應(yīng)東山 唐浩 韓瑞璽 王文林 王明 王琴飛 湯秀華 張如蓮

摘? 要? 利用轉(zhuǎn)錄測(cè)序技術(shù)，開發(fā)油梨表達(dá)序列標(biāo)簽-簡(jiǎn)單重復(fù)序列（EST-SSRs），為SSR標(biāo)記在油梨種質(zhì)資源鑒定、品種選育及遺傳連鎖圖譜構(gòu)建奠定基礎(chǔ)。采用Illumina二代測(cè)序的技術(shù)，共獲得37 639條無(wú)冗余的序列，對(duì)其進(jìn)行SSR搜索，共獲得6 419條簡(jiǎn)單序列重復(fù)（SSR）。利用Primer 3.0軟件設(shè)計(jì)SSR引物，并以11份油梨種質(zhì)篩選多態(tài)性引物?；谵D(zhuǎn)錄組序列開發(fā)出的EST-SSR的分布頻率為17.05%。在油梨EST-SSR中，單核苷、二核苷和三核苷的重復(fù)占主導(dǎo)，占總數(shù)的99.07%。單、二、三核苷酸重復(fù)單元分別占總SSR的37.47%、31.80%和29.80%;出現(xiàn)頻率最高的二核苷酸重復(fù)基元是AG/CT，占總數(shù)的29.15%，出現(xiàn)最高的三核苷酸重復(fù)基元為AAG/CTT，占12.01%。隨機(jī)選擇315個(gè)SSR位點(diǎn)合成引物，經(jīng)11份油梨種質(zhì)篩選鑒定，227對(duì)引物可擴(kuò)增獲得產(chǎn)物，有效擴(kuò)增率為72.06%;其中34對(duì)引物表現(xiàn)出良好多態(tài)性，占有效引物的12.78%，占總引物的10.79%。在34對(duì)多態(tài)性引物中，每對(duì)引物擴(kuò)增等位基因數(shù)2～12個(gè)。利用高通量測(cè)序開發(fā)SSR 引物有較好的實(shí)用性，開發(fā)獲得的34個(gè)具有多態(tài)性的油梨SSR標(biāo)記可用于研究油梨及其相關(guān)近緣物種的遺傳變異。

關(guān)鍵詞? 油梨;轉(zhuǎn)錄組;EST-SSR;引物中圖分類號(hào)? S31 ?????文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼? A

DOI10.3969/j.issn.1000-2561.2018.12.017

油梨（2n=24，Persea americanaMill.）是樟科（Lauraceae）油梨屬常綠喬木果樹，富含脂肪、熱能高，故有“森林黃油”之美稱，是重要的熱帶果樹之一。油梨起源于中美洲地區(qū)，目前在美國(guó)、危地馬拉、墨西哥及古巴等地區(qū)栽培最多，也是最早在中美洲商業(yè)化的水果之一^[1]。油梨早在公元前500年就在墨西哥栽培種植^[2]，在其主產(chǎn)區(qū)危地馬拉、墨西哥及非洲一些國(guó)家，人們把油梨作為主食達(dá)半年以上，因而油梨具有良好的社會(huì)效益，同時(shí)，因其四季常綠、樹姿優(yōu)美，也可作優(yōu)良的綠化樹種。目前所有的油梨栽培品種都屬于P.americana種，有4個(gè)亞小種，俗稱墨西哥系、西印度系和危地馬拉系，另外還有一個(gè)雜交種系^[3]。

