xué)行為的影響機(jī)制尚不完全清楚。大黃素甲醚是藥用植物大黃中的一種活性成分，已被用作瀉藥、保肝、消炎和抗菌藥[11-12]。最近也有大黃素甲醚誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[13-14]、阻斷細(xì)胞周期增殖[13]和抑制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移[15]的報(bào)道。然而，大黃素甲醚在HCC中的作用機(jī)制尚未見報(bào)道。本研究旨在觀察大黃素甲醚調(diào)節(jié)miR-370誘導(dǎo)HCC細(xì)胞的凋亡情況，并探討其作用機(jī)制。

材料與方法

一、細(xì)胞系

人肝癌細(xì)胞SMMC7721和HepG2購自美國標(biāo)準(zhǔn)菌庫，肝細(xì)胞系L-02購自上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。所有細(xì)胞系在37℃含5%CO2的加濕培養(yǎng)箱中，在含有4 mg/L谷氨酰胺、3.7 g/L碳酸氫鈉、4.5 g/L葡萄糖和10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

二、實(shí)時(shí)定量PCR（qRT-PCR）

利用TRIzol試劑從培養(yǎng)的細(xì)胞中提取總RNA，通過高容量cDNA試劑盒獲得cDNA，采用TaqMan PCR試劑盒和ABI 7500系統(tǒng)進(jìn)行qRT-PCR。使用實(shí)時(shí)Taqman探針檢測miR-370 mRNA在組織中的表達(dá)，miR-370在細(xì)胞和組織中的表達(dá)被規(guī)范化為U6。Sp1和DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1（DNMT1）的特異性引物分別購自生合生物科技有限公司和北京義翹神州生物技術(shù)有限公司。Sp1和DNMT1的mRNA表達(dá)被GADPH標(biāo)準(zhǔn)化，PCR結(jié)果分析采用ΔCt比較法。

三、CCK-8檢測細(xì)胞活力

將密度為1×105/mL的SMMC7721和HepG2細(xì)胞在培養(yǎng)皿中培養(yǎng)24 h或48 h。分別用0、2.5、5、10 μmol/L的大黃素甲醚處理，然后向培養(yǎng)液中加入CCK-8溶液，再培養(yǎng)1 h。通過檢測450 nm波長下的吸光度來計(jì)算活細(xì)胞數(shù)目。

四、流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡情況

使用FITC-膜聯(lián)蛋白V細(xì)胞凋亡試劑盒通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。將密度為1×106/mL的SMMC7721和HepG2細(xì)胞，用膜聯(lián)蛋白-V-FITC和丙酸（PI）在黑暗中染色15 min，然后用流式細(xì)胞儀分析癌細(xì)胞凋亡情況。

五、Western blot分析

用RIPA緩沖液裂解從組織中分離出蛋白質(zhì)，通過含有蛋白酶抑制劑的裂解緩沖液從細(xì)胞中提取蛋白質(zhì)。用BCA蛋白測定試劑盒測定蛋白質(zhì)濃度。提取的總蛋白通過SDS-PAGE電泳轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上，用特異性抗體檢測，并用BandScan軟件進(jìn)行強(qiáng)度定量分析。

六、miR-370抑制或過表達(dá)

慢病毒構(gòu)建的 miR-370 mimic、miR-370和miR-370抑制劑購自Qiagen公司。細(xì)胞接種到96孔板中，孵育過夜；然后轉(zhuǎn)染miR-370 mimic、miR-con或miR-370抑制劑；通過qPCR分析轉(zhuǎn)染效率。

七、Sp1和DNMT1過表達(dá)

使用陽離子脂質(zhì)體3000的試劑分別轉(zhuǎn)染Sp1和DNMT1過表達(dá)質(zhì)粒。轉(zhuǎn)染48 h后，用Western blot檢測相應(yīng)的蛋白表達(dá)水平，以此驗(yàn)證大黃素甲醚是否通過DNMT1調(diào)節(jié)miR-370的水平。

