楊翠萍　胡進(jìn)　閆冰玉　鞏笑笑　譚玉榮　高璇　王丹　張恒　劉進(jìn)平

摘 要 利用轉(zhuǎn)錄組文庫中的PRR7基因序列，從文心蘭盛開期花瓣中擴(kuò)增得到文心蘭PRR7基因的2個(gè)成員，分別命名為OnPRR7-1（GenBank登錄號(hào)：MG543993）和OnPRR7-2（GenBank登錄號(hào)：MG543994）。OnPRR7-1和OnPRR7-2基因全長分別為2 091 bp和2 154 bp，分別編碼696和717個(gè)氨基酸大小的蛋白質(zhì)序列。蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)分析表明，OnPRR7-1和OnPRR7-2均為疏水性蛋白。BlastX比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育分析表明，OnPRR7-1和OnPRR7-2基因和鐵皮石斛和小蘭嶼蝴蝶蘭的PRR基因同源性比較高。實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析結(jié)果表明，OnPRR7-1和OnPRR7-2基因均呈現(xiàn)晝夜節(jié)律性表達(dá)格式，并且在正午12點(diǎn)時(shí)表達(dá)量達(dá)到峰值；在花發(fā)育和衰老過程中，OnPRR7-1和OnPRR7-2基因在花瓣中的表達(dá)量均在綻口期和衰老初期達(dá)到峰值，表明其有可能在花發(fā)育的開花和花衰老的過程中發(fā)揮作用。

關(guān)鍵詞 文心蘭；生物鐘；PRR7基因；表達(dá)分析；開花；花衰老

中圖分類號(hào) S682.31 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract Two members of Oncidium PRR7 gene family， OnPRR7-1 and OnPRR7-2， were isolated from the petals of the full-opened flowers based on the predicted PRR7 gene sequence through transcriptome analysis. The full-length of OnPRR7-1 and OnPRR7-2 was 2 091 bp and 2 154 bp in length， encoding peptides with 696 and 717 amino acids， respectively. Secondary structure modeling showed that these proteins were hydrophobic. BLASTX alignment and phylogenetic analysis showed that the OnPRR7-1 and OnPRR7-2 had high homology with the the counterparts of Dendrobium officinale and Phalaenopsis equestris. Real-time fluorescence quantitative PCR analysis showed that OnPRR7-1 and OnPRR7-2 genes both had a circadian expression pattern， with the expression levels peaked at 12：00 within 24 hours. During the flower development and senescence， the expression levels of OnPRR7-1 and OnPRR7-2 in petals reached the peak at the bud burst stage and the initial stage of senescence， suggesting that they play a role in flowering and flower senescence in Oncidium.

Keywords Oncidium； circadian clock； PRR7 gene； expression analysis； flowering； flower senescence

DOI 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.08.015

生物鐘（circadian clock）是生物體內(nèi)一種內(nèi)在計(jì)時(shí)機(jī)制，是生物體對(duì)地球光照和溫度等環(huán)境因子晝夜周期變化長期適應(yīng)而演化產(chǎn)生的適應(yīng)機(jī)制[1-4]。在植物體中，可以使體內(nèi)生物學(xué)過程與體

外的晝夜和季節(jié)條件變化同步化，從而調(diào)控新陳代謝活動(dòng)并在最有利的晝夜和季節(jié)時(shí)間來分配資源[5]。生物鐘對(duì)于植物的生長、發(fā)育、生殖和脅迫反應(yīng)都有調(diào)控作用[1-5]。在生物鐘系統(tǒng)核心為一套復(fù)雜的、環(huán)環(huán)相扣的轉(zhuǎn)錄和翻譯反饋環(huán)路組成。生物鐘核心振蕩器由3個(gè)循環(huán)組成：中心循環(huán)、早晨循環(huán)、傍晚循環(huán)[2]。其中PRRs（pseudo- response regulators）為植物轉(zhuǎn)錄/翻譯晝夜節(jié)律網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵成分，在生物鐘系統(tǒng)中的中央振蕩器和生物鐘輸出過程起著至關(guān)重要的調(diào)控作用[6]。

