沈詩鈺 孫威江 唐琴

摘? 要? 本文依靠近紅外光譜技術(shù)對白茶進(jìn)行總黃酮含量的快速判別。對91份來自不同廠家、不同年份和不同等級的白茶進(jìn)行總黃酮含量的測定，并采集白茶近紅外光譜圖，運(yùn)用TQ analyst 8.0軟件進(jìn)行分析，比較了不同光譜預(yù)處理方法，最終采用偏最小二乘法建立白茶總黃酮含量的定量模型。研究結(jié)果表明，所建立的總黃酮定量模型的相關(guān)系數(shù)為0.999 77，校正均方根差為0.043 5，驗(yàn)證均方根差為0.180，驗(yàn)證集平均相對誤差為2.89%。該模型預(yù)測結(jié)果較好，能夠準(zhǔn)確、快速、無損地對白茶總黃酮含量進(jìn)行定量分析。

關(guān)鍵詞? 白茶;總黃酮含量;快速測定;近紅外光譜技術(shù)中圖分類號? TS272.7???? 文獻(xiàn)標(biāo)識碼? A

DOI10.3969/j.issn.1000-2561.2018.12.025

白茶為中國名茶，因其不炒不揉的獨(dú)特工藝保留了茶葉原始的清香和甘爽的滋味，備受人們的喜愛^[1]。黃酮類物質(zhì)是多酚類中的重要組分，對茶葉感官品質(zhì)、生理功能等起重要作用。在六大茶類中白茶的黃酮類物質(zhì)含量最高，茶葉中的黃酮類物質(zhì)不僅影響茶葉的滋味和色澤，也因其卓越的保健功效越來越受大眾的關(guān)注^[2]。大量研究表明黃酮類化合物在抗衰老、加強(qiáng)免疫力、預(yù)防癌癥、降低高血壓和糖尿病的發(fā)生率、抵抗病毒、抑制細(xì)菌的繁殖、抗疲勞、預(yù)防鈣流失等方面有一定作用^[3-9]。黃酮類化合物是白茶重要的品質(zhì)成分，也是重要的保健成分，進(jìn)一步加強(qiáng)對黃酮類化合物的研究對白茶品質(zhì)研究和品牌推廣有著重要意義。依靠近紅外光譜技術(shù)能夠快速準(zhǔn)確地判別白茶中的總黃酮含量，極大地提高了檢測效率，提高了生產(chǎn)效益，在生產(chǎn)實(shí)踐中具有廣闊的開發(fā)前景。

近紅外光譜的范圍在可見光與中紅外光譜之間，近紅外區(qū)域的主要信息來源于-CH、-NH、-OH等含氫基團(tuán)的倍頻和合頻吸收，這些基團(tuán)的基頻吸收出現(xiàn)在中紅外區(qū)，因此，絕大多數(shù)物質(zhì)在近紅外區(qū)域都有相應(yīng)的吸收帶，都能通過近紅外光譜技術(shù)做定量分析。近紅外光譜作為一種新型檢測手段，在茶葉質(zhì)量檢測中發(fā)揮了越來越重要的作用。如王曼等^[10]應(yīng)用近紅外光譜技術(shù)對黃山毛峰茶的鮮葉品質(zhì)和等級做出快速判別，周小芬等^[11]利用近紅外光譜技術(shù)對大佛龍井茶的感官指標(biāo)和品質(zhì)指標(biāo)進(jìn)行快速預(yù)測，建立了科學(xué)準(zhǔn)確的茶葉品質(zhì)評價(jià)方法。此外，近紅外光譜技術(shù)還在年份判別^[12-14]、真?zhèn)螜z測^[15-17]、品種檢測^[18-19]發(fā)揮著重要作用。

傳統(tǒng)的茶葉物質(zhì)中總黃酮的定量測定主要為三氯化鋁比色法，但由于該方法前處理投入時(shí)間長，人員需求多，對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性都有較大影響，不適合大量數(shù)據(jù)分析。近紅外光譜技術(shù)能對樣品進(jìn)行快速無損的在線檢測，耗時(shí)少，操作簡便^[20]。目前，利用近紅外光譜技術(shù)對茶葉中品質(zhì)成分的測定分析主要為茶多酚、氨基酸、咖啡堿、茶紅素、茶黃素等，對白茶總黃酮含量測定鮮有研究。本研究將測定的總黃酮含量的真實(shí)值與其近紅外光譜圖相關(guān)聯(lián)，通過化學(xué)計(jì)量法建立定量模型，以達(dá)到快速測定的目的。

1? 材料與方法

1.1? 材料

1.1.1? 材料與試劑? 材料：白茶茶樣均采購于福鼎市內(nèi)各大茶企，為2001—2017年生產(chǎn)的不同等級（白毫銀針、白牡丹、壽眉）、不同廠家的茶樣，共91個(gè)樣品。為保證樣品的差異性，取樣時(shí)，每個(gè)批次作為1個(gè)樣本。樣品清單如表1所示。

