張興磊， 余維芳， 方小偉， 張 華， 王楠楠

(1.江西省質(zhì)譜科學(xué)與儀器重點實驗室，江西 南昌 330013；2.東莞出入境檢驗檢疫局，廣東 東莞 523000)

女貞LigustrumlucidumAit屬于木犀科植物，主要分布在我國南部，是一種傳統(tǒng)的藥用植物。一般采集女貞的果實(女貞子)和葉子進行藥用，女貞子的藥用價值已經(jīng)被廣泛的開發(fā)與應(yīng)用，但女貞葉的藥用價值還有待于進一步的研究與開發(fā)?！吨兴幋筠o典》記載女貞葉味微苦，性平無毒，具有消炎消腫，袪風(fēng)，袪瘀散結(jié)，生肌止痛及收斂防腐之功效，因此女貞葉的藥用有效成分的研究對女貞葉的藥學(xué)臨床應(yīng)用具有重要的指導(dǎo)意義。女貞葉的藥用化學(xué)成分主要來源是女貞葉的次生代謝產(chǎn)物(童東錫，2013)，次生代謝是植物生長和環(huán)境兩者相互作用的結(jié)果，此外，不同生長階段葉子中的次生代謝產(chǎn)物也存在極大的差異(段傳人等，2003)。植物中次生代謝產(chǎn)物的差異與該植物的藥用價值密切相關(guān)，因此，對女貞葉藥用價值的研究也不能僅僅局限在某個生長階段的女貞葉，而應(yīng)該對多個生長階段的女貞葉進行系統(tǒng)的研究。

目前主要采用浸提法對女貞葉進行預(yù)處理，并借助光度法(Zhang et al.，2013)、高效液相色譜法(Xia et al., 2011, 2012)或液質(zhì)聯(lián)用(Romani et al.，2000)等技術(shù)對女貞葉的浸提液進行分析。這些方法都需要復(fù)雜的樣品預(yù)處理過程，無法實現(xiàn)女貞葉中化學(xué)成分的直接快速分析。新興常壓離子化質(zhì)譜技術(shù)可以在無需樣品預(yù)處理的條件下直接分析復(fù)雜基體樣品，為實現(xiàn)復(fù)雜基體樣品的簡單、快速分析提供了可靠的途徑(Cooks et al.，2006；Venter et al.，2008；Chen et al.，2009)，如激光消融電噴霧電離質(zhì)譜(LAESI-MS)利用激光直接使植物樣品表面的化學(xué)物質(zhì)發(fā)生燒蝕電離(Shrestha et al.，2012；Stolee et al.，2013)，電噴霧內(nèi)部萃取電離質(zhì)譜(iEESI-MS)可以直接在植物組織樣品的內(nèi)部發(fā)生萃取并在樣品的表面產(chǎn)生樣品萃取液電噴霧用于質(zhì)譜檢測(Zhang et al.，2013a，2013b)。直接電離質(zhì)譜技術(shù)(AI-MS)是一種適用于在無需樣品預(yù)處理的條件下對植物葉子或較薄植物組織直接分析的新電離技術(shù)(Hu et al.，2011, 2012；Liu et al.，2012；歐陽永中等，2013)。筆者利用該直接電離質(zhì)譜法對采集的新鮮女貞葉中化學(xué)成分進行初步分析研究，并比較了不同生長階段女貞葉的化學(xué)組成，對進一步揭示女貞葉的生長代謝和藥學(xué)研究提供了科學(xué)依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

LTQ-XL線性離子阱質(zhì)譜儀(美國Thermo Scientific公司)，配有Xcalibur數(shù)據(jù)處理系統(tǒng);質(zhì)譜儀設(shè)置為正離子檢測模式，質(zhì)量掃描范圍50～1000 u，電離電壓4.5 kV，離子傳輸管溫度為150 ℃，離子透鏡及檢測系統(tǒng)由 LTQ-Tune 功能自動優(yōu)化。甲醇(色譜純，美國ROE公司)，實驗用水為二次蒸餾水。女貞葉采集于校園中。

