崔廣林 李隆云 譚均 張應(yīng) 鈕杰

摘? 要? 建立川佛手重金屬含量測定的電感耦合等離子體發(fā)射光譜（ICP-OES）分析方法，并對川佛手重金屬含量進行分析與安全評價。樣品經(jīng)微波消解后，用ICP-OES方法測定其鉛、鎘、銅、汞、砷5種重金屬含量。利用SPSS統(tǒng)計軟件對不同重金屬元素進行相關(guān)分析和聚類分析，結(jié)合單因子污染指數(shù)法和Nemerow綜合污染指數(shù)法評價其安全性。結(jié)果表明，鉛、鎘和銅的線性范圍為0～1.00 ?g/mL，砷和汞的線性范圍為0～0.10 ?g/mL，線性關(guān)系良好（r>0.998 6），檢測限范圍為0.000 3～0.004 5 ?g/mL，精密度實驗RSD為1.03%～4.39%，重復(fù)性實驗RSD<5.00%，平均加樣回收率在94%～101%。建立的ICP-OES方法可準確測定川佛手中5種重金屬元素的含量。鉛、鎘、銅的平均含量分別為2.035、0.121、3.237 ?g/g，汞、砷均未檢出。鉛-鎘、銅-鎘之間存在負相關(guān)，鉛-銅之間存在正相關(guān)。30個不同產(chǎn)地川佛手樣品中重金屬含量均在中國《藥用植物及制劑進出口綠色行業(yè)標準》規(guī)定范圍內(nèi)，綜合污染指數(shù)為 0.316～0.518，處于安全水平。

關(guān)鍵詞? 川佛手;重金屬污染;ICP-OES;聚類分析;相關(guān)分析;安全評價中圖分類號? S31 ?????文獻標識碼? A

DOI10.3969/j.issn.1000-2561.2018.12.024

佛手是蕓香科柑橘屬植物佛手（Citrus medicaL. var.sarcodactylisSwingler）的干燥果實。具有舒肝理氣、和胃止痛、燥濕化痰的功效，用于治療肝胃氣滯、胸脅脹痛、胃脘痞滿、食少嘔吐、咳嗽痰多等病癥^[1]。佛手在我國藥用歷史悠久、分布較廣，是一味藥食同源的傳統(tǒng)名貴中藥，具有一定的經(jīng)濟價值，在中醫(yī)藥領(lǐng)域研究甚廣^[2]。佛手因產(chǎn)地不同，品種主要有川佛手、廣佛手、金佛手和建佛手等^[3]。川佛手主要分布在四川盆地邊緣地區(qū)，主產(chǎn)于四川合江、宜賓、沐川、犍為、樂山及重慶等地^[4]。

近年來，隨著中醫(yī)藥的不斷發(fā)展以及其優(yōu)勢的不斷凸顯，中藥日益受到人們的追捧，但中藥中重金屬殘留問題也越來越受到人們的重視。中藥材中重金屬限量是其進入國際草藥市場的基本保證^[5]?，F(xiàn)代科學(xué)已證明了重金屬殘留能夠進入人體并與酶蛋白牢固結(jié)合，導(dǎo)致組織細胞出現(xiàn)結(jié)構(gòu)和功能上的損害^[6]。中藥中重金屬元素的含量直接影響到中藥的質(zhì)量和用藥安全性。目前國內(nèi)外對佛手的研究主要集中在種質(zhì)資源、栽培技術(shù)、藥理作用、化學(xué)成分及鑒別等領(lǐng)域^[7-11]，關(guān)于重金屬含量的測定未見報道。電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法（ICP-OES）以其低檢出限、高精密度、較小的基體效應(yīng)、較寬的線性范圍和多元素同時測定的優(yōu)點，已廣泛應(yīng)用于食品、中草藥中的微量元素分析^[12]。本研究采用微波消解，應(yīng)用電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜對不同產(chǎn)地川佛手藥材中的鉛、鎘、銅、汞、砷的含量進行測定，并采用聚類分析、相關(guān)性分析和安全性評價等，以期建立川佛手藥材重金屬的檢測方法，為初步確定川佛手藥材中重金屬安全、合理的含量范圍奠定基礎(chǔ)，為企業(yè)生產(chǎn)提供指導(dǎo)。