近年來(lái)，隨著生物技術(shù)的快速發(fā)展，利用高通量測(cè)序技術(shù)開發(fā)油梨分子標(biāo)記優(yōu)勢(shì)明顯，由于不存在物種選擇性、測(cè)序靈敏度高、無(wú)需特異性探針等，特別是對(duì)尚未公布基因組測(cè)序信息的物種，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序能夠快速高效地呈現(xiàn)出覆蓋面廣、準(zhǔn)確度高的信息，而成為SSR、SNP等分子標(biāo)記開發(fā)的良好工具，被廣泛應(yīng)用于植物的遺傳育種、種質(zhì)資源保護(hù)和開發(fā)等領(lǐng)域。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序主要有以下五點(diǎn)優(yōu)勢(shì)：①包容性廣，不受限制;②分辨率高，結(jié)果準(zhǔn)確度好，不易受傳統(tǒng)技術(shù)問(wèn)題干擾;③靈敏度高;④測(cè)序通量高，單次檢測(cè)上百億個(gè)堿基序列;⑤重復(fù)性好，無(wú)需技術(shù)重復(fù)。在已完成基因組測(cè)序的作物上，其轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得的原始數(shù)據(jù)與基因組序列進(jìn)行比對(duì)，能快速尋找差異基因^[4-7]。目前，利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序開發(fā)SSR標(biāo)記已廣泛應(yīng)用于其他植物^[8-12]。王明等^[13]利用454高通量測(cè)序技術(shù)開發(fā)獲得8 831條芒果SSR。李淑斌等^[14]利用草莓基因組序列高通量開發(fā)月季SSR標(biāo)記，共識(shí)別49 029個(gè)SSR位點(diǎn)，成功對(duì)21 288個(gè)SSR位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物。戴亞平^[7]利用Illumina轉(zhuǎn)錄組測(cè)序開發(fā)短絲木犀SSR，成功設(shè)計(jì)2 366對(duì)引物。魏明明^[15]利用Illumina開發(fā)茄子858對(duì)SSR分子標(biāo)記。鄭紀(jì)偉^[16]利用柳樹轉(zhuǎn)錄組高通量測(cè)序開發(fā)SSR標(biāo)記，分別在垂柳和簸箕柳中成功設(shè)計(jì)459和729對(duì)引物。綜上所述，基于高通量的SSR標(biāo)記開發(fā)在多種植物的研究已經(jīng)取得了巨大進(jìn)展，可以應(yīng)用于熱帶果樹，而熱帶果樹油梨的分子標(biāo)記開發(fā)和利用研究還比較少，目前只有有限數(shù)量的SSR可用于油梨遺傳多樣性分析。Ashworth等^[17]通過(guò)Hass油梨品種的2個(gè)基因組DNA文庫(kù)來(lái)構(gòu)建開發(fā)了25對(duì)SSR引物。Borrone等^[18]通過(guò)對(duì)已經(jīng)發(fā)表的油梨表達(dá)序列標(biāo)簽數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行微衛(wèi)星序列篩選，開發(fā)出70對(duì)微衛(wèi)星序列引物。Gross-German等^[19]利用構(gòu)建油梨基因組小片段SSR富集文庫(kù)和已知EST序列庫(kù)開發(fā)47個(gè)新的油梨SSR標(biāo)記，多態(tài)性較好的40個(gè)SSR（其中25個(gè)SSR和15個(gè)EST-SSR）。利用高通量技術(shù)開發(fā)新的油梨SSR分子標(biāo)記在國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)中未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。

本研究利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)，開發(fā)油梨表達(dá)序列標(biāo)簽-簡(jiǎn)單重復(fù)序列（EST-SSRs），以期為中國(guó)油梨種質(zhì)資源進(jìn)行系統(tǒng)的遺傳研究和構(gòu)建油梨遺傳圖譜，以及在選育新品種和改良栽培品種上挖掘優(yōu)異的基因資源，培育抗性強(qiáng)、高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)的油梨品種等研究奠定基礎(chǔ)。

1? 材料與方法

1.1? 材料

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序樣本來(lái)自海南大學(xué)油梨種質(zhì)圃的Hass嫩葉，液氮速凍后送派森諾生物科技股份有限公司（上海）進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組Illumina NextSeq500測(cè)序。

遺傳多樣性研究使用的11份油梨樣本（表1），來(lái)自廣西亞熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所油梨種質(zhì)資源圃和海南大學(xué)油梨種質(zhì)圃。

1.2? DNA提取

實(shí)驗(yàn)采用十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）法提取基因組DNA^[20]。

1.3? EST序列來(lái)源、SSR檢測(cè)及SSR引物設(shè)計(jì)

本研究涉及的油梨EST序列來(lái)源于實(shí)驗(yàn)室將HASS葉片樣品送派森諾公司轉(zhuǎn)錄組測(cè)序所得，并利用MISA軟件對(duì)所有測(cè)序所得的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行檢測(cè)、篩選與分析SSR，最終確定SSR 位點(diǎn)。根據(jù)SSR搜索標(biāo)準(zhǔn)，將一、二、三、四、五和六核苷酸的最少重復(fù)次數(shù)的篩選標(biāo)準(zhǔn)分別設(shè)置為10、6、5、5、5、5，同時(shí)搜索復(fù)合SSR，統(tǒng)計(jì)不同SSR 類型在轉(zhuǎn)錄組中的密度分布。結(jié)合SSR位點(diǎn)兩端保守的特點(diǎn)，利用Primer 3.0引物設(shè)計(jì)軟件進(jìn)行批量設(shè)計(jì)引物。從二～六核苷酸重復(fù)基元中隨機(jī)挑選315對(duì)預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物為100～500 bp的SSR引物，交由北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成，用于11份油梨種質(zhì)SSR引物篩選。

1.4? SSR引物篩選和驗(yàn)證

利用11份油梨種質(zhì)對(duì)合成的315對(duì)引物進(jìn)行引物有效性擴(kuò)增和篩選多態(tài)性，根據(jù)條帶擴(kuò)增效果，統(tǒng)計(jì)目的條帶擴(kuò)增穩(wěn)定、清晰的引物。

