李宜奎等

摘要 ?{目的]克隆忽地笑{Lycorisaurea（LHér.）Herb.]α-葡萄糖苷酶2編碼基因。{方法]基于忽地笑的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫，分析功能注釋為α-葡萄糖苷酶2的基因片段，通過設計特異性定量PCR擴增引物分析其在各組織中的表達豐度，利用RACE（rapidamplificationofcDNAends）技術(shù)從高豐度組織中克隆獲得忽地笑α-葡萄糖苷酶2編碼基因。{結(jié)果]忽地笑α-葡萄糖苷酶2編碼基因LauAgl2cDNA全長3185bp，開放閱讀框為2961bp，編碼含有986個氨基酸殘基的LauAgl2蛋白質(zhì)。LauAgl2蛋白質(zhì)氨基酸序列具有α-葡萄糖苷酶Ⅱ特征性的保守結(jié)構(gòu)域和天冬氨酸殘基組成的活性中心，還具有一些蛋白質(zhì)糖基化的潛在位點（N-X-S/T共有序列）。LauAgl2蛋白質(zhì)與油棕、陸地棉等其他植物的α-葡萄糖苷酶2的氨基酸序列一致性為73.0%以上。利用pET表達系統(tǒng)，可以在大腸桿菌中實現(xiàn)LauAgl2蛋白質(zhì)的誘導表達。{結(jié)論]成功從忽地笑花葶和花瓣中克隆到α-葡萄糖苷酶2編碼基因LauAgl2并在大腸桿菌中對LauAgl2進行了異源表達，為LauAgl2蛋白質(zhì)的功能鑒定及其在忽地笑種子萌發(fā)與生長發(fā)育中的作用研究奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 ??忽地笑;α-葡萄糖苷酶2;分子克隆;原核表達

中圖分類號S??188文獻標識碼

A文章編號0517-6611（2018）36-0078-05

α-葡萄糖苷酶（EC3.2.1.20）在植物種子萌發(fā)過程中具有重要的生理作用。α-葡萄糖苷酶參與植物種子萌發(fā)過程中淀粉的水解，產(chǎn)生為胚芽生長提供能量的物質(zhì){1]。在這過程中，α-葡萄糖苷酶作用于淀粉水解產(chǎn)生的麥芽糖及麥芽寡糖，生成游離的葡萄糖{2-3]。植物α-葡萄糖苷酶活性的降低會影響種子萌發(fā)過程中淀粉代謝，導致麥芽糖積累，阻止種子萌發(fā){4]。擬南芥α-葡萄糖苷酶的缺失影響了細胞內(nèi)纖維素合成酶機器中的部分N-糖蛋白的功能性糖基化修飾，使得細胞壁中主要結(jié)構(gòu)組分——纖維素嚴重下降，從而導致早期胚胎徑向膨脹，影響擬南芥早期胚胎的形態(tài)發(fā)生{5]。因此，克隆α-葡萄糖苷酶編碼基因并進行深入研究對闡明其在植物種子萌發(fā)過程中的生理作用及其調(diào)控機制具有重要意義。

忽地笑{Lycorisaurea（LHér.）Herb.]是石蒜科石蒜屬多年生草本球根藥用植物，富含加蘭他敏、石蒜堿等石蒜科植物所特有的一類生物堿{6]。加蘭他敏是唯一在臨床上得到應用的石蒜科生物堿，作為一種長效的、選擇性的、可逆的、競爭性的乙酰膽堿酯酶抑制劑{7]，其在臨床上用于治療老年癡呆癥{8]。忽地笑不僅通過鱗莖進行無性繁殖，而且可以通過種子進行有性生殖，是加蘭他敏工業(yè)生產(chǎn)的良好原料{9]?；诤龅匦Φ霓D(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫{10]，筆者從中篩選出α-葡萄糖苷酶候選基因片段，利用RACE方法克隆到了忽地笑α-葡萄糖苷酶2編碼基因，并對其進行了生物信息學分析和原核表達分析等研究，為理解α-葡萄糖苷酶2在忽地笑種子的萌發(fā)、生長與發(fā)育過程中的作用奠定了基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料該研究所用忽地笑植株采自江蘇省中國科學院植物研究所藥用植物種質(zhì)資源圃（庫）。大腸桿菌TOP10和BL21（DE3）分別用于基因克隆和原核表達，為筆者所在實驗室保存;原核表達載體pET28a購自Novagen公司;pMD19-T、T4DNAligase、PrimeScriptTMRTreagentKitwithgDNAEraser（PerfectRealTime）反轉(zhuǎn)錄試劑盒和限制性內(nèi)切酶購自寶生物工程（大連）有限公司;SMARTerTMRACEcDNAAmplificationKit購自Clontech公司;

