周秋玲，婁婷婷，王素英，張宏宇，*

（1.天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津300134；2.天津出入境檢驗(yàn)檢疫局，天津300461）

動(dòng)物源性食品包括可食用的動(dòng)物組織及其高附加值的附屬產(chǎn)物，是日常膳食的重要組成部分。在規(guī)模效益和速度效率的催生下，獲得動(dòng)物源性食品的自然周期被打破。激素可以有效降低成本，改善產(chǎn)品性狀。為了縮短飼養(yǎng)動(dòng)物的生長和繁殖周期、提高飼料轉(zhuǎn)化率、改善動(dòng)物源性食品性狀以及降低成本，多種人工激素在飼料中被無節(jié)制的使用，雖然動(dòng)物源性食品產(chǎn)量大增，但是嚴(yán)重的激素殘留問題直接影響著人類的安全[1]。特別是目前使用最多的性激素，對人類健康危害極大，控制和禁止激素在養(yǎng)殖業(yè)中的使用及相關(guān)法律法規(guī)的建設(shè)已引起各方面的關(guān)注[2]。

近年來，食品安全事件屢見報(bào)端，性激素殘留的動(dòng)物源性食品更使消費(fèi)者談虎色變。所以，動(dòng)物源性食品的安全已引起全社會(huì)的廣泛關(guān)注。從20世紀(jì)80年代開始，美國和日本等國家或組織就致力于通過立法禁止或限制在性激素類藥物在食用性動(dòng)物飼養(yǎng)中的使用[3-8]。我國農(nóng)業(yè)部176號公告明確規(guī)定，禁止飼料和動(dòng)物飲用水中添加己烯雌酚、雌二醇等雌性激素，炔諾醇、左炔諾孕酮、炔諾酮等孕激素，并在235號公告規(guī)定了己烯雌酚、醋酸甲羥孕酮、甲基睪丸酮、群勃龍、玉米赤霉醇等外源性激素物質(zhì)在動(dòng)物性食品中的最高殘留限量為不得檢出[9-10]。盡管如此，由于商業(yè)利益驅(qū)動(dòng)，這些禁藥依然不斷地通過動(dòng)物源性食品進(jìn)入體內(nèi)，最終會(huì)對人類的健康產(chǎn)生不利的影響。因此，探討和開發(fā)動(dòng)物源性食品中性激素的檢測方法，對于食品安全的綜合管理，有效保障食品安全具有重要的指導(dǎo)意義。

1 動(dòng)物源性食品中性激素的來源

性激素是由動(dòng)物性腺分泌或人工合成的一類甾體激素的總稱，分子量低，親脂性強(qiáng)，對動(dòng)物體的生理及代謝起著重要的調(diào)節(jié)作用。性激素大都具有甾族化合物的母核結(jié)構(gòu)，包括雌激素（雌二醇、雌三醇、雌酮）、孕激素（孕酮、甲羥孕酮、美侖孕酮）和雄激素（脫氫表雄酮、硫酸脫氫表雄酮、二氫睪酮、甲睪酮、美雄酮、去甲雄三烯醇酮、去氫睪酮、去甲睪酮、脫氫表雄酮、雄烯二酮和表睪酮以及人工合成的酯化、甲氧基化或氟取代的衍生物）三大類[11-12]。根據(jù)來源和化學(xué)結(jié)構(gòu)，性激素可分為人工合成類固醇激素（丙酸睪酮、甲烯雌醇、苯甲酸雌二醇、醋酸群勃龍等）、人工合成的非類固醇激素（己烯雌酚、己烷雌酚等）、內(nèi)源性性激素（睪酮、孕酮、雌酮、17β-雌二醇）三大類[3]。

由于性激素在預(yù)防和治療家畜疾病方面具有顯著效果，且可以促進(jìn)其生長、泌乳以及肌肉脂肪的分配，因此性激素會(huì)被用來育肥家畜，但是，通過口服或注射的性激素會(huì)殘留于動(dòng)物體內(nèi)而污染其制品[13-14]。