PCR反應(yīng)體系15.0 μL，包括：10×Buffer（Mg²⁺ Plus）1.5 μL，dNTP（2.5 mmol/L）0.8 μL，正反向引物（5 μmol/μL）各1.0 μL，模板DNA 2.0 μL

（50 ng/μL），Taq酶1 U，超純水補(bǔ)足至15.0 μL。PCR程序?yàn)椋?4 ℃ 5 min;33個(gè)循環(huán)（94 ℃ 30 s，60 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min）;最后72 ℃ 5 min。PCR產(chǎn)物用瓊脂糖檢測(cè)，再利用6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，電泳緩沖液為1×TBE，60 W恒功率電泳分離1.0 h，硝酸銀染色，拍照。

2? 結(jié)果與分析

2.1? 油梨轉(zhuǎn)錄組SSR位點(diǎn)分布頻率與基序特征

從油梨轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果，共包含37 639條Unigenes序列，總長(zhǎng)為23 605 Mb，GC%為47.31，其中檢測(cè)到5 292條序列上包含了共6 419個(gè)SSR 位點(diǎn)。其中復(fù)合SSRs有428條，占總SSR的6.67%，含有2個(gè)或2個(gè)以上SSR位點(diǎn)的序列有909條，占總SSR的17.18%。

油梨的二～六核苷酸重復(fù)基元的EST-SSRs分布頻率情況見(jiàn)表2。其中單堿基重復(fù)基元占比最高，為37.47%;二堿基重復(fù)基元次之，為31.80%;三堿基重復(fù)基元為29.80%; 四～六堿基重復(fù)基元最低，僅為0.93%。從重復(fù)次數(shù)看（表2），二～

油梨EST-SSR基元類型分布情況（表3）。單堿基重復(fù)基元有98.46%為（A/T）n形式;僅有1.54%為（C/G）n形式。二堿基重復(fù)基元有91.67%

為（AG/CT）n形式，占SSR總數(shù)的29.15%;而僅占本類基序比例最小的形式為（CG/CG）n形式，僅有0.24%，為SSR 總數(shù)的0.08%。三堿基重復(fù)基元有40.30%為（AAG/CTT）n形式，其次為（AGG/ CCT）n，占17.83%，（AGC/CTG）n占13.49%，（ACT/ AGT）n的形式最少，僅有0.78%。四～六堿基重復(fù)型的重復(fù)基元類型多，但數(shù)量少，僅為SSR總數(shù)的0.93%。

2.2? EST-SSR引物設(shè)計(jì)篩選和驗(yàn)證

5 292條油梨轉(zhuǎn)錄組序列中，成功設(shè)計(jì)包括二～六核苷酸重復(fù)的SSR位點(diǎn)引物1 083條，涉及90種基元類型，其中出現(xiàn)頻次大于10的基元類型如圖2所示，其中CT/TC為主要基序類型，占13.02%，基序類型AGA次之，占4.43%，基序類型GAA占4.25%，AAG 和CAG均占4.06%。

隨后，從1 083條引物中隨機(jī)挑選、合成315對(duì)SSR引物，并用11份油梨種質(zhì)對(duì)合成的315對(duì)引物擴(kuò)增效果進(jìn)行檢驗(yàn)。其中，88對(duì)未擴(kuò)增出條帶，占27.94%;其中227對(duì)引物能擴(kuò)增出條帶，占設(shè)計(jì)引物總數(shù)的72.06%;34對(duì)引物在不同種群個(gè)體中擴(kuò)增出多態(tài)性條帶，占10.79%。圖3為引物PA118在11份油梨種質(zhì)中的擴(kuò)增。

3? 討論

微衛(wèi)星標(biāo)記由于其廣泛存在于真核生物的基因組上，已成為目前研究種質(zhì)資源遺傳多樣性、基因組作圖的首選標(biāo)記。SSR分子標(biāo)記開發(fā)途徑主要包括基因組的SSR標(biāo)記開發(fā)、應(yīng)用已知EST數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行SSR標(biāo)記開發(fā)以及通過(guò)同源物種轉(zhuǎn)移開發(fā)SSR等。傳統(tǒng)上基因組開發(fā)SSR標(biāo)記，通過(guò)片段化酶切基因組、回收、測(cè)序、構(gòu)建含SSR的序列小片段基因組文庫(kù)，然后采用單克隆測(cè)序，成本高且操作繁雜、效率低下。Gross-German等^[19]利用構(gòu)建油梨基因組小片段SSR富集文庫(kù)和已知EST序列庫(kù)開發(fā)47個(gè)新的油梨SSR標(biāo)記，多態(tài)性較好的40個(gè)SSR，其中25個(gè)SSR和15個(gè)EST-SSR，EST-SSR開發(fā)效率為4%。本研究利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)開發(fā)油梨SSR共獲得37 639條Unigene通過(guò)MISA軟件進(jìn)行SSR搜索，獲得6 419個(gè)SSR，遠(yuǎn)高于采用其他方法開發(fā)的油梨SSR標(biāo)記數(shù)量，

