鞏雪潔 臧敦安 許文豪

摘要 [目的]探討不同周齡、不同初始注射時(shí)間對(duì)小鼠超數(shù)排卵效果的影響。[方法]用10 IU PMSG+10 IU HCG間隔48 h處理C57BL/6J小鼠，收集并統(tǒng)計(jì)合子數(shù)。[結(jié)果]4周齡超排效果優(yōu)于于8周齡，可達(dá)26.86枚∕只；4周齡C57BL/6J小鼠PMSG和HCG注射時(shí)間為12：00—13：00，超排后收集合子數(shù)可達(dá)30枚∕只以上，而且體外培養(yǎng)的發(fā)育狀況良好。[結(jié)論] 4周齡C57BL/6J小鼠適宜超數(shù)排卵；PMSG和HCG注射時(shí)間為12：00—13：00， 超排效果相對(duì)理想。

關(guān)鍵詞 小鼠；超排卵；激素；周齡；初始注射時(shí)間

中圖分類號(hào) S865.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A文章編號(hào) 0517-6611（2018）15-0072-03

Abstract [Objective]To discuss the influence of week-age and initial injection time on superovulation in mice. [Method]The C57BL/6J mice were treated with 10 IU PMSG+10 IU HCG interval 48h， and the number of zygotes was collected and counted. [Result] The effect of the four week age superovulation was better than that of eight weeks， and it could reach 26.86 . The time of PMSG and HCG injection of C57BL/6J mice at 4 weeks old was 12-13 at noon， and the number of zygotes collected was up to 30 and in vitro culture of the fertilized ovum was in good condition.[Conclusion]The 4-week old C57BL/6J mice are suitable for superovulation. When the injection time of PMSG and HCG is 12-13 at noon， the superovulation effect is relatively ideal.

Key words Mouse； Superovulation；Hormone；Week-age；Initial injection time

以各種外源促性腺激素誘發(fā)動(dòng)物卵巢的許多卵泡發(fā)育并排出具有受精能力的卵子的過程稱為超數(shù)排卵（Superovulation），簡(jiǎn)稱“超排”。1927年Smith和Engle首先在小鼠上發(fā)現(xiàn)了超排現(xiàn)象，隨后Cole和Hart發(fā)現(xiàn)孕馬血清（PMSG）可使未成熟的大鼠超排，奠定了超排的技術(shù)基礎(chǔ)[1]。我國20世紀(jì)70年代末牛、奶山羊超排后鮮胚移植成功。胚胎移植技術(shù)與當(dāng)今生物科學(xué)、醫(yī)學(xué)及物種保存領(lǐng)域密切相關(guān)，而胚胎移植成功的關(guān)鍵是大量的優(yōu)質(zhì)胚胎，完善的超排卵技術(shù)就成了胚胎移植成功的首要條件。

近年來隨著基因工程小鼠的大量開發(fā)，小鼠的卵母細(xì)胞和胚胎需求量也日益增加。單靠自然排卵，耗時(shí)耗力，也很難滿足研究需要，成熟的超排卵技術(shù)可以大幅提高動(dòng)物的生產(chǎn)效率。小鼠的超排受內(nèi)外多種因素的影響，超排效果極不穩(wěn)定。影響小鼠超排效果的因素主要有小鼠的品系、周齡、生理周期，激素的劑量、注射時(shí)間、間隔時(shí)間。研究者的報(bào)道中，小鼠超排的激素劑量和周齡沒有完全統(tǒng)一，且對(duì)昆明小鼠超排的研究相對(duì)比較完備，但對(duì)C57BL/6J小鼠超排的研究相對(duì)較少，而C57BL/6J小鼠在基因工程小鼠研究中應(yīng)用非常廣泛。

筆者采用孕馬血清促性腺激素（PMSG）和人絨毛膜促性腺激素（HCG）對(duì)小鼠進(jìn)行超數(shù)排卵，通過不同周齡、注射時(shí)間的小鼠超排效果的比較，進(jìn)一步完善小鼠超數(shù)排卵方案，為完善小鼠，尤其是C57BL/6J小鼠的超數(shù)排卵技術(shù)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。選用4～10周齡未交配過的C57BL/6J小鼠（購自湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心），動(dòng)物質(zhì)量許可證號(hào)碼為SCXK（鄂）2015-0018。