試劑：氯化鋁（批號：20100114），國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;槲皮素對照品（批號：DST160928-028，純度≥98%），成都德思特生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 ?儀器與設(shè)備? Antaris II 傅里葉近紅外光譜儀（Thermo fisher scientific，美國），紫外可見光分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限公司），電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學(xué)儀器有限公司），BSA124S電子天平（Sartorius，德國），高速粉碎機(jī)（上海鼎廣機(jī)械設(shè)備郵箱公司），電熱烘干箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）。

1.2? 方法

1.2.1? 近紅外光譜的采集? 取上述91份白茶茶樣，粉碎后過80目篩，裝袋密封。

測定方法：應(yīng)用積分球固體采樣模塊，每個(gè)白茶樣品粉末裝樣約13 g，搖晃樣品杯，使得樣品勻整緊密地放入樣品杯中，并將樣品杯底部擦拭干凈，不得沾染茶粉，待測。分辨率8 cm^–1，掃描次數(shù)64次，掃描范圍10 000～4 000 cm^–1，扣除背景，Gain選擇2×，以空氣作為參比，使用空調(diào)控制室溫，恒定在25 ℃，采集白茶茶樣近紅外光譜圖，每個(gè)樣品重復(fù)3次，取平均值。

1.2.2? 白茶總黃酮含量的測定? 白茶總黃酮含量的測定采用三氯化鋁比色法，參照袁華芳^[21]的研究方法。黃酮類化合物與三氯化鋁反應(yīng)生成黃酮的鋁絡(luò)合物，并且茶葉中的黃酮類物質(zhì)多以糖苷為主，因此可用槲皮素為基準(zhǔn)物質(zhì)做定量標(biāo)準(zhǔn)曲線，達(dá)到定量檢測的目的。

以槲皮素為對照品，如圖1可知，槲皮素在420 nm處有最大吸收峰，因此以420 nm作為測定波長，測定茶樣在420 nm的吸光值，每個(gè)樣品重復(fù)3次，取平均值，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算白茶總黃酮含量。

1.2.3 ?化學(xué)計(jì)量法的選擇? 建立定量模型是近紅外光譜分析中較為重要的一步，對于組成復(fù)雜的天然產(chǎn)物如中藥、煙草、茶葉等通?？梢允褂闷钚《朔ǎ╬artial least squares，PLS）。PLS是基于因子分析的多變量校正方法，也是目前在近紅外光譜技術(shù)領(lǐng)域中應(yīng)用最多的多元校正方法，因此，本研究引入PLS作為建模方法。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本研究運(yùn)用Omnic 8.2軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)格式的轉(zhuǎn)換，用Origin 2017軟件作圖，用TQ Analyst 8.0軟件進(jìn)行光譜預(yù)處理和模型建立。

2? 結(jié)果與分析

2.1白茶近紅外光譜圖的采集

運(yùn)用1.2.1的方法對91份白茶近紅外光譜進(jìn)行采集，樣品近紅外光譜疊加結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，不同等級和年份的白茶光譜圖雖然總體較為相似，但在高波長段的NIR吸收峰相對較強(qiáng)和尖銳，區(qū)分較為明顯，這是由于不同白茶的品質(zhì)成分雖然大致相同但是含量有所區(qū)別，導(dǎo)致吸收峰和峰型的差異。

2.2總黃酮含量的測定

按照1.2.2測定91份白茶茶樣的總黃酮含量，結(jié)果如表2所示。由表2可知，不同等級白茶總黃酮含量區(qū)別較為明顯，壽眉總黃酮含量最高，其次是白牡丹，白毫銀針含量最低。說明白茶黃酮含量與等級有著密切關(guān)聯(lián)，等級越高，總黃酮含量越低。

采用PLS建立白茶總黃酮含量測定模型，運(yùn)用TQ Analyst 8.0軟件對模型進(jìn)行優(yōu)化和驗(yàn)證。從91份白茶樣品中隨機(jī)選取校正集和驗(yàn)證集，一般選擇全部樣品的2/3至3/4作為模型的校正集，剩下的為驗(yàn)證集，保證驗(yàn)證集的波動(dòng)范圍在校正集中，校正集和驗(yàn)證集的含量分布如表3所示。

2.3光譜預(yù)處理方法的選擇

因?yàn)榘撞璨铇拥墓庾V相差不大，且受環(huán)境干擾較大，由檢測器檢測到的除了待測樣品的信息外，還有各種干擾，如高頻隨機(jī)噪聲、基線漂移、樣品背景等，為了建立更加準(zhǔn)確、精度更高的模型，需要采用相應(yīng)的方法對光譜進(jìn)行處理^[22]。由于磨碎后的茶葉粉末顆粒大小、均勻性不同，光程無法保持恒定，一般選用多元信號修正（multip?l?i??c?ative signal correction，MSC）或標(biāo)準(zhǔn)正則變換