2 動(dòng)物源性食品中性激素殘留的危害及相關(guān)檢測標(biāo)準(zhǔn)

性激素穩(wěn)定性較高，正常的烹調(diào)加工均不能將其破壞，可通過食物鏈進(jìn)入人體，在人體內(nèi)積累的量超過人體正常水平時(shí)，就會(huì)破壞機(jī)體的正常生理平衡，從而產(chǎn)生一系列不良反應(yīng)，其中以甲基睪酮、己烯雌酚和雌二醇較為典型。所以，大部分國家禁止性激素用于促進(jìn)動(dòng)物生長，不允許在食品中檢出，我國現(xiàn)行的動(dòng)物源性食品中性激素的檢測標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 我國現(xiàn)行的動(dòng)物源性食品中性激素檢測方法的標(biāo)準(zhǔn)Table1 The standardsof detectionmethods for gonadalhormones in anim alderived food in China

甲基睪酮是由人工合成的性激素，由于其具有提

高產(chǎn)量和控制性別等作用，所以在動(dòng)物養(yǎng)殖中被大量使用。但是，其在動(dòng)物體內(nèi)的代謝緩慢，即使極小的殘留會(huì)對人類健康造成巨大的潛在危害，包括美國、歐盟、日本等多個(gè)國家及組織已限制或禁止水產(chǎn)品中使用此激素并已立法[15]。我國農(nóng)業(yè)部于2002年實(shí)施的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY5070-2002《無公害食品水產(chǎn)品中漁藥殘留限量》中明確規(guī)定不允許使用甲基睪酮等激素類藥物，2003年農(nóng)業(yè)部發(fā)布的235號公告《動(dòng)物性食品中獸藥最高殘留限量》中也規(guī)定其為禁止使用獸藥，在所有動(dòng)物可食組織中不得檢出。

己烯雌酚具有促進(jìn)蛋白合成，加快動(dòng)物增重和骨骼鈣化的作用，可作為牛、羊的生長促進(jìn)劑，減少飼料的使用量[16]。但是，己烯雌酚會(huì)殘留于動(dòng)物源食品中，其不但會(huì)擾亂激素平衡，更嚴(yán)重的還會(huì)誘發(fā)女性乳腺癌、卵巢癌等疾病，農(nóng)業(yè)部已明確規(guī)定禁止使用該性激素[17]。

雌二醇不但具有加速動(dòng)物生長、繁殖的作用，而且可以提高畜禽瘦肉比例，在養(yǎng)殖業(yè)中得到廣泛應(yīng)用[18]。但是雌二醇會(huì)在動(dòng)物源食品中形成殘留，長期食用還會(huì)造成不育癥、女性早熟、男性女性化、男性生殖系統(tǒng)發(fā)育異常，使女性乳腺癌和子宮內(nèi)膜異位癥發(fā)病率上升[19]。為此，早在1991年，美國已明確規(guī)定了雌二醇棕櫚酸在家禽的可食用部分的最高殘留限量為0.002mg/kg，而韓國規(guī)定牛肉中苯甲酸雌二醇最高限量是0.000 12mg/kg，歐盟早在1996年已立法并禁止該類性激素在食品動(dòng)物養(yǎng)殖中使用，在我國，包括苯甲酸雌二醇等19種性激素及其鹽、酯等也禁止在食品動(dòng)物養(yǎng)殖中使用[20]。

3 動(dòng)物源性食品中性激素殘留的檢測研究進(jìn)展

由于動(dòng)物或動(dòng)物源性食品基質(zhì)具有一定的復(fù)雜性，性激素種類的多樣性以及低檢出水平的要求，而且樣品提取和凈化的過程比較復(fù)雜，導(dǎo)致回收率不高，使得性激素多殘留分析檢測具有一定的難度[21-23]。因此，如何對樣品進(jìn)行預(yù)處理以富集、凈化待測組分并消除基體干擾，同時(shí)保證預(yù)處理過程中目標(biāo)物性激素的損失最小，是一個(gè)必須解決的問題。另一方面要利用高靈敏度和高選擇性的檢測分析技術(shù)，盡量降低檢測限。