目前擬南芥中發(fā)現(xiàn)參與生物鐘調(diào)控的PRRs共有5個(gè)，分別是PRR1/TOC1、PRR3、PRR5、PRR7和PRR9[1-2]。擬南芥中PRR家族成員在一天里表達(dá)峰值按照PRR9、PRR7、PRR5、PRR3、PRR1的順序依次出現(xiàn)，間隔2～3 h。其中PRR9出現(xiàn)在黎明，而PRR1表達(dá)峰值出現(xiàn)在傍晚[7]。這5個(gè)成員因?yàn)榕c原核生物的磷酸化和脫磷酸化雙元信號(hào)系統(tǒng)的受體RR（response regulator）有很高的同源性而被命名為PRRs家族。PRRs基因均具有兩個(gè)保守的結(jié)構(gòu)域，分別是氨基端的RLD（receiver-like domain）結(jié)構(gòu)域和羧基端CCT（CONSTANS/CONSTANS-LIKE/TOC1）結(jié)構(gòu)域[8-10]。目前，除在模式植物擬南芥和水稻中PRR基因研究較為充分外，在少數(shù)重要作物如玉米、高粱、大麥、小麥和甜菜等也有少數(shù)的研究，但尚未見到在觀賞園藝植物上相關(guān)基因研究的報(bào)道[11]。

對(duì)于PRR7基因的研究不多，但是先前有研究表明 PRR7-β-葡糖醛酸糖苷酶融合蛋白定位于細(xì)胞核，意味著其可能在調(diào)控光敏基因表達(dá)中起作用，并經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)PRR7可作為光敏色素調(diào)節(jié)的基因表達(dá)中信號(hào)傳導(dǎo)的中間體，負(fù)責(zé)響應(yīng)于光的幼苗的消長和生物鐘的階段[12]。擬南芥的生物鐘是由一系列的互鎖反饋循環(huán)環(huán)組成，PRR7和PRR9在早上循環(huán)環(huán)中起作用；經(jīng)prr7/prr9雙突變體研究發(fā)現(xiàn)，PRR7和PRR9在調(diào)節(jié)CCA1和LHY響應(yīng)環(huán)境溫度的活動(dòng)中發(fā)揮作用[13]。

文心蘭（Oncidium）屬于蘭科文心蘭屬植物，又名舞女蘭、金蝶蘭等，是世界上重要的切花品種，具有極其重要的觀賞價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值[14-15]。栽培的文心蘭切花品種以黃色花南茜種（Oncidium Gower Ramsey）及其變異種為主[14-15]。海南大學(xué)熱帶農(nóng)林學(xué)院劉進(jìn)平課題組研究表明，文心蘭花發(fā)育可根據(jù)其形態(tài)特征明確分期，是一種很好的花發(fā)育和衰老的研究系統(tǒng)[16-18]。此前劉進(jìn)平課題組已從文心蘭中克隆和鑒定出一系列跟花發(fā)育和衰老相關(guān)的基因[19-23]。植物能精確地控制其開花時(shí)間，以確保其能成功地進(jìn)行繁殖。開花時(shí)間的季節(jié)控制的一個(gè)重要因素是光周期，而日照時(shí)長由體內(nèi)生物鐘所測(cè)量的。因此，生物鐘對(duì)光周期反應(yīng)和植物開花具有重要的調(diào)控作用[24-25]。我們最近的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究表明，生物鐘基因PRR7基因可能還參與了花瓣衰老的啟動(dòng)調(diào)控。

本研究利用轉(zhuǎn)錄組分析所獲得的序列，克隆到生物鐘相關(guān)基因PRR7，并利用生物信息學(xué)方法分析了該基因推定的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，利用序列比對(duì)構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹，并研究了PRR7基因晝夜節(jié)律性表達(dá)及在文心蘭切花發(fā)育和衰老過程中在花瓣中的基因表達(dá)格式。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所用材料為文心蘭南茜種‘黃金3 代（Oncidium Gower Ramsey ‘Gold 3）鮮切花。購自海南出入境檢驗(yàn)檢疫局熱帶植物隔離檢疫中心。

1.2 方法

1.2.1 文心蘭花瓣總RNA的提取及cDNA第一鏈的合成 取2～3個(gè)文心蘭花瓣于預(yù)冷的研缽中，在液氮環(huán)境下充分研磨成粉末狀，之后用通用植物總RNA提取試劑盒（離心柱型，購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司）提取RNA。用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA完整性，并且測(cè)量RNA的濃度。獲得高質(zhì)量RNA后，按照PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒（購自TaKaRa公司）說明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，合成cDNA第一鏈。

