肖熙鷗　林文秋　李可　馮雪峰　李威　鄒華芬　金輝

摘 要 前期研究表明，茄子Enhanced disease susceptibility 1（SmEDS1）正調(diào)控茄子青枯病抗性，但是其抗病機(jī)理有待進(jìn)一步研究。為篩選SmEDS1的互作蛋白，本研究構(gòu)建pGBK7-SmEDS1誘餌載體，并利用酵母雙雜交技術(shù)對相應(yīng)的均一化cDNA酵母文庫進(jìn)行篩選。從2次獨立的實驗中篩選到9個克隆，其非冗余地編碼6種蛋白，即TCP轉(zhuǎn)錄因子、DNAJ分子伴侶、SnRK1蛋白α亞基、氰酸酯酶、CIP4蛋白和1個未知蛋白?；谶@些蛋白的功能，推測SmEDS1可能通過與本研究篩選到TCP轉(zhuǎn)錄因子互作調(diào)控水楊酸的合成，進(jìn)而調(diào)控茄子的青枯病抗性。

關(guān)鍵詞 茄子；EDS1；互作蛋白；青枯病

中圖分類號 S436.411 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

Abstract In our previous study， EDS1 of eggplant （SmEDS1） was found positively regulating the bacterial wilt resistance， but the resistance mechanism was not known. To screen the candidate interactors of SmEDS1， the bait protein vector of pGBK7-SmEDS1 was construct to screen the cDNA library by Y2H. The result showed that total nine clones were obtained by two independent experiments. The nine clones encode six proteins including TCP transcriptional factor， DNAJ molecular chaperone， cyanate hydratase， CONSTANS interacting protein 4 and an unknown protein. Based on the known function of the candidate protein， SmEDS1 interacted with the TCP， which regulating the synthesis of salicylic acid and finally regulating the bacterial resistance.

Keywords eggplant； EDS1； interacted protein； bacterial wilt

DOI 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.08.016

EDS1廣泛存在于植物中，已從多種植物中如擬南芥、水稻、大豆、葡萄等得到克隆[1]。已有的研究表明，EDS1具有保守的結(jié)構(gòu)域，其蛋白結(jié)構(gòu)可以明顯的分為N段的LP結(jié)構(gòu)域和C段的EP結(jié)構(gòu)域，并且LP和EP結(jié)構(gòu)域在EDS1與PAD4、SAG101等互作過程中發(fā)揮著重要的作用[1]。

EDS1在植物的抗病過程中發(fā)揮著重要的作用，是水楊酸抗病途徑中的重要因子，其能調(diào)控水楊酸合成基因ICS1和水楊酸下游信號基因的表達(dá)[2]。在已有的模型中，EDS1處于水楊酸合成的上游，然而其調(diào)控水楊酸合成機(jī)理尚不清晰[3]。在EDS1介導(dǎo)的抗病防衛(wèi)反應(yīng)中，EDS1主要通過與其他蛋白的互作來調(diào)控植物的抗病性。PAD4

是第一個被鑒定出與EDS1存在互作的蛋白[4]。EDS1通過與PAD4的互作激發(fā)植物的HR反應(yīng)進(jìn)而限制病原菌的繁殖[4-5]，并且越來越多的實驗證明，EDS1抗病功能的發(fā)揮必須要PAD4的參與[6-7]。同時EDS1還能夠與家族內(nèi)另一成員SAG101產(chǎn)生互作[1]，并且能夠形成EDS1-PAD4- SAG101三復(fù)合體[5]。PAD4、SAG101與EDS1的互作功能之一是通過調(diào)節(jié)EDS1在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中的分布平衡激活抗病相關(guān)基因的表達(dá)/生理過程[5]。除了能與PAD4、SAG101互作外，EDS1能夠與Avr直接互作，如AvrRps4、HoPA1[8-9]或者直接與RPS4、RPS6、SNC1等R蛋白互作，接受來自R蛋白的信號激活下游的抗病反應(yīng)[8-9]。

在前期研究中，我們克隆了茄子的SmEDS1，并且通過VIGS技術(shù)證明其正調(diào)控茄子的青枯病抗性[10]，然而其抗病機(jī)理未知。因此，本研究通過構(gòu)建pGBK7-SmEDS1誘餌載體，篩選我們前期構(gòu)建的感染青枯病病原菌R. solanacearum的茄子酵母雙雜交文庫[11]，以期獲得與SmEDS1互作的蛋白，為解析SmEDS1抗青枯病機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究使用Clotech公司的酵母雙雜交系統(tǒng)。誘餌載體為pGBK7載體。酵母雙雜交文庫為我們前期構(gòu)建的感染青枯病病原菌R. solanacearum的茄子酵母雙雜交文庫[11]。