1.2 實驗方法

將剛采集的新鮮女貞葉用二次蒸餾水清洗干凈，根據(jù)女貞葉子的形態(tài)學(xué)特征，將女貞葉分為嫩葉和老葉兩組，每組包含9片大小與形態(tài)類似的女貞葉子，每片葉子作為單獨的樣本進行直接質(zhì)譜分析。女貞葉樣品的直接電離過程如下：從女貞葉面中切下一個V形樣品(長邊長為1.5 cm，尖角為30°)，用鋼夾子固定樣品的末端，使V形樣品尖端正對著質(zhì)譜口，這樣樣品面與質(zhì)譜儀入口處于同一平面上，V形樣品尖端與質(zhì)譜儀入口的距離為1.0 cm；在樣品尖端表面滴加10 μL甲醇，對女貞葉中的化學(xué)物質(zhì)進行萃?。浑婋x電壓直接加在固定樣品的鋼夾子上，在電場作用下，樣品尖端產(chǎn)生大量承載了樣品待測物的帶電微小液滴，帶電微小液滴進入質(zhì)譜儀進行質(zhì)譜檢測。將扣除背景的女貞嫩葉、老葉的質(zhì)譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入Excel中，利用Matlab(version 7.8.0, Mathworks, Inc., Natick, MA)軟件中‘princomp’函數(shù)對Excel中的質(zhì)譜數(shù)據(jù)進行歸一化處理及PCA 分析，并將前3個主成分方向上的得分及載荷結(jié)果通過Matlab 軟件以圖形化的方式顯示。

2 結(jié)果與討論

2.1 女貞葉的化學(xué)指紋質(zhì)譜分析

女貞葉的化學(xué)指紋質(zhì)譜圖如圖1所示。從女貞葉的一級譜圖中可以看出，女貞葉中的化學(xué)成分被萃取電離后獲得大量陽離子分子峰，如：[M]+，[M+H]+，[M+K]+等。由于女貞葉的直接電離質(zhì)譜分析以甲醇作為萃取劑，女貞葉中的鉀離子以[CH3OH+K]+的形式被檢測到，得到高豐度的質(zhì)譜信號峰m/z71。膽堿(Choline)以陽離子[M]+的形式得到m/z104質(zhì)譜信號峰；糖類物質(zhì)主要以[M+K]+的形式被電離得到質(zhì)譜信號峰如m/z219 ([Glucose + K]+)， 381 ([Sucrose +K]+)，這些信號表明女貞葉中含有豐富的鉀、糖等營養(yǎng)成分。

圖1 正離子檢測模式下女貞葉的質(zhì)譜指紋譜圖Fig.1 AI-MS spectra of Ligustrum lucidum Ait leaf acquired in the positive ion detection mode

此外，通過串聯(lián)質(zhì)譜分析和相關(guān)文獻(xiàn)(Romani ey al.，2000)表明AI-MS檢測到女貞葉中大量的黃酮類物質(zhì)，如：芹菜素糖苷、山奈酚糖苷、槲皮素糖苷。這些黃酮類物質(zhì)電離后得到三組規(guī)律性的質(zhì)譜信號峰(m/z401，417，433，449，465；m/z563，579，595，611，627；m/z778，794，810，826等)，這些質(zhì)譜信號峰以Δ=16 u(u為原子質(zhì)量單位，下同)遞增。芹菜素、山奈酚、槲皮素這三種物質(zhì)結(jié)構(gòu)相似，分子間相差一個—O—結(jié)構(gòu)，此外糖殘基分別是葡萄糖苷(162 u)和鼠李糖苷(146 u，天然脫氧糖)，這兩個原因都會使最終得到的分子相差若干個O(16 u)原子，使質(zhì)譜信號峰變得更加復(fù)雜。芹菜素單糖苷有m/z401[Apigenin rhamnoside + H]+，m/z417 [Apigenin 7-O-rhamnoside + H]+，m/z433 [Apigenin 7-O-glucoside + H]+；芹菜素雙糖苷有m/z563 [Apigenin 3, 7-O-dirhamnoside + H]+，m/z579 [Apigenin 3-O-glucoside 7-O-rhamnoside+ H]+和m/z595 [Apigenin 3, 7-O-dirglucoside+ H]+。分子離子化的山奈酚單糖苷有m/z433 [Kaempferol 3-O-rhamnoside + H]+，m/z449 [Kaempferol 3-O-glucoside + H]+；山奈酚雙糖苷有m/z579 [Kaempferol 3, 7-O-dirhamnoside + H]+，m/z595 [Kaempferol 3-O-glucoside 7-O-rhamnoside+ H]+和m/z611 [Kaempferol 3, 7-O-dirglucoside+ H]+。分子離子化的槲皮素單糖苷有m/z449 [Quercetin 3-O-rhamnoside + H]+，m/z465 [Quercetin 3-O-glucoside + H]+；槲皮素雙糖苷有m/z595 [Kaempferol 3, 7-O-dirhamnoside + H]+，m/z611 [Kaempferol 3-O-glucoside 7-O-rhamnoside+ H]+和m/z627 [Kaempferol 3, 7-O-dirglucoside+ H]+。此外，女貞葉的指紋質(zhì)譜圖1中，質(zhì)譜信號峰在m/z720～874間以Δ=16 u遞增的主要峰(如720，736，…，842，858，874)由女貞葉中大量的雙黃酮糖苷類物質(zhì)離子化得到。由以上實驗結(jié)果可以看出，女貞葉中總黃酮類物質(zhì)的代謝是一個復(fù)雜的過程，它們結(jié)構(gòu)的多樣性與相似性給女貞葉中單一結(jié)構(gòu)黃酮的分離與純化帶來一定難度。