1.2.2 文心蘭PRR7基因的克隆 利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序得到的差異表達(dá)基因PRR7序列片段，用NCBI的Conserved Domains（https：//www.ncbi.nlm.nih.

gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析，然后用NCBI的ORFfinder（https：//www.ncbi. nlm. nih.gov/orffinder/）分析序列的開放閱讀框，并根據(jù)ORF兩端設(shè)計(jì)上下游引物PRR7-F和PRR7-R（表1），克隆PRR7基因的ORF序列。PCR反應(yīng)體系如下：TaKaRa LA Taq 0.5 ?L，10× LA Taq Buffer 5 ?L，dNTPs 8 ?L，cDNA 1 ?L，上下游引物各0.5 ?L，滅菌蒸餾水 34.5 ?L。PCR程序如下：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min 15 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，然后用OMEGA Gel Extraction Kit（購自TaKaRa公司）進(jìn)行膠回收，回收目的片段，之后連接到pMD-19T載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，過夜培養(yǎng)，進(jìn)行菌落PCR鑒定，獲得陽性克隆后送上海英濰捷基生物公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3 PRR7-1和PRR7-2基因生物信息學(xué)分析 利用NCBI的ORFfinder進(jìn)行ORF和編碼氨基酸序列預(yù)測(cè)；用ExPASy在線分析軟件（https：//www.expasy.org/vg/index/Protein）進(jìn)行蛋白質(zhì)理化性質(zhì)的預(yù)測(cè)，包括蛋白質(zhì)等電點(diǎn)和相對(duì)分子質(zhì)量和蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)（SOPMA & CoILS），用Swiss-model（https：//swissmodel. expasy.org）預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)，使用TMHMM Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/ TMHMM/）進(jìn)行跨膜預(yù)測(cè)，使用DNAMAN軟件進(jìn)行氨基酸序列的多重比對(duì)，并且使用MEGA 6.0軟件構(gòu)建NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.4 文心蘭PRR7基因的節(jié)律性表達(dá)分析以及在花發(fā)育過程中的表達(dá)分析 文心蘭PRR7基因的節(jié)律性表達(dá)分析取樣方法為：首先將購買的100枝文心蘭鮮切花在12 h光照和12 h黑暗（12L：12D），預(yù)處理2～3 d，然后每隔2 h采樣，總共采樣時(shí)間48 h；文心蘭PRR7基因在花發(fā)育過程中的表達(dá)分析取樣方法為早上8點(diǎn)采集分別處于花苞期、綻口期、半開放期、盛開前期、盛開期、衰老初期、衰老期和脫落干枯期8個(gè)階段的文心蘭花瓣。采用1.2.1節(jié)中的方法進(jìn)行花瓣總RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。用Actin檢測(cè)基因?qū)Ψ崔D(zhuǎn)錄得到的cDNA進(jìn)行質(zhì)量的檢測(cè)，Actin基因作為內(nèi)參。所用引物序列見表1。Q-PCR表達(dá)分析的反應(yīng)體系如下：SYBR Primix TaqTM 10 ?L，cDNA模板 2 ?L，ddH2O 6.6 ?L，DyeII 0.4 ?L，上下游引物各0.5 ?L。每個(gè)不同來源的模板都進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)實(shí)驗(yàn)。PCR程序如下：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 20 s，40個(gè)循環(huán)。最后采用2–ΔΔCt法進(jìn)行目的基因的表達(dá)量分析。

1.2.5 文心蘭PRR7-1和PRR7-2基因差異驗(yàn)證 考慮到兩個(gè)基因僅存在60 bp左右堿基的明顯差異，所以Q-PCR對(duì)這兩個(gè)基因進(jìn)行區(qū)分驗(yàn)證時(shí)采用相同的下游引物PRR7-R-Q，而上游引物PRR7-1-F-Q是在差異序列之前區(qū)域設(shè)計(jì)的引物，上游引物PRR7-2-F-Q則是在差異序列區(qū)域設(shè)計(jì)的引物；以PRR7-1和PRR7-2為模板，以Q-PCR設(shè)計(jì)的引物PRR7-1-F-Q和PRR7-R-Q，及PRR7-2-F-Q和PRR7-R-Q為引物分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，觀察擴(kuò)增產(chǎn)物的異同。