1? 材料與方法

1.1? 材料

藥材樣品采自于川佛手主產(chǎn)區(qū)重慶和四川，全部經(jīng)重慶市中藥研究院李隆云研究員鑒定，為蕓香科柑橘屬植物佛手（Citrus medicaL.var.sarco?dactylisSwingler）的干燥果實。藥材編號和產(chǎn)地如表1所示。

OPTIMA 8000 DV型電感耦合等離子體發(fā)射光譜儀（美國Perkin Elmer公司），BS223S型電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司），CEM-MARS6 高通量密閉微波消解系統(tǒng)（美國CEM公司），BHW-09C型恒溫加熱器（上海博通化學(xué)科技有限公司），氫化物發(fā)生器、旋流霧室（美國Elemental Scientific Inc.），SC-FASTⅠ型自動進樣器（美國Elemental Scientific Inc.），超純水發(fā)生器（美國 SIGMA公司）。

5種重金屬銅（Cu）、鉻（Cd）、鉛（Pb）、砷（As）、汞（Hg）單元素對照品溶液（質(zhì)量濃度均為1 000 ?g/mL，批號分別為211125059、212085110、213065079、213015085、213105088）均購自美國AccuStandard公司。硝酸為優(yōu)級純，氫氧化鈉、硼氫化鈉、碘化鉀、抗壞血酸均為分析純（重慶川東化工有限公司）。玻璃儀器使用之前均用30%硝酸浸泡過夜，用超純水沖干凈后，烘干，備用。

1.2? 方法

1.2.1 ?ICP-OES測定工作條件? 高頻入射功率1.3 kW，等離子體氣流15 L/min，輔助氣流0.2 L/min，霧化器氣流0.55 L/min，進樣時間45 s（As、Hg測定時進樣時間為70 s），預(yù)沖洗時間20 s，積分時間自動，進樣流速0.44 mL/min，Cu、Cd、Pb、As、Hg元素含量測定采用軸向觀測位。

1.2.2? 微波消解條件 ?具體如表2所示。

1.2.3? 溶液的配置? （1）對照品溶液的制備。精密移取適量的Cu、Cd、Pb單元素標準溶液混合，用2%的硝酸溶液稀釋成含Cu、Cd、Pb質(zhì)量濃度均為10 ?g/mL的對照品儲備液。精密移取對照品儲備液，用2%的硝酸溶液依次稀釋，配制成含上述各元素質(zhì)量濃度分別為0.01、0.05、0.10、0.20、0.50、1.00 ?g/mL的對照品溶液。

精密移取適量As、Hg單元素標準溶液，用2%的硝酸溶液稀釋，配制成質(zhì)量濃度為10 ?g/mL的溶液，作為As、Hg的對照品儲備液，精密移取As、Hg對照品儲備液，用2%硝酸溶液稀釋，制成質(zhì)量濃度分別為0.01、0.02、0.05、0.10 ?g/mL的對照品溶液。

（2）待測溶液的制備。取川佛手藥材樣品，干燥、粉碎、過60目篩，精確稱取0.200 0 g，置耐壓耐高溫微波消解罐中，加入7 mL硝酸，將消解罐置于恒溫加熱器中，于100 ℃條件下預(yù)消解20 min，取出放冷至室溫，加蓋密封，放入微波消解儀中，按照表2中的方法進行消解。消解完全后，取出放至通風櫥中，待消解液冷卻至室溫，打開消解罐，放置于100 ℃恒溫加熱臺中，加熱趕酸，直到消解罐中的溶液剩余量為1～2 mL，放冷。將消解液轉(zhuǎn)入10 mL容量瓶中，用少量2%硝酸洗滌消解罐3次，洗液合并于容量瓶中，用2%硝酸稀釋至刻度，搖勻，即得。