2.2 不同生長階段女貞葉進行快速質(zhì)譜分析

圖2 不同生長階段女貞葉的直接電離質(zhì)譜分析Fig.2 AI-MS analysis of Ligustrum lucidum Ait leaves of different growth stage a. 女貞嫩葉；b. 女貞老葉；c. 三維得分圖；d. 3個主成分上的PCA載荷分布圖

獲取不同生長階段的女貞葉中化學(xué)物質(zhì)分子層面的信息，可以進一步了解女貞葉的生長代謝情況，對女貞葉的藥學(xué)研究與女貞葉藥物的開發(fā)提供必要的科學(xué)依據(jù).按照實驗方法對女貞葉的老葉與嫩葉進行直接電離質(zhì)譜(AI-MS)分析得到正離子檢測模式下女貞葉的化學(xué)指紋質(zhì)譜圖，并對兩類樣品的質(zhì)譜數(shù)據(jù)進行PCA分析(圖2)。女貞嫩葉的化學(xué)指紋譜圖(圖2a)與老葉的化學(xué)指紋譜圖(圖2b)存在顯著的差異：老葉中m/z417，579，595等質(zhì)譜峰的豐度比嫩葉更低，但質(zhì)譜信號峰在m/z720～874間以Δ=16 u遞增的主要峰在老葉中的豐度更高。通過數(shù)學(xué)方法對譜圖數(shù)據(jù)進行PCA分析，圖2c表明兩類不同生長階段的女貞葉可以得到很好地區(qū)分。PCA中3個主成分上的載荷分布圖(圖2d)清晰地體現(xiàn)出質(zhì)譜特征峰m/z104，417，433，449，579，627，794，810，826等對區(qū)分不同生長階段的女貞葉的貢獻(xiàn)率較高，說明雙黃酮類化合物在女貞嫩葉與老葉的含量存在較大差異?？梢耘袛嘣谂懭~的生長代謝過程中黃酮類物質(zhì)存在聚合現(xiàn)象，即由單黃酮類糖苷轉(zhuǎn)變成雙黃酮類糖苷。

女貞在我國是一種分布廣泛、適應(yīng)性非常強的植物，在傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中用于治療陰虛型疾患。筆者采用直接質(zhì)譜分析的方法，最直接地獲得了女貞葉中有關(guān)化學(xué)組分的分子信息。質(zhì)譜圖數(shù)據(jù)表明，女貞葉中含有豐富的鉀、黃酮等營養(yǎng)成分.鉀是生命體所需的大量元素之一，是細(xì)胞內(nèi)的重要陽離子，在多種酶促反應(yīng)和肌肉收縮中充當(dāng)重要的作用，關(guān)系到許多重要臟器的生理功能，包括心肌的營養(yǎng)及代謝。正常的血鉀濃度是維持心臟等臟器正?；顒硬豢苫蛉钡臈l件(Clausen，2003；Macdonald et al.，2004；Zingman et al.，2007).女貞葉同時含有豐富的鉀離子、單黃酮和雙黃酮類物質(zhì)，而這些藥物成分正是臨床治療和預(yù)防慢性心肌炎等疾患的重要組分(Middleton et al.，2000；Reed，2002；Manach et al.，2004；Moon et al.，2006；Tripoli et al.，2007)?？梢?，女貞葉有可能做為藥用植物，在預(yù)防和治療心肌炎方面發(fā)揮作用。