1.2 方法

1.2.1 pGBK7-SmEDS1誘餌載體的構(gòu)建 根據(jù)SmEDS1的cDNA序列[10]分別在其兩端添加Sfi I的酶切位點序列設(shè)計引物，用于擴(kuò)增SmEDS1基因的cDNA片段，引物序列如下：SmEDS1-F：aaGGCC??ATTAC GGCCATGGTGAGAATAGGAG?AGGGTA；SmEDS1-R：ccGGCCGAGGCGGCC-CTAAATATTAATTCGCCCCGA。以cDNA為模板，利用全式金TransStart FastPfu DNA Polymerase克隆目的片段，并將其純化回收。將目的片段和pGBK7載體利用Sfi I（Fermentas 公司）酶切，然后切膠回收。將回收的目的片段和載體利用DNA Ligation Kit（TOYOBO公司）進(jìn)行連接，然后用熱激法轉(zhuǎn)化大腸桿菌，過夜培養(yǎng)。隨機(jī)挑取5個大腸桿菌轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR檢測，并對擴(kuò)增得到陽性條帶的克隆進(jìn)行質(zhì)粒抽提和測序。插入片段測序結(jié)果經(jīng)比對確認(rèn)正確后，進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.2.2 pGBK7-SmEDS1自激活檢測 pGBK7- SmEDS1自激活檢測參考Clotech的操作手冊。將載體按照表1的組合導(dǎo)入酵母AH109菌株中，進(jìn)行自激活檢測。

1.2.3 文庫篩選 文庫篩選參考Clotech的操作手冊。

1.2.4 互作蛋白生物信息學(xué)分析 將得到的克隆提取質(zhì)粒、測序。并將得到的數(shù)據(jù)在茄子基因數(shù)據(jù)庫（http：//eggplant. kazusa.or.jp/index.html）和NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 pGBK7-SmEDS1誘餌載體的構(gòu)建

PCR產(chǎn)物經(jīng)過電泳檢測得到約2 000 bp大小的片段（圖1）。將PCR產(chǎn)物直接進(jìn)行測序分析，確認(rèn)該片段為目的片段。將經(jīng)過過夜培養(yǎng)的菌落，

隨機(jī)挑選5個進(jìn)行PCR檢測。結(jié)果表明，5個菌落均有約2 000 bp大小的片段（圖2），為進(jìn)一步確認(rèn)載體是否構(gòu)建成功，挑取1號菌液提取質(zhì)粒進(jìn)行測序分析，測序結(jié)果表明pGBK7-SmEDS1誘餌載體構(gòu)建成功。

2.2 pGBK7-SmEDS1無自激活作用

pGBK7-SmEDS1，pGADT7-LargeT/pGBKT7- p53 和pGADT7-LargeT/pGBKT7-LaminC在SD-TL缺陷平板上都能正常生長，而僅有陽性對照（pGA- DT7-largeT+pGBKT7-p53）可在SD-TLHA缺陷平板生長（圖3）。pGBKT7-SmEDS1+pGADT7轉(zhuǎn)化子中隨機(jī)挑選的6個菌落在SD-TLHA缺陷平板上不能生長，生長狀態(tài)同陰性對照，LacZ檢測結(jié)果也與陰性對照相同。因此，研究結(jié)果表明pGBK7-SmEDS1無自激活作用。

2.3 互作蛋白分析

本研究第一次文庫篩選得到的5個初始陽性克隆中1、3和4號菌落能通過ADE2和HIS3報告基因的檢測，而2和5號菌落未能通過ADE2和HIS3報告基因檢測。而在第二次文庫篩選中得到了13個初始陽性克隆，12、13、15、16、17和18共6個菌落通過了ADE2和HIS3報告基因的檢測（圖4）。因此在本研究中，共得到了與SmEDS1互作的9個克隆。將9個克隆提取質(zhì)粒，進(jìn)行測序比對分析，共編碼6種蛋白（表2）。4、12和13號克隆分別各編碼一種蛋白，而1和3、15和18、16和17分別編碼一種蛋白。