（standard normal variate，SNV）進(jìn)行處理。此外還可以選擇原始光譜，一階導(dǎo)數(shù)光譜（first deriv?at??ive，F(xiàn)D）或者二階導(dǎo)數(shù)（second derivative，SD）進(jìn)行光譜處理，一階導(dǎo)數(shù)光譜能顯示肩峰和吸收峰，而二階導(dǎo)數(shù)光譜可以找出兩者的準(zhǔn)確位置。近紅外光譜測定過程中，經(jīng)常出現(xiàn)光譜飄移，通過導(dǎo)數(shù)處理一方面可以消除基線偏移，還可以放大和分離重疊信息。但是在導(dǎo)數(shù)處理過程中，噪聲信號也被放大，因此，一般在積分處理前需要對光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行平滑處理。在TQ analyst 8.0軟件中平滑處理方法為SG（Savitzky-Golay）平滑法與ND（Norris-derivative）平滑法，經(jīng)過平滑處理后的光譜信噪比和穩(wěn)定性都有了提高。以相關(guān)系數(shù)（R）、校正均方差（RESEC）、預(yù)測均方差（RESEP）為評判指標(biāo)。R越接近1，白茶總黃酮含量的真實(shí)值和預(yù)測值越接近，相關(guān)性越好。RESEC和RESEP越接近0，則模型準(zhǔn)確性越好。

通過比較不同的光譜預(yù)處理方法，最終得到的光譜經(jīng)過SNV+SD+SG處理后建模效果最高，相關(guān)系數(shù)和校正均方差和驗(yàn)證均方差最接近最優(yōu)值，不同預(yù)處理的結(jié)果如表4所示。

2.4? 建模波段的選擇

不同光譜區(qū)所包含的信息不同，光譜范圍的選擇是建立模型較為重要的一步。在近紅外區(qū)域，光的散射效應(yīng)和吸收強(qiáng)度隨著波長而增加，而峰寬和穿透深度則相反，選擇最適合的光譜區(qū)域需要考察近紅外區(qū)域的光譜特征和白茶樣品的物理性質(zhì)等。由圖3可知，10 000～8 000 cm^–1光譜較為平滑，不同物質(zhì)在此波段吸收峰差異較小，包含的信息較少，而8 000～4 000 cm^–1區(qū)間內(nèi)近紅外光譜信息豐富，在此范圍內(nèi)有較多的可用價(jià)值。本研究采用SNV+SD+SG光譜預(yù)處理的方法建立模型，通過反復(fù)對比研究，以R和RESEC為參考內(nèi)容，最終選用8 000～4 000 cm^–1光譜區(qū)域進(jìn)行研究。

2.5? 主成分?jǐn)?shù)的選擇

主成分?jǐn)?shù)的選擇影響了模型的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性。本研究以交叉驗(yàn)證均方根誤差（RMSECV）為判別標(biāo)準(zhǔn)，通過表5可知，當(dāng)主成分?jǐn)?shù)為14時(shí)，RMSECV的數(shù)值達(dá)到最小值，即0.261 96。因此，在本研究中，選擇最優(yōu)的主成分?jǐn)?shù)為14。

2.6? 異常樣本的剔除

樣品光譜或測定數(shù)據(jù)與真實(shí)值偏差太多視為異常樣品，樣品值異?？赡転閷?shí)驗(yàn)方法不當(dāng)、樣品存儲不當(dāng)或操作過程出現(xiàn)失誤等原因?qū)е?。光譜異?？赡苁墙t外光譜儀異常、環(huán)境變動(dòng)和人為操作不當(dāng)?shù)仍驅(qū)е隆?/p>

91個(gè)白茶樣品的總黃酮含量最大值為8.86 mg/g，最小值為1.72 mg/g，范圍較廣，覆蓋了多年份、多等級的白茶，樣本具有較好的代表性。本研究采用Dixon檢驗(yàn)和光譜杠桿值與學(xué)生殘差T檢驗(yàn)的方法進(jìn)行異常樣本的剔除。

在化學(xué)計(jì)量學(xué)中，可以使用Dixon檢驗(yàn)法對事先不知道測定值的均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差，且測量得到的數(shù)據(jù)又服從正態(tài)分布的樣品集進(jìn)行異常樣品的剔除。首先，將原始光譜信息通過主成分分析，減少其內(nèi)部變量的含量（k<n），得到的新變量不僅保存了大部分原始信息且互不相關(guān)。通過主成分分析得到的k個(gè)新變量來計(jì)算實(shí)驗(yàn)樣品光譜的馬氏距離。樣品光譜與樣品集平均光譜之間的距離即為馬氏距離，將得到的馬氏距離通過Dixon檢驗(yàn)法進(jìn)行異常樣品的剔除。將樣本的馬氏距離按照從低到高的順序排列，圖4顯示并沒有異常樣品。