3.1 樣品的提取及凈化

動(dòng)物源性食品中部分激素以水溶性較強(qiáng)的結(jié)合物形式存在。為了使其能溶于有機(jī)溶劑，需對樣品進(jìn)行粉碎、冷凍干燥和均質(zhì)化，通過酶解將結(jié)合態(tài)的性激素解離出來，然后用有機(jī)溶劑進(jìn)行提取和富集[24]。為了獲得更加純凈的待分析物，動(dòng)物組織中性激素的提取溶劑包括甲醇、乙腈、二乙醚、叔丁基甲醚、水-甲醇、水-丙酮、乙腈-偏磷酸、氯仿-甲醇等[25]。可采用液液萃取、固相微萃取、超臨界流體萃取、冷凍離心除脂、加壓液體萃取等多種方法進(jìn)行凈化處理，進(jìn)一步方便目標(biāo)性激素的檢測[26-29]。凈化的目的是去除生物基質(zhì)中的脂肪、蛋白等雜質(zhì)，從而降低干擾，提高分析靈敏度。為了達(dá)到更好的純化效果，也可將幾種方法或柱子結(jié)合使用。動(dòng)物源性食品中幾種常見凈化方法優(yōu)劣比較見表2。

3.2 動(dòng)物源性食品中性激素的檢測和評價(jià)方法的比較

根據(jù)國內(nèi)外對動(dòng)物源性食品中獸藥殘留的規(guī)定，又因食品基質(zhì)相對復(fù)雜，獸藥殘留量極低，因此對獸藥殘留的檢測方法、靈敏度等均有較高要求。分析檢測食品基質(zhì)中性激素的傳統(tǒng)方法有紫外分光光度法、熒光光度法、酶聯(lián)免疫法（Enzyme linked immunosorbentassays，ELISA）、薄層色譜法、氣相色譜法（Gas chromatography，GC）、液相色譜法（High performance liquid chromatography，HPLC）、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（Gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（Liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS）、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（Liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLCMS/MS）、氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（Gas chromatographytandem mass spectrometry，GC-MS/MS）等，具體信息及其在應(yīng)用中的優(yōu)缺點(diǎn)見表3。

表3 動(dòng)物源性食品中性激素檢測方法的比較Table3 Comparison of theadvantagesand disadvantagesof the detectionmethodsofanimalderived food

4 色譜-質(zhì)譜法在動(dòng)物源性食品性激素檢測中的研究進(jìn)展

4.1 氣相色譜—質(zhì)譜法

氣相色譜—質(zhì)譜法包括氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）和氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（GC-MS/MS）。氣相色譜—質(zhì)譜法集聚了色譜的高效分離及質(zhì)譜在檢測和確認(rèn)化合物的優(yōu)點(diǎn)，氣相色譜—質(zhì)譜法成為性激素檢測分析中常用的技術(shù)。氣相色譜—質(zhì)譜法的靈敏度、準(zhǔn)確度、回收率均較好，分析過程簡便快捷，適用于同時(shí)檢測性激素多組分殘留。但是，性激素對熱不穩(wěn)定且不易揮發(fā)，用氣相色譜—質(zhì)譜法分析，首先要用硅烷化試劑和酰基化試劑將性激素衍生化，獲得熱穩(wěn)定性及揮發(fā)性都較好的衍生化物質(zhì)。