3 討論

SmEDS1在茄子青枯病抗性中發(fā)揮著重要的作用。茄子感抗材料接種青枯病病原菌R.solanac-earum后，SmEDS1的表達(dá)量均上升，且其在抗病材料的表達(dá)量高于感病材料[12]。進(jìn)一步的研究表明，SmEDS1正調(diào)控茄子青枯病抗性，并且能夠影響水楊酸途徑中的其他信號基因的表達(dá)[10]。為進(jìn)一步研究其抗病機(jī)理，本研究利用酵母雙雜交手段篩選到6個與其互作的蛋白。

TCP是植物特有的轉(zhuǎn)錄因子，其在植物的抗病過程中發(fā)揮著重要的作用，其通過調(diào)控植物激素的合成來調(diào)控植物的抗病反應(yīng)。Aster Yellows分泌的SAP11能夠與AtTCP1和AtTCP2發(fā)生互作，并且降低AtTCP2、AtTCP4、AtTCP13、AtTCP3、AtTCP5、AtTCP10、AtTCP17和AtTCP24等8個基因的表達(dá)量，從而降低LOX2基因表達(dá)，最終抑制內(nèi)源JA的合成[13]，降低植物的抗病反應(yīng)。在AtTCP8與SA合成基因ICS1的啟動子直接結(jié)合，促進(jìn)內(nèi)源SA的合成，正調(diào)控擬南芥的抗性[14]。進(jìn)一步的研究表明，AtTCP8能與WRKY，NAC等轉(zhuǎn)錄因子互作，形成復(fù)合體與ICS1的啟動子結(jié)合，調(diào)控其表達(dá)[14]。其中WRKY正調(diào)控ICS1的表達(dá)，而NAC抑制ICS1的表達(dá)[15] 。因此，在不同的條件下，TCPs與不同的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，調(diào)控ICS1的表達(dá)，最終促進(jìn)或者抑制SA的合成。因此，我們推斷SmEDS1可能是通過與SmTCP互作調(diào)控水楊酸的合成，進(jìn)而調(diào)控茄子的青枯病抗性。

DNAJ是廣泛存在于植物細(xì)胞內(nèi)的一種分子伴侶，脅迫條件下它能夠保護(hù)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)等結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。李廣存等[16]從富集青枯病抗性相關(guān)基因的cDNA文庫中篩選到了DNAJ同源蛋白，并且證明該基因同時受青枯病菌的誘導(dǎo)和茉莉酸的調(diào)節(jié)，可能在青枯病菌和茉莉酸脅迫下具有促使脅迫損害細(xì)胞恢復(fù)活性的功能。在茄子受到R.solanacearum脅迫后，SmEDS1可能通過與DNAJ互作來保持蛋白質(zhì)的活性，進(jìn)而激發(fā)抗病反應(yīng)。

SnRK1通常是由具催化功能的α亞基、起調(diào)節(jié)作用的β亞基以及有活化功能的γ亞基組成的多聚體蛋白激酶[17]，在逆境條件下通過調(diào)節(jié)能量和脅迫信號響應(yīng)生物與非生物脅迫[18]。SnRKs能通過活性氧以及水楊酸信號途徑調(diào)控植物對生物脅迫的防衛(wèi)反應(yīng)[18]。已有的報道證明EDS1除了參與水楊酸抗病信號途徑外，還參與活性氧的抗病途徑[19]。本課題組的前期研究也證明了早期活性氧的迸發(fā)正調(diào)控茄子的青枯病抗性[20]。SmEDS與alpha subunit of SnRK1的互作是否參與了這個過程有待進(jìn)一步的研究。

基于上述討論，SmEDS1可能通過與本研究篩選的TCP的互作調(diào)控水楊酸的合成，進(jìn)而調(diào)控茄子的青枯病抗性。而SmDNAJ可能有助于保持SmEDS1的活性，SmSnRK1可能調(diào)控SmEDS1介導(dǎo)的水楊酸途徑和活性氧途徑的平衡。

參考文獻(xiàn)

[1] Wagner S， Stuttmann J， Rietz S， et al. Structural basis for signaling by exclusive EDS1 heteromeric complexes with SAG101 or PAD4 in plant innate immunity[J]. Cell Host & Microbe， 2013， 14（6）： 619-630.

[2] Cui H， Gobbato E， Kracher B， et al. A core function of EDS1 with PAD4 is to protect the salicylic acid defense sector in Arabidopsis immunity[J]. New Phytologist， 2017， 213（4）： 1 802-1 817.