八、在HCC細(xì)胞中轉(zhuǎn)染Sp1和DNMT1的siRNA

Sp1和DNMT1的siRNA寡核苷酸分別購自上海西寶生物科技有限公司和美國圣克魯斯生物技術(shù)公司。siRNA序列和一個(gè)作為對照的干擾序列，分別獨(dú)立插入質(zhì)粒載體pGCsi-H1中。轉(zhuǎn)染時(shí)，將對數(shù)生長階段的細(xì)胞接種于6孔板中，并將轉(zhuǎn)染細(xì)胞再孵育48 h，經(jīng)Western blot檢測和分析驗(yàn)證。

九、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有統(tǒng)計(jì)學(xué)分析均使用GraphPad Prism 6軟件。數(shù)據(jù)描述為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）格式，統(tǒng)計(jì)學(xué)比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、大黃素甲醚降低HCC細(xì)胞的活力

5 μmol/L 和 10 μmol/L 的大黃素甲醚處理SMMC7721和HepG2細(xì)胞24 h和48 h均可造成細(xì)胞活力的降低，且隨著濃度的增加降低的更明顯。48 h存活細(xì)胞的數(shù)量顯著低于24 h（圖1）。大黃素甲醚能增加SMMC7721和HepG2細(xì)胞的凋亡比例，見圖2。

二、HCC細(xì)胞中通過上調(diào)miR-370造成大黃素甲醚誘導(dǎo)型細(xì)胞凋亡

miR-370水平隨大黃素甲醚的濃度依賴性地增加，見圖3A。miR-370 mimic明顯增強(qiáng)了miR-370的表達(dá)，而miR-370抑制劑明顯降低了miR-370的表達(dá)，見圖3B。轉(zhuǎn)染了miR-370 mimic的HCC細(xì)胞類似陽性對照，顯示上調(diào)miR-370與凋亡細(xì)胞數(shù)目明顯增加有關(guān)（圖3C）。且miR-370抑制劑在兩組細(xì)胞系中均能明顯降低大黃素甲醚誘導(dǎo)型細(xì)胞凋亡。

三、大黃素甲醚通過AMPK/Sp1/DNMT1信號(hào)調(diào)節(jié)miR-370的表達(dá)

圖1 大黃素甲醚對肝細(xì)胞癌細(xì)胞活力的影響

圖2 大黃素甲醚對肝細(xì)胞癌細(xì)胞凋亡的影響（**P＜0.01）

圖3 HCC細(xì)胞中MiR-370介導(dǎo)的大黃素甲醚細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)

大黃素甲醚處理可導(dǎo)致SMMC7721和HepG2細(xì)胞中DNMT1在mRNA和蛋白水平上的降低（圖4A）。大黃素甲醚能抑制Sp1的表達(dá)，表明大黃素甲醚可能通過抑制Sp1的表達(dá)調(diào)節(jié)DNMT1水平（圖4B）。此外，大黃素甲醚通過活化AMPK抑制Sp1的表達(dá)（圖4C、4D），AMPK/Sp1信號(hào)能通過大黃素甲醚的作用下調(diào)DNMT1水平（圖4E）。為了證實(shí)AMPK/Sp1/DNMT1參與到大黃素甲醚對miR-370的調(diào)節(jié)中，DNMT1和Sp1的表達(dá)使用靶shRNA或過表達(dá)質(zhì)粒和AMPK抑制劑化合物C和AMPK活化劑AICAR。本研究結(jié)果清晰地表明大黃素甲醚通過AMPK/Sp1/DNMT1信號(hào)調(diào)節(jié)miR-370水平（圖4F）。大黃素甲醚通過AMPK/Sp1/DNMT1信號(hào)上調(diào)miR-370，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡（圖4G）。

圖4 大黃素甲醚通過AMPK/Sp1/DNMT1信號(hào)調(diào)節(jié)miR-370的水平

討 論

大黃素甲醚是從藥用植物大黃和海洋衍生小孢子菌屬真菌中提取的一種天然蒽醌類衍生物，首次報(bào)道是其對結(jié)腸癌和白血病發(fā)揮細(xì)胞毒性作用[16]。從此，大黃素甲醚對人類乳腺癌、子宮頸癌、結(jié)腸癌和鼻咽癌的誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡效應(yīng)被發(fā)現(xiàn)[13-14]。而且，包括EMMPRIN[14]、6-磷酸葡萄糖酸鹽脫氫酶和Sp1[17]的幾個(gè)分子靶點(diǎn)也已被證實(shí)。