1.2RNA的提取稱取忽地笑組織約0.1g，于液氮中充分研磨，具體參照錢彬彬等{11]的方法提取RNA以及檢測RNA的純度與完整性。

1.3組織中基因豐度分析

稱取花期忽地笑的根、花柱、花葶、花苞、子房、花瓣和雄蕊及盛葉期忽地笑的葉片，液氮速凍后提取忽地笑不同組織的RNA，然后利用反轉(zhuǎn)錄酶獲得忽地笑不同組織的cDNA;利用忽地笑內(nèi)參基因TIP41{12]和α-葡萄糖苷酶候選基因CL6740的特異性引物（表1），以各組織cDNA為模板，進行實時定量PCR。PCR程序為95℃預變性5min;95℃變性15s，56℃退火15s，72℃延伸20s，共40個循環(huán)。每個樣品均進行3次重復試驗。利用2-ΔΔCt法計算忽地笑不同組織中α-葡萄糖苷酶候選基因的豐度。

1.4全長cDNA的克隆

基于忽地笑的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫{10]，選擇功能注釋為α-葡萄糖苷酶2的基因片段，設計該片段的克隆引物以及5′端和3′端的RACE（rapidamplificationofcDNAends）引物（表1）。RACE擴增程序為95℃預變性5min;95℃變性45s，56℃退火45s，72℃延伸120s，共30個循環(huán);72℃充分延伸10min。PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測并用膠回收試劑盒回收;回收片段連接pMD19-T載體，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10感受態(tài)細胞;菌落PCR驗證后，挑取陽性克隆子測序。

根據(jù)片段間的重疊區(qū)域拼接基因序列，獲得全長cDNA序列;利用在線軟件ORFfinder（http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf/）預測開放閱讀框（openreadingframe，ORF），根據(jù)ORF序列設計引物LauAgl2-ORF-PF和LauAgl2-ORF-PR（表1）擴增LauAgl2的編碼區(qū)。目標PCR擴增產(chǎn)物通過切膠回收，連接克隆載體pMD19-T，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10感受態(tài)細胞;經(jīng)菌落PCR驗證后，挑取陽性克隆子測序，保存測序正確的重組菌株并提取質(zhì)粒，獲得重組質(zhì)粒pMD-LauAgl2。

1.5生物信息學分析

利用在線程序BLASTp（http：∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）比對分析氨基酸序列;利用BioEdit軟件{13]和ClustalW程序分別進行氨基酸序列的聯(lián)立與比對分析;利用PROSITE（http：∥prosite.expasy.org）數(shù)據(jù)庫對LauAgl蛋白進行功能結(jié)構(gòu)預測;利用Protter（http：∥wlab.ethz.ch/protter/start/）分析氨基酸序列的信號肽及糖基化位點{14]。

1.6LauAgl2的原核表達及SDS-PAGE電泳檢測

質(zhì)粒pET28a利用限制性內(nèi)切酶NdeⅠ和XhoⅠ進行雙酶切;利用引物對pET28a-LauAgl2-PF和pET28a-LauAgl2-PR（表1）擴增獲得LauAgl2的編碼序列（LauAgl2）;利用OneStepCloningKit將LauAgl2組裝到pET28a質(zhì)粒的NdeⅠ與XhoⅠ位點之間，獲得pET28a-LauAgl2，經(jīng)測序正確后提取質(zhì)粒并連同空載體pET28a轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細胞中，挑取陽性克隆子進行原核表達分析。

將構(gòu)建的重組菌株接種于3mLLB液體培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)，然后按1%的接種量將菌液轉(zhuǎn)接入50mLLB液體培養(yǎng)基中，于37℃、200r/min培養(yǎng)至A600達0.6～0.8，吸取菌液1mL，并加入終濃度0.1mmol/L異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）進行誘導表達24h;菌液于12000r/min離心5min，棄上清液，加入200μL無菌水重懸菌體，加入50μL5×SDS上樣緩沖液，沸水浴10min，室溫下12000r/min離心10min;取20μL上清液進行SDS-PAGE蛋白電泳分析。

2結(jié)果與分析

2.1α-葡萄糖苷酶2候選基因在忽地笑不同組織中的豐度

基于忽地笑的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫{10]，根據(jù)注釋為α-葡萄糖苷酶2的基因片段CL6740序列設計特異性定量PCR擴增引物，以忽地笑TIP41基因為內(nèi)參基因{12]，采用實時定量PCR的方法分析α-葡萄糖苷酶候選基因在忽地笑不同組織中的豐度（圖1）。CL6740基因片段在忽地笑的鱗莖、根、葉、花柱、花葶、花苞、子房、花瓣和雄蕊中均有表達，且在花葶和花瓣中的豐度較高，在雄蕊中的豐度次之，其余組織中的豐度相對較低。這說明CL6740基因片段在忽地笑中的表達具有一定的組織特異性。