[3] Koornneef A， Pieterse C E M. Cross talk in defense signaling[J]. Plant Physiology， 2008， 146（3）： 839-844.

[4] Feys B J， Moisan L J， Newman M A， et al. Direct interaction between the Arabidopsis disease resistance signaling proteins， EDS1 and PAD4[J]. The EMBO Journal， 2001， 20（19）： 5 400-5 411.

[5] Zhu S， Jeong R D， Venugopal S C， et al. SAG101 forms a ternary complex with EDS1 and PAD4 and is required for resistance signaling against turnip crinkle virus[J]. PLoS Pathogens， 2001， 7（11）： e1002318.

[6] Kim T H， Kunz H H， Bhattacharjee S， et al. Natural variation in small molecule-induced TIR-NB-LRR signaling induces root growth arrest via EDS1- and PAD4-complexed R protein VICTR in arabidopsis[J]. The Plant Cell， 2012， 24（12）： 5 177-5 192.

[7] Kohorn B D， Kohorn S L， Saba N J， et al. Requirement for pectin methyl esterase and preference for fragmented over native pectins for wall-associated kinase-activated， EDS1/PAD4-dependent stress response in Arabidopsis[J]. Journal of Biological Chemistry， 2014， 289（27）： 18 978-18 986.

[8] Bhattacharjee S， Halane M K， Kim S H， et al. Pathogen effectors target Arabidopsis EDS1 and alter its interactions with immune regulators[J]. Science， 2011， 334（6 061）： 1 405-1 408.

[9] Heidrich K， Wirthmueller L， Tasset C， et al. Arabidopsis EDS1 Connects Pathogen Effector Recognition to Cell Compartment-Specific Immune Responses[J]. Science， 2011， 334（6 061）： 1 401-1 404.

[10] 李 可， 肖熙鷗， 林文秋， 等. EDS1正調(diào)控茄子抗青枯病反應(yīng)[J]. 熱帶作物學(xué)報， 2018， 39（2）： 332-337.

[11] 肖熙鷗， 林文秋， 李 威， 等. 感染青枯病病原菌R.solanacearum的茄子酵母雙雜交文庫構(gòu)建及評價[J]. 北方園藝， 2016（21）： 102-105.

[12] 肖熙鷗， 李冠男， 曹必好， 等. 青枯病病菌對茄子相關(guān)防衛(wèi)信號基因表達(dá)及活性氧含量的影響[J]. 植物生理學(xué)報， 2012， 48（9）： 874-880.

[13] Sugi A， Kingdom H N， MacLean A M， et al. Phytoplasma protein effector SAP11 enhances insect vector reproduction by manipulating plant development and defense hormone biosynthesis[J]. PNAS， 2011， 108（48）： E1254-E1263.

[14] Wang X， Gao， J， Zhu Z， et al. TCP transcription factors are critical for the coordinated regulation of isochorismate synthase 1 expression in Arabidopsis thaliana[J]. Plant Journal， 2015， 82（1）： 151-162.

[15] Zheng X Y， Spivey N W， Zeng W， et al. Coronatine promotes Pseudomonas syringae virulence in plants by activating a signaling cascade that inhibits salicylic acid accumulation[J]. Cell Host & Microbe， 2012， 11（6）： 587-596.

[16] 李廣存， 金黎平， 王曉武， 等. cDNA文庫與RACE方法結(jié)合克隆馬鈴薯DnaJ-like基因全長cDNA[J]. 園藝學(xué)報， 2007， 34（3）： 649-654.

[17] Emanuelle S， Hossain M I， Moller I E， et al. SnRK1 from Arabidopsis thaliana is an atypical AMPK[J]. Plant Journal， 2015， 82（2）： 183-192.

[18] 張金飛， 李 霞， 謝寅峰. 植物SnRKs家族在脅迫信號通路中的調(diào)節(jié)作用[J]. 植物學(xué)報， 2017， 52（3）： 346-357.

[19] Straus M R， Rietz S， Ver Loren van Themaat E， et al. Salicylic acid antagonism of EDS1-driven cell death is important for immune and oxidative stress responses in Arabidopsis[J]. The Plant Journal， 2010， 62（4）： 628-640.

[20] Xiao X O， Lin W Q， Li K， et al. Early burst of reactive oxygen species positively regulates resistance of eggplant against bacterial wilt[J]. Journal of Phytopathol， 2017， 165： 652-661.