測定As、Hg含量時分別吸取各樣品待測溶液1 mL，置于5 mL容量瓶中，加20%碘化鉀溶液（臨用前配制）1 mL，搖勻，加10%抗壞血酸溶液（臨用前配制）1 mL，搖勻，用稀釋劑稀釋至刻度，搖勻，密塞，置100 ℃水浴中加熱5 min，取出，放冷。

（3）空白對照溶液的制備。除不加川佛手樣品粉末外，其余制備方法與待測溶液的制備方法相同，制成空白對照溶液。

1.2.4? 方法學(xué)考察 ?（1）線性關(guān)系。取1.2.3（1）項下配置的不同濃度的混合標準溶液和不同濃度的Hg單元素對照溶液，在選定的測試參數(shù)下，用ICP-OES法進行測定。以對照品濃度為橫坐標，測量值（3次讀數(shù)的平均值）為縱坐標，繪制標準曲線，得到各元素的線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)，結(jié)果如表3所示。由表3可知，5種重金屬元素線性關(guān)系良好。

（2）檢測限。精密移取16 mL硝酸于50 mL的容量瓶中，加一級水稀釋定容，得到20%的硝酸，作為空白溶液。在1.2.1項條件下連續(xù)進樣10次測定空白，計算空白溶液強度值的標準偏差。根據(jù)空白溶液強度值的標準偏差，計算檢測限，檢測限=SD×3。Cu、Cd、Pb、As、Hg的檢測限分別為0.002 1、0.001 8、0.000 3、0.004 5、0.002 1 ?g/mL，結(jié)果如表4所示。

（3）精密度實驗。取混合標準品溶液連續(xù)進樣10次，測定這5種元素的含量，Pb、Cd、Cu、As、Hg的RSD分別為1.03%、3.47%、1.96%、4.39%、2.75%，結(jié)果如表5所示。由表5可知，儀器的精密度良好。

（4）重復(fù)性實驗。取樣品（S5）按1.2.3（2）項平行制備6次，并在1.2.1項條件下測定待測溶液中5種重金屬的含量，Pb、Cd、Cu、As、Hg的RSD分別為3.14%、3.75%、2.52%、4.85%、3.71%。表明重現(xiàn)性良好。

（5）加樣回收率實驗。精密稱取干燥、粉碎、過60目篩的佛手樣品0.200 0 g，同一個批次稱取2份，按1.2.3（2）項下方法，平行制備6份待測溶液，進樣分析，計算各元素的回收率，Pb、Cd、Cu、As、Hg 5種元素平均回收率分別為101%、94%、96%、99%、100%，結(jié)果如表6所示。由表6可知，該方法準確可靠，能滿足樣品中各元素的分析測定。

1.2.5? 樣品測定 ?按照1.2.3項制備川佛手樣品的供試品溶液。在1.2.1項條件下，測定供試品溶液中5種重金屬的含量。30份川佛手樣品中5種重金屬的含量如表7所示。

1.2.6? 安全性評價方法 ?評價方法采用單因子污染指數(shù)法和內(nèi)梅羅（Nemerow）綜合污染指數(shù)法，這2種方法已經(jīng)在中藥材重金屬安全評價方面得到廣泛的應(yīng)用^[13]。其計算公式如下：