2.2忽地笑α-葡萄糖苷酶2編碼基因的克隆

以忽地笑花葶和花瓣組織的cDNA為模板，利用PCR技術(shù)擴增獲得了CL6740片段及其5′端和3′端，通過拼接測序結(jié)果，得到1條長度為3185bp的全長cDNA序列，包含一個2961bp的開放閱讀框，編碼一個包含986個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)（圖2）。進一步通過BLASTp分析發(fā)現(xiàn)，編碼的蛋白質(zhì)屬于糖苷水解酶31家族，含有α-葡萄糖苷酶Ⅱ特征性的保守結(jié)構(gòu)域（圖3A），而且具有α-葡萄糖苷酶的保守基序（圖3B），所以將該基因命名為LauAgl2。

2.3LauAgl2蛋白質(zhì)氨基酸序列的生物信息學分析

通過分析LauAgl2基因編碼的氨基酸序列，結(jié)果表明LauAgl2蛋白質(zhì)的理論相對分子質(zhì)量109916Da，理論等電點pI5.19;LauAgl2蛋白質(zhì)氨基酸序列中具有一些蛋白質(zhì)糖基化的潛在位點——N-X-S/T共有序列，說明LauAgl2蛋白可能在翻譯后水平上需要糖基化修飾，可能是以糖蛋白的形式執(zhí)行功能。

分析預測的LauAgl2蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示該蛋白質(zhì)中含有大量的無規(guī)則卷曲和β-折疊以及少量的α-螺旋和β-轉(zhuǎn)角;具體上，LauAgl2蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)中包含47.67%的無規(guī)則卷曲、25.56%的β-折疊、18.66%的α-螺旋和8.11%的β-轉(zhuǎn)角。

2.4LauAgl2氨基酸序列的同源性

通過與其他植物α-葡萄糖苷酶2進行氨基酸序列多重比對，結(jié)果顯示，LauAgl2與鳳梨{Ananascomosus（Linn.）Merr.]、油棕（ElaeisguineensisJacq.）、陸地棉（GossypiumhirsutumLinn.）、博落回{Macleayacordata（Willd.）R.Br.]等植物的α-葡萄糖苷酶2的氨基酸序列一致性達73.0%～80.7%;LauAgl2的氨基酸序列與上述植物α-葡萄糖苷酶2的氨基酸序列具有很多保守區(qū)域，均具有α-葡萄糖苷酶Ⅱ的特征模序，包括有天冬氨酸組成的活性中心（DGIWNDMNE）（圖4），表明植物的α-葡萄糖苷酶2具有較高的保守性。

2.5LauAgl2的原核表達分析

在大腸桿菌BL21（DE3）中，通過將LauAgl2的編碼序列組裝到pET28a表達系統(tǒng)，并在N-端融合組氨酸標簽序列，利用異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）進行誘導蛋白的表達，并對誘導細胞進行SDS-PAGE電泳檢測，結(jié)果表明，經(jīng)IPTG誘導后，在含重組質(zhì)粒pET28a-LauAgl2的細胞中檢測到1條相對分子質(zhì)量約為110kDa的蛋白質(zhì)條帶（圖5），與預測的6hisLauAgl2蛋白質(zhì)的理論相對分子質(zhì)量基本一致，這說明目標蛋白質(zhì)6hisLauAgl2在大腸桿菌中成功表達。而且，隨著IPTG誘導時間的延長，6hisLauAgl2蛋白質(zhì)的表達量顯著增加。

3討論

該研究在分析忽地笑轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫的基礎(chǔ)上，通過考察忽地笑不同組織中α-葡萄糖苷酶2候選基因片段CL6740的豐度，進一步利用RACE方法從忽地笑花葶和花瓣中克隆得到一個α-葡萄糖苷酶2編碼基因LauAgl2。LauAgl2基因cDNA全長3185bp，存在一個2961bp長度的開放閱讀框，編碼1個含有986個氨基酸殘基的蛋白質(zhì)LauAgl2。LauAgl2蛋白質(zhì)屬于糖苷水解酶31家族（GH31），其氨基酸序列的N-端不具有分泌信號肽序列。LauAgl2蛋白質(zhì)與其他植物來源的α-葡萄糖苷酶2氨基酸序列具有較高的一致性，且具有相似的保守結(jié)構(gòu)域和相同的活性位點，說明該蛋白在進化上是高度保守的。