2 結(jié)果與分析

2.1 文心蘭PRR7基因cDNA的克隆

以文心蘭花盛開前期的花瓣RNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的cDNA為模板，PCR擴(kuò)增得到兩條2 000 bp左右的條帶（圖1），分別命名為OnPRR7-1（GenBank登錄號(hào)：MG543993）和OnPRR7-2（GenBank登錄號(hào)：MG543994）。

2.2 文心蘭OnPRR7-1和OnPRR7-2差異序列驗(yàn)證

OnPRR7-2序列中間部分有60 bp左右的序列與OnPRR7-1序列差異比較大，因此使用設(shè)計(jì)的Q-PCR引物OnPRR7-1-F-Q與OnPRR7-R-Q，及OnPRR7-2-F-Q與OnPRR7-R-Q對(duì)2個(gè)基因進(jìn)行驗(yàn)證.其中OnPRR7-2-F-Q引物是根據(jù)差異序列設(shè)計(jì)的引物，擴(kuò)增結(jié)果如圖2所示。圖2中泳道1為以O(shè)nPRR7-1為模板，以O(shè)nPRR7-2-F-Q和OnPRR7-R-Q為引物的擴(kuò)增結(jié)果；泳道2為以

OnPRR7-1為模板，以O(shè)nPRR7-1-F-Q和OnPRR7- R-Q為引物的擴(kuò)增產(chǎn)物，產(chǎn)物大小76 bp；泳道3為以O(shè)nPRR7-2為模板，以O(shè)nPRR7-2-F和OnPRR7-R為引物的擴(kuò)增產(chǎn)物，產(chǎn)物大小89 bp；泳道4為以O(shè)nPRR7-2為模板，以O(shè)nPRR7-1-F-Q和OnPRR7-R-Q為引物的擴(kuò)增產(chǎn)物，產(chǎn)物大小為118 bp。結(jié)果表明OnPRR7-1和OnPRR7-2相似性很高但是也存在差異，說明是2個(gè)不同的序列。

2.3 文心蘭OnPRR7-1和OnPRR7-2基因的生物信息學(xué)分析

測(cè)序表明OnPRR7-1和OnPRR7-2存在很小的差異，其中OnPRR7-2比OnPRR7-1多60 bp左右的核苷酸序列。理化性質(zhì)分析表明，OnPRR7-1編碼的蛋白分子式為C3246H5190N1010O1064S28，分子量76 286.72，等電點(diǎn)是7.92，經(jīng)預(yù)測(cè)該蛋白是一種不穩(wěn)定蛋白。在氨基酸組成上是負(fù)電荷殘基（Asp+Glu）總數(shù)為80個(gè)，正電荷殘基（Arg+Lys）總數(shù)為82個(gè)。OnPRR7-1蛋白是一種親水性蛋白，經(jīng)跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)可知，OnPRR7-1蛋白沒有明顯的跨膜結(jié)構(gòu)域，因此它可能不是膜蛋白。OnPRR7-2編碼的蛋白分子式為C3338H5341N1039O1098S27，分子量為78 462.05，等電點(diǎn)是8.13，經(jīng)預(yù)測(cè)該蛋白也是一種不穩(wěn)定的蛋白。在氨基酸組成上，負(fù)電荷殘基（Asp+Glu）總數(shù)為81個(gè)，正電荷殘基（Arg+Lys）總數(shù)為84個(gè)，OnPRR7-2同樣也是一種疏水性蛋白。經(jīng)跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)，該蛋白同樣沒有明顯的跨膜結(jié)構(gòu)，因此也不是膜蛋白。測(cè)序結(jié)果顯示，OnPRR7-1和OnPRR7-2的cDNA片段分別為2 091 bp和2 154 bp。以NCBI上的ORF開放閱讀框在線分析可知，OnPRR7-1和OnPRR7-2分別編碼696個(gè)氨基酸（圖3）和717個(gè)氨基酸（圖4）。

經(jīng)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)可知，OnPRR7-1編碼的蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)主要包含28.30% α螺旋，16.95% β片層，47.13%無規(guī)則卷曲；OnPRR7-2編碼的蛋白主要包含27.34% α螺旋，17.29% β片層，46.86%無規(guī)則卷曲；其中均是以無規(guī)則卷曲含量最多。用Swiss-model分析OnPRR7-1的三級(jí)結(jié)構(gòu)（圖5）和OnPRR7-2蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)（圖6），結(jié)果顯示2個(gè)基因表達(dá)的蛋白均與一種趨化蛋白CheY有25%左右的相似性，相似度并不高。