P_i=C_i/L_i

式中，P_i為重金屬i的單因子污染指數(shù);C_i為重金屬i的實測濃度;L_i為重金屬i的評價標準。分級標準為P_i≤1為非污染，1<P_i≤2為輕污染，

2? 結(jié)果與分析

2.1? 不同產(chǎn)地川佛手藥材的重金屬含量比較

從表7可以看出，不同產(chǎn)地的川佛手中Cu含量差別最大，Cd含量差別最小;Cu平均含量最高，Cd平均含量最低，As和Hg未檢出。川佛手藥材中Pb、Cd和Cu含量隨產(chǎn)地不同差異顯著。Pb含量范圍在0.317～3.048 ?g/g，平均2.035 ?g/g，中位數(shù) 2.155 ?g/g，四川省犍為縣新民鎮(zhèn)產(chǎn)佛手（S21）中Pb含量最高，四川省沐川縣沐溪鎮(zhèn)產(chǎn)佛手（S17）中Pb含量最低。Cd含量范圍在0.094～0.156 ?g/g，平均0.12 ?g/g，中位數(shù)0.123 ?g/g，四川省中江縣太平鄉(xiāng)產(chǎn)佛手（S27）中Cd含量最高，S1、S3、S5、S11、S12、S14、S18、S19、S20、S21、S22、S23、S24、S25、S26、S28和S29號佛手樣品未檢出。Cu含量范圍在0.044～8.333 ?g/g，平均3.237 ?g/g，中位數(shù)3.674 ?g/g，四川省長寧縣老翁鎮(zhèn)產(chǎn)佛手（S15）中Cu含量最高，重慶市合川區(qū)草街鎮(zhèn)產(chǎn)佛手（S13）中Cu含量最低。重金屬總量范圍在1.218～ 11.103 ?g/g，平均5.325 ?g/g，中位數(shù)6.229 ?g/g，四川省長寧縣老翁鎮(zhèn)產(chǎn)佛手（S15）重金屬總量最高，重慶市合川區(qū)草街鎮(zhèn)產(chǎn)佛手（S13）重金屬總量最低。Cd、Pb、Cu、As、Hg和重金屬總量各樣品均符合2001年我國對外貿(mào)易經(jīng)濟合作部頒布的《藥用植物及制劑進出口綠色行業(yè)標準》^[14]要求。

2.2? 不同產(chǎn)地川佛手中重金屬含量聚類分析

聚類分析作為一種探索性的分類方法，可以將一組數(shù)據(jù)按照本身的內(nèi)在規(guī)律較合理的分為幾類。這就大大縮小了以往全憑主觀判斷所造成的誤差，使數(shù)據(jù)分析結(jié)果更具客觀性^[15]。而系統(tǒng)聚類則是把相似的樣品或變量歸類的有效方法。因此，本研究使用 SPSS Statistics 20對不同產(chǎn)地的川佛手樣品重金屬（Pb、Cd、Cu、As、Hg）含量測定結(jié)果進行系統(tǒng)聚類，以各重金屬含量為聚類的變量，采用平方歐氏距離（squared Euclidean distance）獲得聚類分析樹狀圖（圖1）。

由圖1可知，通過對重金屬（Pb、Cd、Cu、As、Hg）含量測定結(jié)果進行聚類分析，結(jié)果顯示，不同產(chǎn)地的川佛手樣品可分為三大類。第一類共有21批樣品，分別為S1、S3、S5、S6、S8、S11、S12、S14、S15、S16、S18、S19、S20、S21、S22、S23、S24、S25、S26、S28和S29。該類樣品中Pb、Cu的含量較高，Cd的含量較低，除 S6、S8、S15、S16樣品外，其他各個樣品中Cd的含量均遠低于其他2類。第二類僅有1批，為S17，該樣品Pb的含量均遠低于其他2類。第三類共8批，分別為S2、S4、S7、S9、S10、S13、S27和S30。該類樣品中Cu的含量均遠低于其他2類。

2.3? 川佛手藥材中重金屬元素相關(guān)性分析

對川佛手中的重金屬元素進行相關(guān)性分析，其Pearson相關(guān)系數(shù)如表8所示。從表8中可知，川佛手藥材中Pb與Cd、Cu，Cd與Cu之間的相關(guān)系數(shù)分別為–0.652 9、0.727 8和–0.724 1，相關(guān)系數(shù)經(jīng)顯著性檢驗表明p<0.05，為高度相關(guān)^[16]。