黃冬梅等[30]將雌二醇D2作為內(nèi)標(biāo)定量，通過GCMS建立了水產(chǎn)品中雌二醇?xì)埩袅康臋z測方法，采用葡糖苷酸酶酶解樣品，正己烷去除脂肪和色素等雜質(zhì)，用乙酸乙酯提取，濃縮后衍生化，然后進(jìn)行檢測。鄒龍等[31]以氘代同位素為內(nèi)標(biāo)，測定了不同魚貝類肌肉組織中雌二醇?xì)埩袅?。首先在樣品中加入?nèi)標(biāo)和乙酸鈉緩沖溶液并均質(zhì)，然后用乙腈多次超聲提取，利用正己烷脫脂除雜質(zhì)，利用C18固相萃取柱凈化和柱前三甲基硅烷化后，進(jìn)行GC-MS分析。根據(jù)雌二醇和內(nèi)標(biāo)衍生物定量離子質(zhì)量色譜圖的峰面積比值，內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)曲線法定量，最低定量檢測限為2μg/kg。曾東平等[32]采用固相萃取小柱凈化衍生后，利用GC－MS對豬肌肉中甲睪酮等多種性激素殘留進(jìn)行檢測，當(dāng)濃度為2.5μg/kg～50μg/kg時(shí)，其線性關(guān)系較好，相關(guān)系數(shù)均大于0.97，回收率和靈敏度較好，可在水產(chǎn)品性激素殘留檢測中大力推廣。宮向紅等[33]用乙酸乙酯對鰻魚和蝦中性激素己烯雌酚進(jìn)行提取，正相固相萃取小柱凈化、衍生后進(jìn)行GC-MS分析，當(dāng)添加水平在0.5μg/kg～1.0μg/kg時(shí)，回收率大于75%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.9%～2.7%，線性相關(guān)系數(shù)為0.999。

湛嘉等[34-35]采用GC-MS分別對黃鱔和豬肉中的性激素殘留開展了檢測，采用葡糖苷酸酶對黃鱔提取物進(jìn)行水解，用叔丁基甲醚提取，用正己烷脫脂，再經(jīng)C18小柱和NH2小柱凈化，用七氟丁酸酐進(jìn)行衍生化，基于外標(biāo)法，利用GC-MS進(jìn)行檢測，檢出限在0.50μg/kg～1.00μg/kg，平均回收率范圍為56%～103%，平均相對標(biāo)準(zhǔn)偏差范圍為3.1%～29.5%，且對不同批次樣品的重復(fù)性也較好；對豬肉中l(wèi)6種性激素多殘留檢測結(jié)果顯示，檢出限在0.25μg/kg～1.0μg/kg之間，平均回收率分別為83.7%～107.9%，重復(fù)性好。

Scarth等[36]利用GC-MS/MS測雄性激素和孕激素，檢測限為 10.9 pg/mL～160.7 pg/mL。Rambaud 等[37]采用GC-MS/MS同時(shí)測定了動(dòng)物毛發(fā)中的28種同化激素，用甲醇提取基質(zhì)中的藥物，分別得到雌性激素與雄性激素和孕激素，檢測限為0.1μg/kg～10μg/kg。

但是，氣相色譜法要求分析物有較低的沸點(diǎn)和很好的揮發(fā)性，由于激素個(gè)體性質(zhì)的差異常需要對其進(jìn)行多種衍生處理，雖然氣相色譜分析法也能實(shí)現(xiàn)對物質(zhì)的定性和確證分析，但需要衍生處理而太耗時(shí)，不能滿足快速分析的需要，有的激素也不容易通過衍生得到很好的極性和熱穩(wěn)定性，制約了其在多殘留檢測中的應(yīng)用。

4.2 液相色譜—質(zhì)譜法

高效液相色譜法以液體作為流動(dòng)相，可同時(shí)檢測多種類固醇激素，不受樣品揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的限制，不需要衍生化，只要適當(dāng)應(yīng)用各種試劑及凈化方法，再結(jié)合一定的檢測器，可實(shí)現(xiàn)對多種物質(zhì)的檢測分析。液相色譜-質(zhì)譜法包括高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（HPLC-MS）、液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC-MS/MS）和超高效液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜法（Ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLCMS/MS），目前液相色譜－質(zhì)譜法是分析食品中性激素多組分殘留的有效方法之一。

楊敏等[38]通過高效液相色譜法對魚、蝦中己烯雌酚殘留進(jìn)行定量檢測，最低檢測限為2.5μg/kg，其回收率和線性關(guān)系良好。周建科等[39]采用高效液相色譜法成功建立了中老年奶粉中性激素的監(jiān)測分析方法。Yang等[40]經(jīng)Helix pomatia水解，甲醇提取，石墨化碳黑固相萃取，再過NH2柱，利用液相色譜方法檢測肉、奶、肝臟中50種激素殘留的含量。檢出限達(dá)到0.04 μg/kg～20 μg/kg。