α-葡萄糖苷酶不僅能夠催化麥芽糖等物質(zhì)末端非還原性的α-1，4連接的葡萄糖苷鍵的水解，釋放D-葡萄糖，還能夠?qū)牡途厶穷惖孜锓沁€原末端釋放的葡萄糖殘基轉(zhuǎn)移到另一糖類、酯類或蛋白質(zhì)類底物上，形成α-1，6葡萄糖苷鍵，產(chǎn)生非發(fā)酵性的低聚異麥芽糖或糖苷、糖酯、糖肽等物質(zhì){15-17]，在低聚異麥芽糖及一些非天然的α-葡萄糖苷等生產(chǎn)領(lǐng)域具有重要的應用。該研究克隆到忽地笑α-葡萄糖苷酶2編碼基因LauAgl2為其功能基礎(chǔ)研究及應用研究奠定了良好的基礎(chǔ)。

參考文獻

{1]TAGAMIT，YAMASHITAK，OKUYAMAM，etal.Molecularbasisfortherecognitionoflong-chainsubstratesbyplantαglucosidases{J].JBiolChem，2013，288（26）：19296-19303.

{2]STANLEYD，REJZEKM，NAESTEDH，etal.Theroleofα-glucosidaseingerminatingbarleygrains{J].PlantPhysiol，2011，155（2）：932-943.

{3]SUNZT，HENSONCA.Aquantitativeassessmentoftheimportanceofbarleyseedαamylase，βamylase，debranchingenzyme，andαglucosidaseinstarchdegradation{J].ArchBiochemBiophys，1991，284（2）：298-305.

{4]KONISHIY，OKAMOTOA，TAKAHASHIJ，etal.EffectsofBaym1099，anα-glucosidaseinhibitor，onstarchmetabolismingerminatingwheatseeds{J].BiosciBiotechnolBiochem，1994，58（1）：135-139.

{5]GILLMORCS，POINDEXTERP，LORIEAUJ，etal.α-glucosidaseIisrequiredforcellulosebiosynthesisandmorphogenesisinArabidopsis{J].JCellBiol，2002，156（6）：1003-1013.

{6]GUOY，PIGNINB，ZHENGYH，etal.AnalysisofbioactiveAmaryllidaceaealkaloidprofilesinLycorisspeciesbyGCMS{J].NatProdCommun，2014，9（8）：1081-1086.

{7]NOVIKOVAIY，TULAGANOVAA.Physicochemicalmethodsfortheanalysisofgalanthamine（Review）{J].Pharmaceuticalchemistryjournal，2002，36（11）：623-627.

{8]馬廣恩.加蘭他敏治療老年性癡呆癥的研究概況{J].藥學進展，1998，22（3）：153-156.

{9]谷海燕，謝孔平，李世麗，等.石蒜屬植物的無性繁殖研究{J].中國林副特產(chǎn)，2012（2）：32-35.

{10]WANGR，XUS，JIANGYM，etal.DenovosequenceassemblyandcharacterizationofLycorisaureatranscriptomeusingGSFLXtitaniumplatformof454pyrosequencing{J].PLoSOne，2013，8（4）：1-10.

{11]錢彬彬，李宜奎，李潔，等.忽地笑CYP98A的分子克隆與表達分析{J].分子植物育種，2018，16（11）：3533-3541.

{12]MAR，XUS，ZHAOY，etal.Selectionandvalidationofappropriatereferencegenesforquantitativereal-timePCRanalysisofgeneexpressioninLycorisaurea{J].FrontPlantSci，2016，7：536.

{13]HALLTA.BioEdit：AuserfriendlybiologicalsequencealignmenteditorandanalysisprogramforWindows95/98/NT{J].NucleicAcidsSympSer，1999，41（2）：95-98.

{14]OMASITSU，AHRENSCH，MULLERS，etal.Protter：Interactiveproteinfeaturevisualizationandintegrationwithexperimentalproteomicdata{J].Bioinformatics，2014，30（6）：884-886.

{15]MALSˇ，DVORˇKOVH，HRABALR，etal.Towardsregioselectivesynthesisofoligosaccharidesbyuseofα-glucosidaseswithdifferentsubstratespecificity{J].CarbohydrRes，1999，322（3/4）：209-218.

{16]OKUYAMAM，SABURIW，MORIH，etal.α-glucosidasesandα-1，4-glucanlyases：Structures，functions，andphysiologicalactions{J].CellMolLifeSci，2016，73（14）：2727-2751.

{17]SUGIMOTOM，F(xiàn)URUIS，SASAKIK，etal.Transglucosylationactivitiesofmultipleformsofα-glucosidasefromspinach{J].BiosciBiotechnolBiochem，2003，67（5）：1160-1163.