用DNAMAN將OnPRR7-1和OnPRR7-2蛋白的氨基酸序列與其他9個(gè)物種的PRR7蛋白氨基酸序列進(jìn)行同源序列比對(duì)，比對(duì)結(jié)果如圖7所示。其他9個(gè)物種的蛋白分別是：海棗PRR37（Phoenix dactylifera，XP_008789022.1）、菡萏PRR37（Nelumbo nucifera，XP_010253458.1）、葡萄PRR37（Vitis vinifera，XP_010658157.1）、油棕PRR37（Elaeis guineensis，XP_010920961.1）、蓖麻PRR37（Ricinus communis，XP_01557-838?0.1）、鳳梨PRR37（Ananas comosus，XP_020?10???8?3???7???8.1）、巴旦木APRR7（Prunus persica，XP_0?20?4?2??3049.1）、小蘭嶼蝴蝶蘭PRR73（Phalaenopsis e?q????ue?stris，XP_020600189.1）和鐵皮石斛PRR73（D?e?n??drob??ium catenatum，XP_020692445.1）。比對(duì)結(jié)果顯示，分析的10個(gè)物種的氨基酸序列均在N末端有非常保守的RLD結(jié)構(gòu)域，C末端有非常保守的CCT結(jié)構(gòu)域。

2.4 OnPRR7-1和OnPRR7-2蛋白系統(tǒng)進(jìn)化分析

為研究OnPRR7-1和OnPRR7-2蛋白的進(jìn)化關(guān)系，用MEGA 6.0軟件將OnPRR7-1和OnPRR7-2

及其同源的其他植物的PRR調(diào)控因子構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖8）。共同構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹的其他PRR調(diào)控因子分別是：巴旦木APRR7（Prunus? persica XP_020423049.1）、花生APRR7（Arachis ??????ipaensis XP_016183324.1）、苦瓜APRR7（Momordica charantia XP_022143922.1）、榴蓮APRR7（Durio zibethinus XP_022745742.1）、菡萏PRR3/7（Nelumbo nucifera XP_01025345?8.1）、桑樹PRR（Morus notabilis XP_01011231?8.1）??、番茄PRR3/7（Solanum lycopersicum XP_0??04237??533.1）、葡萄PRR3/7（Vitis vinifera XP_010658157.1）、蓖麻PRR3/7（Ricinus communis XP_015578380.1）、棗PRR3/7（Ziziphus jujuba XP_015877113.1）、大桉PRR3/7（Eucalyptus grandis XP_010067243.1）、可可子PRR3/7（Theobroma ?cacao XP_007009669.2）、鐵皮石斛PRR7/3（Dendrobium catenatum XP_0206924?45.1）、小蘭嶼蝴蝶蘭PRR7/3（Phalaenopsis equestris XP_02060?0189.1）、野生稻PRR7/3（Oryza brachyantha XP_00?664???9884.1）、玉米 PRR7/3（Zeas ACG24234.1）、鳳梨PRR3/7（Ananas comosus XP_020108378.1）、石刁柏PRR7/3（As?par?agus officinalis XP_020271482.1）、茳芏PR?R7/3?（Musa acuminata subsp.malaccensis XP_0?09??3865?43.1）、海棗PRR3/7（Phoenix dactylifera XP_008789022.1）、油棕PRR3/7（Elaeis guineensis XP_010920961.1）、擬南芥PRRs（Ara?bid?op??sis thaliana AED97278.1、AED90520.1、AEC10754.1、BAB13743.1、OAO90?757.1）水稻PRRs（Oryza sativa Indica BAD388?59.1、BAD388?58.1；Oryza sativa Japonica BAD?38856.1、BA?D?388?55.1）、小立碗蘚（Physcomitrella patens BAJ83829.1、BAJ83828.1、BAJ83827.1、BAJ83826.1、BAI39993.1）、鐵皮石斛PRR1（Dendrobium catenatum PKU76118.1）、深圳擬蘭（Apostasia shenzhenica PKA66208.1）和作為外族的巴西安白僵菌PRR1（Beauveria bassiana PMB67668.1）。分析結(jié)果表明，OnPRR7-1和OnPRR7-2與同為蘭科植物的鐵皮石斛和小蘭嶼蝴蝶蘭的PRR7/3親緣關(guān)系最近，并且系統(tǒng)發(fā)育樹的分支表明，雙子葉植物綱和單子葉植物綱的PRR蛋白分別分支成了上下兩組。