2.4? 川佛手安全性評價

2001年我國對外貿(mào)易經(jīng)濟合作部頒布的《藥用植物及制劑進出口綠色行業(yè)標準》對中藥中重金屬總量、Pb、Cd、Hg、Cu、As的含量進行了規(guī)定^[12]，即總量≤20.0 ?g/g，Pb≤5.0 ?g/g，Cd≤0.3 ?g/g，Hg≤0.2 ?g/g，Cu≤20.0 ?g/g，As≤2.0 ?g/g。

由表7可知，采自30個不同產(chǎn)地的川佛手藥材中重金屬總量均低于20.0 ?g/g，As和Hg未檢出，其余元素含量均在限量以內(nèi)。

3? 討論

本研究建立了微波消解-電感耦合等離子體發(fā)射光譜法（ICP-OES）測定佛手中5種重金屬元素含量的方法。本方法中，鉛、鎘、銅、砷和汞元素消解方法簡單、時間短、效率高，特別是汞可以無損失回收;在ICP-OES分析檢測中，直接分析檢測砷和汞的靈敏度不好，使用了氫化物反應(yīng)法，砷元素不同價態(tài)靈敏度不同，最佳為As³⁺，使用了KI來還原，有效提高了砷和汞的靈敏度，達到了分析檢測需求。該方法簡便、快速、準確，可用于佛手中5種重金屬元素的含量測定，對于客觀評價其質(zhì)量具有實際的意義。用該方法測定了30個不同產(chǎn)地佛手中5種重金屬的含量，從川佛手藥材重金屬元素測定的結(jié)果可以看出，不同產(chǎn)地藥材中重金屬的含量差異較大，能夠反映出不同地區(qū)的土壤、氣候、水分、礦物質(zhì)的分布情況對中藥材的質(zhì)量有一定的影響。5種重金屬元素的平均含量水平由高到低依次為銅、鉛、鉻（砷和汞未檢出），均低于2001年我國對外貿(mào)易經(jīng)濟合作部頒布的《藥用植物及制劑進出口綠色行業(yè)標準》對藥用植物原料、飲片等的限量標準^[12]，即總量≤20.0 ?g/g，Pb≤5.0 ?g/g，Cd≤0.3 ?g/g，Hg≤0.2 ?g/g，Cu≤20.0 ?g/g，As≤2.0 ?g/g。采用單因子污染指數(shù)法和內(nèi)梅羅（Nemerow）綜合污染指數(shù)法進行安全性評價，單因子污染指數(shù)均小于1，綜合污染指數(shù)為 0.316～0.518。說明這些川佛手樣品中重金屬元素的量符合我國安全性的相關(guān)規(guī)定，處于安全范圍內(nèi)。川佛手主產(chǎn)區(qū)的佛手藥材重金屬未超標。

中藥材重金屬污染現(xiàn)狀不容樂觀，重金屬超標不僅影響藥材的質(zhì)量，而且會成為中藥材走向世界的“瓶頸”^[17]，應(yīng)當引起藥材種植戶和使用單位的注意。佛手中重金屬來源受多種因素影響，生長的土壤、自身富集、工業(yè)“三廢”、農(nóng)藥化肥和加工運輸貯存都會造成不同程度的重金屬污染。挑選優(yōu)良產(chǎn)地種植，減少工業(yè)生產(chǎn)中重金屬污染物的排放，加強中藥材的行業(yè)規(guī)范都能夠有效地減少佛手中重金屬的含量。減少中藥材的重金屬污染是從源頭上保證中藥材質(zhì)量，保障中藥用藥安全的重要措施。本研究對正確認識中藥材川佛手中重金屬的組成及其含量范圍提供了數(shù)據(jù)支持，對川佛手藥材的地理分布與其重金屬的含量存在關(guān)系提供了一定的參考依據(jù)，對制定川佛手藥材質(zhì)量標準、保證藥材有效性和安全性以及全面提高川佛手質(zhì)量控制水平提供了理論基礎(chǔ)。

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