比較女貞葉嫩葉與老葉的化學(xué)指紋譜圖(圖2a，2b)，可以判斷女貞葉中黃酮類物質(zhì)的代謝與女貞葉的生長存在一定的相關(guān)性關(guān)系。為了進一步了解女貞葉中黃酮類物質(zhì)代謝隨女貞葉生長的變化情況，實驗選擇4類不同生長階段的女貞葉(從嫩葉到老葉依次標(biāo)記為age 1，age 2，age 3，age 4)進行直接質(zhì)譜分析，獲得4類不同生長階段的女貞葉化學(xué)指紋圖譜。在不同生長階段的女貞葉的AI-MS譜圖中都可以找到黃酮類物質(zhì)的前體(芹菜素、山奈酚、槲皮素)，它們主要以[M+K]+或[M+Na]+的形式被質(zhì)譜儀檢測到，得到相對低豐度的質(zhì)譜信號峰m/z293，309，325，341，但相對比較而言，這些黃酮前體在嫩葉中含量相對更高。女貞葉中低豐度的女貞前體分子對比高豐度的糖苷類黃酮類物質(zhì)，說明黃酮前體物質(zhì)在女貞葉細(xì)胞中是不穩(wěn)定的，易與光合作用產(chǎn)生的單糖發(fā)生脫水聚合，形成糖苷類黃酮。對4類女貞葉中單糖苷黃酮、雙糖苷黃酮、雙糖苷雙黃酮進行統(tǒng)計分析(圖3)。從圖3可以看出，隨著女貞葉齡的增長，葉子中的單糖苷黃酮和雙糖苷雙黃酮的濃度不斷地積累，但雙糖苷黃酮的濃度卻呈現(xiàn)下降的趨勢.隨著女貞葉子的生長，女貞葉的光合作用葉面積不斷增加而獲得更加充分的光合作用，使葉子中糖類等代謝物的合成速度更快。大量積累的糖類物質(zhì)為糖苷類黃酮的大量合成提供了充足的原料；同時細(xì)胞中不穩(wěn)定的黃酮前體進一步與雙糖苷黃酮發(fā)生聚合作用，生成更多的雙黃酮類糖苷。女貞老葉與嫩葉中黃酮類物質(zhì)的差異性表明，實際生產(chǎn)中應(yīng)該在適宜的時間對相應(yīng)生長階段的女貞葉進行采集，獲得最佳品質(zhì)的女貞葉藥材。

圖3 不同生長階段女貞葉黃酮類物質(zhì)濃度的比較Fig.3 Concentration of the flavonoids in Ligustrum lucidum Ait leaveswith different growth stage.

3 結(jié)論

女貞在我國廣泛分布，適應(yīng)性強，是一種可以防治土壤沙漠化的重要植物。女貞植物的種子(女貞子)在我國有數(shù)千年的藥用歷史，是一種重要的營養(yǎng)性藥材，對陰虛型疾患具有重要作用。利用新型直接質(zhì)譜分析方法，首次對不同生長期內(nèi)的女貞葉進行了直接質(zhì)譜分析，獲得了葉子中鉀、黃酮、糖等有益成分的分子信息。在同一植物源中同時含有豐富鉀、單黃酮、雙黃酮、糖等有益成分的植物鮮見報道。這些物質(zhì)的共同存在，為女貞葉這一藥用植物資源的開發(fā)利用提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。筆者所建立的質(zhì)譜學(xué)分析方法能夠承受葉子中復(fù)雜基質(zhì)的干擾，識別不同生長階段的女貞葉中化學(xué)成分的差異，具有無需樣品預(yù)處理、操作簡單、檢測速度快、高能通量的特點，特別適合對植物組織樣品進行原位直接分析。

參考文獻(xiàn)

段傳人，王伯初，徐世榮. 2003. 環(huán)境應(yīng)力對植物次生代謝產(chǎn)物形成的作用[J].重慶大學(xué)學(xué)報: 自然科學(xué)版, 26(10): 67-71.

歐陽永中，李操，姜翠翠，等. 2013. 烏雞蛋品質(zhì)的電噴霧萃取電離質(zhì)譜法研究[J]. 東華理工大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版，36(3)：344-348.

童東錫. 2013.女貞葉的研究進展[J].中國醫(yī)藥指南, 11(20): 76-78.