miR-370在許多人類惡性腫瘤中異常表達(dá)，因此有人提出關(guān)于miR-370在人類惡性腫瘤發(fā)生和發(fā)展過程中作用的相反結(jié)果：miR-370可以作為一個(gè)癌基因或腫瘤抑制基因。例如，在實(shí)體腫瘤和血液惡性腫瘤中檢測到miR-370的異常低表達(dá)[18-19]，表明miR-370是腫瘤抑制基因。膽管上皮癌細(xì)胞的體外實(shí)驗(yàn)也表明用miR-370 mimic轉(zhuǎn)染能抑制細(xì)胞生長[20]。此外，研究發(fā)現(xiàn)miR-370的更新能使癌細(xì)胞對化療重新敏感[21]。相反地，某些研究成果發(fā)現(xiàn)miR-370在癌細(xì)胞中扮演著致癌miRNA的角色。如miR-370在霍奇金腫瘤G401細(xì)胞系中的離體過表達(dá)與腫瘤增殖率的增加有關(guān)，這表明miR-370具有致瘤作用[22]。此外，miR-370通過直接調(diào)節(jié)FOXO1促進(jìn)人類前列腺癌和胃癌細(xì)胞的生長[23-24]。還有研究發(fā)現(xiàn)miR-370高表達(dá)與乳腺癌患者低治愈率之間的關(guān)系[25]。

在HCC細(xì)胞中，miR-370通過抑制遷移和侵襲顯示出其抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的潛力[9]。Sun等[10]最新的研究報(bào)道表明體外增加miR-370的表達(dá)，可以促進(jìn)肝癌細(xì)胞的死亡。Pan等[26]研究報(bào)道m(xù)iR-370水平可以作為臨床評價(jià)肝細(xì)胞癌患者預(yù)后的獨(dú)立指標(biāo)。本研究顯示miR-370介導(dǎo)HCC細(xì)胞中大黃素甲醚的凋亡誘導(dǎo)作用，進(jìn)一步支持了miR-370作為HCC腫瘤抑制因子的作用，與以前研究相一致。因?yàn)榘┌Y表觀遺傳的改變導(dǎo)致某些促進(jìn)甲基化作用的腫瘤抑制基因的沉默，因此表觀遺傳學(xué)的不穩(wěn)定性在癌癥的發(fā)生和發(fā)展中起主要作用[27]。除蛋白質(zhì)外，表觀遺傳調(diào)控也在miRNAs的調(diào)控中起關(guān)鍵作用[28]。這種現(xiàn)象使DNMT轉(zhuǎn)移到DNA中前5個(gè)碳原子上的催化酶，成為miRNAs的關(guān)鍵調(diào)控因子[29]。

在DNMT家族中，DNMT1被研究的最多，報(bào)道中發(fā)現(xiàn)其參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[30]。在HCC的細(xì)胞中，DNMT1的異常表達(dá)增加可以促進(jìn)HCC的惡性發(fā)展，并且與HCC患者的復(fù)發(fā)和低治愈率有關(guān)[31]。據(jù)報(bào)道DNMT1介導(dǎo)了乙型肝炎病毒x蛋白（HBx）誘導(dǎo)的p16-INK4A基因啟動(dòng)子的超甲基化[32]。本研究結(jié)果顯示HCC中DNMT1作為一個(gè)上游信號(hào)分子調(diào)控miR-370的表達(dá)，表明DNMT1可能通過調(diào)節(jié)miRNAs影響HCC細(xì)胞的生物活性，并支持DNMT1作為一個(gè)潛在的HCC治療靶點(diǎn)。

Sp1是已被證實(shí)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄因子之一，通過調(diào)節(jié)多種基因的表達(dá)在細(xì)胞進(jìn)程中發(fā)揮調(diào)控作用。由于Sp1與幾種基因啟動(dòng)子的富含GC的基序結(jié)合并誘導(dǎo)癌細(xì)胞的生長，它已被認(rèn)為是癌癥治療中有希望的靶點(diǎn)[33]。最近研究發(fā)現(xiàn)DNMT1基因啟動(dòng)子中存在富含GC基序，表明DNMT1可能是Sp1的下游靶點(diǎn)[34]，并且發(fā)現(xiàn)一些天然化合物通過Sp1調(diào)節(jié)DNMT1的表達(dá)[35]。本研究結(jié)果也顯示大黃素甲醚通過抑制Sp1來調(diào)節(jié)DNMT1的表達(dá)，與以往研究結(jié)果一致。

參考文獻(xiàn)

[1]Vilarinho S，Taddei T.Therapeutic strategies for hepatocellular carcinoma：new advances and challenges[J].Curr Treat Options Gastroenterol，2015，13（2）： 219-234.