成功設(shè)計(jì)1 083條引物。隨機(jī)挑選合成的315對(duì)引物篩選結(jié)果顯示，227對(duì)引物能擴(kuò)增出條帶，有效率達(dá)到72.06%，說(shuō)明從油梨轉(zhuǎn)錄組中設(shè)計(jì)開發(fā)分子標(biāo)記引物有效率較高，有34對(duì)引物在11個(gè)種質(zhì)材料間表現(xiàn)出較好的多態(tài)性，開發(fā)效率為10.79%。說(shuō)明利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)SSR開發(fā)效率高于傳統(tǒng)技術(shù)開發(fā)。

利用轉(zhuǎn)錄組開發(fā)花椒^[11]、紅松^[21]、沙棘^[22]等具有多態(tài)性引物的EST-SSR，有效性分別為28.13%、15.84%和22.35%。本研究發(fā)現(xiàn)油梨EST-SSR位點(diǎn)多，但相對(duì)于其他作物多態(tài)性引物開發(fā)有效性不高。引物開發(fā)效率低的原因：①用于分析的油梨樣品的數(shù)量和類型影響開發(fā)結(jié)果，樣品種群規(guī)模小，選擇存在一定的局限性;②油梨種質(zhì)資源的局限性，國(guó)內(nèi)油梨資源主要從國(guó)外引種，國(guó)內(nèi)已報(bào)道的油梨資源100份左右^[23]，與一些發(fā)達(dá)國(guó)家收集的油梨資源千余份存在一定的差距，種質(zhì)資源中國(guó)引種油梨只有100多年，且品種選育起步晚，水平較落后，只有桂研10號(hào)、桂墾系列等幾個(gè)優(yōu)良品系被推廣種植的報(bào)道^[24]。③種群內(nèi)部近交率頻繁，種群間存在一定的隔離現(xiàn)象，種群間基因流阻斷，導(dǎo)致種群內(nèi)遺傳多樣性較低，多樣性主要來(lái)自種群間。④可能是基因轉(zhuǎn)錄區(qū)的具有較高的保守性，種屬間具備一定的通用性，利于后續(xù)的近緣物種間的應(yīng)用。

研究發(fā)現(xiàn)，除單核苷酸重復(fù)基元以外，油梨中最為常見(jiàn)的重復(fù)基元為二堿基和三堿基，與王明^[13]、Jung^[25]等在芒果及薔薇科植物中的研究結(jié)果相似。油梨的二堿基重復(fù)基元中，高達(dá)91.67%為（AG/CT）n形式，與水稻、玉米、小麥、大豆、夏蠟梅、花椒中二堿基重復(fù)基元出現(xiàn)頻率最高的（AG/CT）n相同^{[11-12， 26]}。與夏蠟梅的相同^[12]，油梨的三堿基重復(fù)基元類型最多為（AAG/CTT）n;而芒果的三堿基重復(fù)基元中以（TTC/GAA）n類型最多^[13]，水稻、玉米、小麥、大豆的三堿基重復(fù)基元以（AAC/GTT）n類型最多^[26]，花椒的三堿基重復(fù)基元以（GAA/CTT）n類型最多^[11]。四～六堿基重復(fù)型的重復(fù)基元類型多，但數(shù)量少，僅為SSR總數(shù)的0.93%。

本研究開發(fā)了基于油梨轉(zhuǎn)錄組的SSR標(biāo)記，為油梨種群的遺傳多樣性分析、親本鑒定、交配系統(tǒng)估算、構(gòu)建遺傳連鎖圖譜等提供了新的途徑，同時(shí)油梨EST序列的開發(fā)為挖掘新的SSR提供了豐富的資源，為油梨EST-SSR引物在近緣物種間拓展提供了新的途徑。

4? 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，采用二代測(cè)序技術(shù)開發(fā)油梨SSR標(biāo)記具有快速、簡(jiǎn)單、有效、經(jīng)濟(jì)等特點(diǎn);成功開發(fā)獲得的多態(tài)性的油梨SSR標(biāo)記可用于研究油梨種質(zhì)資源的遺傳多樣性分析及其相關(guān)近緣物種（如肉桂、樟樹等）的遺傳變異研究，同時(shí)為中國(guó)油梨品種選育及遺傳改良提供有力的技術(shù)支持。

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