Chen H, Gamez G, Zenobi R.2009. What can we learn from ambient ionization techniques? [J]. J. Am. Soc. Mass Spectr.,20(11):1947-1963.

Clausen T.2003.Na+-K+pump regulation and skeletal muscle contractility[J]. Physiol. Rev., 83(4): 1269-1324.

Cooks R G, Ouyang Z, Takats Z, et al.2006.Ambient mass spectrometry[J]. Science,311(5767): 1566-1570.

Hu B, Lai Y H, So P K, et al.2012.Direct ionization of biological tissue for mass spectrometric analysis[J]. Analyst,137(16):3613-3619.

Hu B, So P, Chen H, et al.2011. Electrospray ionization using wooden tips[J]. Anal.Chem.,83(21):8201-8207.

Liu J, Wang H, Cooks R G, et al.2011.Leaf spray: Direct chemical analysis of plant material and living plants by mass spectrometry[J]. Anal.Chem.,83(20):7608-7613.

Macdonald J E, Struthers A D.2004.What is the optimal serum potassium level in cardiovascular patients? [J]. J. Am. Coll. Cardiol.,43(2):155-161.

Manach C, Scalbert A, Morand C, et al.2004.Polyphenols: Food sources and bioavailability[J]. Am. J. Clin. Nutr., 79(5): 727-747.

Middleton E J, Kandaswami C, Theoharides T C.2000. The effects of plant flavonoids on mammalian cells: Implications for inflammation, heart disease, and cancer[J].Pharmacol. Rev., 52(4):673-751.

Moon Y J, Wang X D, Morris M E.2006.Dietary flavonoids: Effects on xenobiotic and carcinogen metabolism[J]. Toxicol. in Vitro,20(2):187-210.

Reed J.2002. Cranberry flavonoids, atherosclerosis and cardiovascular health[J]. Crit. Rev. Food Sci., 42(3 Suppl.):301-316.

Romani A, Pinelli P, Mulinacci N, et al.2000.Hplc analysis of flavonoids and secoiridoids in leaves ofligustrumvulgarel.(oleaceae) [J]. J. Agr. Food Chem., 48(9): 4091-4096.

Shrestha B, Sripadi P, Walsh C M, et al.2012.Rapid, non-targeted discovery of biochemical transformation and biomarker candidates in oncovirus-infected cell lines using laesi mass spectrometry[J]. Chemical Communications, 48(31): 3700-3702.

Stolee J A.Vertes A. 2013. Toward single-cell analysis by plume collimation in laser ablation electrospray ionization mass spectrometry[J]. Anal. Chem., 85(7): 3592-3598.

Tripoli E, La Guardia M, Giammanco S, et al.2007.Citrus flavonoids: Molecular structure, biological activity and nutritional properties: A review[J]. Food Chem., 104(2): 466-479.

Venter A,Nefliu M,Cooks R G.2008. Ambient desorption ionization mass spectrometry[J]. Trac-Trends in Analytical Chemistry, 27(4): 284-290.

Xia E Q, Wang B W, Xu X R, et al.2011. Microwave-assisted extraction of oleanolic acid and ursolic acid fromligustrumlucidumait[J]. International journal of molecular sciences, 12(8): 5319-5329.

Xia E Q, Yu Y Y, Xu X R, et al.2012. Ultrasound-assisted extraction of oleanolic acid and ursolic acid fromligustrumlucidumait[J]. Ultrasonics Sonochemistry, 19(4): 772-776.

Zhang H, Gu H, Yan F, et al.2013. Direct characterization of bulk samples by internal extractive electrospray ionization mass spectrometry[J]. Scientific Reports, 3: 2495.

Zhang H, Zhu L, Luo L, et al.2013.Direct assessment of phytochemicals inherent in plant tissues using extractive electrospray ionization mass spectrometry[J]. J Agr. Food Chem., 61(45): 10691-10698.

Zhang Y, Liu L, Gao J, et al.2013.New secoiridoids from the fruits ofligustrumlucidumaitwith triglyceride accumulation inhibitory effects[J]. Fitoterapia, 91:107-112.

Zingman L V, Alekseev A E, Hodgson-Zingman D M, et al.2007. Atp-sensitive potassium channels: Metabolic sensing and cardioprotection[J]. J. Appl. Physiol., 103(5): 1888-1893.