[2]Torre LA，Bray F，Siegel RL，et al.Global cancer statistics，2012[J].CA Cancer J Clin，2015，65（2）：87-108.

[3]Song P，F(xiàn)eng X，Zhang K，et al.Perspectives on using des-gammacarboxyprothrombin（DCP）as a serum biomarker:facilitating early detection of hepatocellular carcinoma in China[J].Hepatobiliary Surg Nutr，2013，2（4）:227-231.

[4]Zuo TT，Zheng RS，Zhang SW，et al.Incidence and mortality of liver cancer in China in 2011[J].Chin J Cancer，2015，34（11）：508-513.

[5]Hébrant A，F(xiàn)loor S，Saiselet M，et al.miRNA expression in anaplastic thyroid carcinomas[J].PLoS One，2014，9（8）： e103871.

[6]Ong SG，Lee WH，Kodo K，et al.MicroRNA-mediated regulation of differentiation and trans-differentiation in stem cells[J].Adv Drug Deliv Rev，2015，88 3-15.

[7]ZiariK， Zarea M， GityM， etal.Retraction Note to：Downregulation of miR-148b as biomarker for early detection of hepatocellular carcinoma and may serve as a prognostic marker[J].Tumour Biol，2016，Nov 5.[Epub ahead of print]

[8]Shi YH，Qi BB，Liu XB，et al.Upregulation of miR-522 is associated with poor outcome of hepatocellular carcinoma[J].Eur Rev Med Pharmacol Sci，2016，20（15）： 3194-3198.

[9]Xu WP，Yi M，Li QQ，et al.Perturbation of MicroRNA-370/Lin-28 homolog A/nuclear factor kappa B regulatory circuit contributes to the development of hepatocellular carcinoma [J].Hepatology，2013，58（6）： 1977-1991.

[10]Sun G，Hou YB，Jia HY，et al.MiR-370 promotes cell death of liver cancer cells by Akt/FoxO3a signalling pathway[J].Eur Rev Med Pharmacol Sci，2016，20（10）： 2011-2019.

[11]Agarwal SK，Singh SS，Verma S，et al.Antifungal activity of anthraquinone derivatives from Rheum emodi[J].J Ethnopharmacol，2000，72（1-2）： 43-46.

[12]Tamokou Jde D，Tala MF，Wabo HK，et al.Antimicrobial activities of methanol extract and compounds from stem bark of Vismia rubescens[J].J Ethnopharmacol，2009，124（3）：571-575.

[13]Hong JY，Chung HJ，Bae SY，et al.Induction of cell cycle arrest and apoptosis by physcion，an anthraquinone isolated from rhubarb（rhizomes of rheum tanguticum），in MDA-MB-231 human breast cancer cells[J].J Cancer Prev，2014，19（4）： 273-278.

[14]Chen X，Gao H，Han Y，et al.Physcion induces mitochondriadriven apoptosis in colorectal cancer cells via downregulating EMMPRIN[J].Eur J Pharmacol，2015，764：124-133.

[15]Han YT，Chen XH，Gao H，et al.Physcion inhibits the metastatic potential of human colorectal cancer SW620 cells in vitro by suppressing the transcription factor SOX2[J].Acta Pharmacol Sin.，2015，37（2）： 264-275.

[16]Ge HM， Song YC， Shan CY， et al.New and cytotoxic anthraquinones from Pleospora sp.IFB-E006，an endophytic fungus in Imperata cylindrical[J].Planta Med，2005，71（11）：1063-1065.