2.5 OnPRR7-1和OnPRR7-2基因表達(dá)分析

通過Q-PCR可知，在連續(xù)的12L：12D處理下的48 h中OnPRR7-1和OnPRR7-2基因表達(dá)變化情況如圖9所示。分析可知，OnPRR7-1和OnPRR7-2基因在2個(gè)連續(xù)的周期內(nèi)呈現(xiàn)節(jié)律性表達(dá)，在12L：12D條件下，2個(gè)基因的表達(dá)峰值出現(xiàn)在光照后的4 h（上午10：00），谷值出現(xiàn)在光照前的4 h（凌晨2：00）左右。

在文心蘭花發(fā)育的8個(gè)時(shí)期（花苞期A、綻口期B、半開放期C、盛開前期D、盛開期E、衰老初期F、衰老期G和脫落干枯期H）中，OnPRR7-1和OnPRR7-2基因表達(dá)情況如圖10所示。該基因在綻口期（B）和衰老初期（F）時(shí)期表達(dá)量達(dá)到高峰值，而在盛開前期（D）和脫落干枯期（H）表達(dá)達(dá)到低峰值。

3 討論

本研究克隆得到2個(gè)文心蘭PRR7基因：OnPRR7-1和OnPRR7-2基因，這2個(gè)PRR7基因成員的核苷酸序列僅有60 bp左右差異。序列比對(duì)表明它們與其他物種PRR基因氨基酸序列均在N端或C端有非常保守的RLD和CCT結(jié)構(gòu)域。文心蘭PRR7基因存在2個(gè)成員的現(xiàn)象和小立碗蘚及水稻情況類似。小立碗蘚PRR7存在編碼不同的氨基酸序列的兩個(gè)成員PRR7a和PRR7b[26]，水稻粳稻和秈稻中也具有序列不同的兩基因成員PRR73和PRR37 [27]，但擬南芥中只有一個(gè)PRR7基因，這可能是由于在進(jìn)化過程中基因含量和序列發(fā)生變化所致。OnPRR7-1和OnPRR7-2基因含有RLD和CCT保守結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列，這與其他物種的PRRs家族基因編碼的氨基酸序列保守結(jié)構(gòu)域相一致，但中間序列則差異較大。PRRs被定義為是包含有2個(gè)保守域的蛋白質(zhì)，這2個(gè)結(jié)構(gòu)域被1個(gè)不太保守的“可變”域分隔[8， 28]。因此，本研究克隆的2個(gè)文心蘭基因?qū)儆赑RR基因家族。發(fā)育樹的分支表明，雙子葉植物綱和單子葉植物綱的PRR蛋白分別形成親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的兩組，而OnPRR7-1和OnPRR7-2與同為蘭科植物的鐵皮石斛和小蘭嶼蝴蝶蘭的PRR7/3親緣關(guān)系最近。顯然文心蘭PRR基因在進(jìn)化上也與其他物種的同族基因一樣具有保守性[29-30]。

表達(dá)分析表明，OnPRR7-1和OnPRR7-2基因在文心蘭花瓣中呈現(xiàn)連續(xù)的晝夜循環(huán)表達(dá)。在12L：12D光照黑暗循環(huán)處理下，OnPRR7-1和OnPRR7-2基因呈現(xiàn)節(jié)律性表達(dá)，和之前研究的擬南芥和菁蕪菁PRRs基因的表達(dá)模式相一致[31-32]。擬南芥PRR7與PRR9和PRR5通過對(duì)CCA1和LHY啟動(dòng)子的阻遏活性而在生物鐘反饋環(huán)路中發(fā)揮功能[7]，PRR7本身也通過轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后機(jī)制而受到調(diào)控[33]。有研究表明擬南芥PRR7與PRR9和PRR5一起通過CONSTANS依賴性途徑控制開花時(shí)間[34]。本研究中，OnPRR7-1和OnPRR7-2基因在文心蘭花發(fā)育和花衰老過程中呈現(xiàn)雙峰表達(dá)模式，表達(dá)量分別在綻口期（B）和衰老初期（F）達(dá)到高峰值，而在兩峰之間的盛開前期（D）處于低峰。OnPRR7-1和OnPRR7-2基因這種表達(dá)模式，表明它們有可能在花發(fā)育的開花和花衰老的過程中發(fā)揮作用，但仍待進(jìn)一步證實(shí)。

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