但是，液相色譜的紫外檢測器存在一定的局限性，如果液相色譜結(jié)合三重四極桿、離子阱、飛行時(shí)間等質(zhì)譜檢測器，可大大提高準(zhǔn)確度，可實(shí)現(xiàn)多殘留的同時(shí)檢測分析。高效液相色譜-質(zhì)譜法集高效分離和多組分定性定量于一體，可提供待測樣品完整的準(zhǔn)分子、離子，如采用超高效液相色譜還可以進(jìn)一步改善樣品的分離度、分析速度和靈敏度。

萬巧玲等[41]利用HPLC-MS/MS定量分析雌酮、17β-雌二醇和17α-乙炔基雌二醇，檢測限分別為0.5、0.4、0.1 ng/L。Vanhaecke 等[42]利用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測34種合成類固醇激素（包括10種雌性激素、14種雄性激素、10種促孕激素）在牛肉中的殘留，檢測限與定量限分別為0.04μg/kg～0.88μg/kg和0.12μg/kg～1.9μg/kg。該方法檢測到所有的自然的、合成的類固醇，實(shí)驗(yàn)重現(xiàn)好，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差＜20%，線性相關(guān)系數(shù)在0.991～0.999之間。Xu等[43]利用LC/ESIMS/MS檢測動(dòng)物肌肉中10種激素殘留含量，檢出限達(dá)到 0.06μg/kg～0.22μg/kg，定量限達(dá)到 0.12μg/kg～0.54μg/kg。Blasco等[44]均質(zhì)后經(jīng) SubtilisinA 降解，甲醇提取，過C18和NH2柱，乙腈洗脫，對肉制品中22中激素殘留進(jìn)行了分析，檢出限小于0.5μg/kg。劉桂華等[45]開展了深圳市售豬肉、牛肉、雞蛋和牛奶中激素殘留情況的多組分同時(shí)測定，用乙腈提取待測樣品并用正己烷脫脂，然后利用HLB-NH2柱串聯(lián)固相萃取凈化，采用HPLC-MS/MS電噴霧電離，多反應(yīng)監(jiān)測模式檢測，內(nèi)標(biāo)法定量，20種目標(biāo)性激素的方法定量限為0.5μg/kg～1.0μg/kg，方法平均回收率60.4%～118.2%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差2.5%～16.2%，該方法可用于豬肉、牛肉、雞蛋和牛奶中20種游離態(tài)性激素的檢測。

綜上所述，食品基質(zhì)中性激素多殘留檢測的現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)多采用液相色譜-質(zhì)譜法，而且歸因于其較高的準(zhǔn)確性和靈敏度，以液相色譜－質(zhì)譜法來測定動(dòng)物源性食品中性激素殘留的標(biāo)準(zhǔn)將不斷得到更新。

5 總結(jié)與展望

近幾年來，隨著科技的發(fā)展及生活水平的提高，食品中性激素多組分殘留的檢測要求越來越高，因此發(fā)展低檢出限高靈敏度的多組分殘留同時(shí)檢測方法越來越受到重視。目前，主要采用色譜與高靈敏度的檢測系統(tǒng)一質(zhì)譜相結(jié)合來實(shí)現(xiàn)。但是在氣相色譜-質(zhì)譜法使用過程中，很難做到一種衍生試劑可以將所有的性激素進(jìn)行衍生，限制了多殘留的同時(shí)檢測；而且在衍生化過程中產(chǎn)生的副產(chǎn)物會(huì)對目標(biāo)待測物產(chǎn)生干擾，使檢測的準(zhǔn)確性和靈敏度降低。而采用液相色譜—質(zhì)譜法適合分析熱穩(wěn)定性和熱揮發(fā)性差的化合物，可避免上述問題，而且隨著多種質(zhì)譜檢測器的應(yīng)用，還可以確定一些未知激素進(jìn)行定性和定量分析。

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