[17]Lin R，Elf S，Shan C，et al.6-Phosphogluconate dehydrogenase links oxidative PPP，lipogenesis and tumour growth by inhibiting LKB1-AMPK signalling[J].Nat Cell Biol，2015，17 （11）： 1484-1496.

[18]Yungang W，Xiaoyu L，Pang T，et al.miR-370 targeted FoxM1 functions as a tumor suppressor in laryngeal squamous cell carcinoma （LSCC）[J].Biomed Pharmacother，2014，68（2）：149-154.

[19]Zhang X，Zeng J，Zhou M，et al.The tumor suppressive role of miRNA-370 by targeting FoxM1 in acute myeloid leukemia[J].Mol Cancer，2012，11：56.

[20]An F，Yamanaka S，Allen S，et al.Silencing of miR-370 in human cholangiocarcinoma by allelic loss and interleukin-6 induced maternal to paternal epigenotype switch[J].PLoS One，2012，7（10）：e45606.

[21]Chen XP，Chen YG，Lan JY，et al.MicroRNA-370 suppresses proliferation and promotes endometrioid ovarian cancer chemosensitivity to cDDP by negatively regulating ENG[J].Cancer Lett，2014，353（2）： 201-210.

[22]Cao X，Liu D，Yan X，et al.Stat3 inhibits WTX expression through up-regulation of microRNA-370 in Wilms tumor[J].FEBS Lett，2013，587（6）：639-644.

[23]Wu Z，Sun H，Zeng W，et al.Upregulation of MircoRNA-370 Inducesproliferation in humanprostatecancercells by downregulating the transcriptionfactor FOXO1[J].PLoS One，2012，7（9）： e45825.

[24]Fan C，Liu S，Zhao Y，et al.Upregulation of miR-370 contributes to the progression of gastric carcinoma via suppression of FOXO1[J].Biomedecine&pharmacotherapie，2013，67（6）： 521-526.

[25]Sim J，Ahn H，Abdul R，et al.High MicroRNA-370 Expression Correlates with Tumor Progression and Poor Prognosis in Breast Cancer[J].J Breast Cancer，2015，18（4）： 323-328.

[26]Pan XP，Huang LH，Wang X.MiR-370 functions as prognostic marker in patients with hepatocellular carcinoma[J].Eur Rev Med Pharmacol Sci，2017，21:3581-3585.

[27]Baylin SB，Ohm JE.Epigenetic gene silencing in cancer-a mechanism for early oncogenic pathway addiction [J].Nat Rev Cancer，2006，6（2）：107-116.

[28]Jones PA，Liang G.Rethinking how DNA methylation patterns are maintained[J].Nat Rev Genet，2009，10（11）： 805-811.

[29]Brenner C，F(xiàn)uks F.DNA methyltransferases： facts，clues，mysteries[J].Curr Top Microbiol Immunol，2006，301：45-66.

[30]Yan L，Yang X，Davidson NE.Role of DNA methylation and histone acetylation in steroid receptor expression in breast cancer[J].J Mammary Gland Biol Neoplasia，2001，6（2）： 183-192.

[31]Saito Y，Kanai Y，Nakagawa T，et al.Increased protein expression of DNA methyltransferase（DNMT）1 is significantly correlated with the malignant potential and poor prognosis of human hepatocellular carcinomas[J].Int J Cancer，2003，105（4）： 527-532.

[32]Zhu YZ，Zhu R，Shi LG，et al.Hepatitis B virus X protein promotes hypermethylation of p16（INK4A） promoter through upregulation of DNA methyltransferases in hepatocarcinogenesis [J].Exp Mol Pathol，2010，89（3）： 268-275.

[33]Li J，Zou WX，Chang KS.Inhibition of Sp1 functions by its sequestration into PML nuclear bodies[J].PLoS One，2014，9（4）：e94450.

[34]Sontag RL，Weber TJ.Ectopic ERK expression induces phenotypic conversion ofC10 cellsand altersDNA methyltransferase expression[J].BMC Res Notes，2012，5：217.

[35]Zhao S，Wu J，Zheng F，et al.β-elemene inhibited expression of DNA methyltransferase 1 through activation of ERK1/2 and AMPKα signalling pathways in human lung cancer cells：the role of Sp1[J].J Cell Mol Med，2015，19（3）： 630-641.