1.1.2 試劑。①孕馬血清促性激素（pregnant mare serum gonadotropin，PMSG），寧波市三生藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，生產(chǎn)批號(hào)S170106；血促性素專用稀釋液，寧波市三生藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，生產(chǎn)批號(hào)C161210。用血促性素專用稀釋液配成100 IU/mL的儲(chǔ)備液，-20 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?。②人絨毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotrophin，HCG），寧波人健藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司生產(chǎn)，生產(chǎn)批號(hào)170112。用生理鹽水配成100 IU/mL的儲(chǔ)備液，-20 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩＂叟咛ゲ僮饕海篗2小鼠胚胎收集專用培養(yǎng)液（Sigma）；胚胎培養(yǎng)液：KSOM小鼠胚胎專用培養(yǎng)液（Sigma）；透明質(zhì)酸酶濃儲(chǔ)液（Sigma H4272）：用M2培養(yǎng)液稀釋至0.01%；石蠟油（Sigma）。

1.1.3 儀器。尼康T-S雙端口倒置顯微鏡、Memmert INC108 med CO2 培養(yǎng)箱、國產(chǎn)體視顯微鏡、用硬玻璃毛細(xì)管（1.5 mm外徑）自制的吸卵管、一次性塑料35 mm培養(yǎng)皿、康寧18 mm培養(yǎng)皿。

1.2 方法

1.2.1 小鼠的準(zhǔn)備。將購買回來的小鼠放入中南民族大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物檢疫間內(nèi)，進(jìn)行試驗(yàn)前7 d的環(huán)境適應(yīng)性飼養(yǎng)和檢疫，無異常的小鼠用于超排處理。SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室的環(huán)境按照國家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行控制：溫度23～25 ℃，濕度55%±5%，室內(nèi)光照為12 h∶12 h明暗（08：00—20：00）交替，空氣為一萬級(jí)凈化。

1.2.2 小鼠的分組。同一周齡的小鼠歸為1組，用同樣周齡的22只小鼠進(jìn)行試驗(yàn)。3—5月進(jìn)行超排處理的小鼠記為春季組，6—8月進(jìn)行超排處理的小鼠記為夏季組，9—11月進(jìn)行超排處理的小鼠記為秋季組，12月—次年2月進(jìn)行超排處理的小鼠記為冬季組。

1.2.3 小鼠的超數(shù)排卵處理。

1.2.3.1 注射PMSG 10 IU。第1天下午，挑選同一周齡的雌性小鼠，每只小鼠腹腔注射PMSG 10 IU。

1.2.3.2 注射HCG 10 IU。第3天下午同一時(shí)刻，即間隔48 h，每只小鼠腹腔注射HCG 10 IU，與種雄鼠按照1∶1的比例合籠。

1.2.3.3 制移卵管。①在酒精燈外焰上輕烤玻璃管，使之軟化；②玻璃管離開火焰，迅速拉伸玻璃管兩端，產(chǎn)生1個(gè)內(nèi)徑200～250 μm的管；③為使玻璃管口平整，用小砂輪片將玻璃管切割后，迅速折斷；④移卵管口接觸火焰后迅速撤離，可減少操作過程中對(duì)透明帶的傷害。

1.2.3.4 受精卵的獲取。第4天09：00取懷孕0.5 d的小鼠，斷頸處死，腹面朝上放在吸水紙上，立刻用75%乙醇噴灑小鼠腹部，盡量減少毛發(fā)污染。迅速打開腹腔，暴露子宮和輸卵管。輕輕將子宮、輸卵管、卵巢和脂肪墊拉出體腔，用鑷子尖在靠近輸卵管的膜上開一小口，將輸卵管和少部分帶著的子宮轉(zhuǎn)移到已滅菌的35 mm培養(yǎng)皿里（加有預(yù)熱至37 ℃的M2培養(yǎng)液滴）。在20倍體視顯微鏡下，找到輸卵管膨大的壺腹部，用胚胎操作針將其刺破，并引流至M2培養(yǎng)液滴中，用自制的玻璃移卵管，將卵丘細(xì)胞包圍的一團(tuán)合子轉(zhuǎn)移到透明質(zhì)酸酶液滴中，消化30 s。然后用口吸管將合子收集到新鮮M2培養(yǎng)液滴中，用移卵管上下吹洗幾次，去除殘留的透明質(zhì)酸酶、卵丘細(xì)胞和雜質(zhì)。

1.2.3.5 受精卵的體外培養(yǎng)。將受精卵轉(zhuǎn)移到預(yù)先在37 ℃、5%CO2平衡24 h的KSOM培養(yǎng)液滴（石蠟油液封的微滴）中，放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)3 d，培養(yǎng)密度一般為每20 μL 10～15枚。顯微鏡下觀察統(tǒng)計(jì)不同時(shí)段受精卵發(fā)育的狀態(tài)。

2 結(jié)果與分析

2.1 周齡對(duì)C57BL/6J小鼠超排的效果

由表1可知，10 IU PMSG+10 IU HCG間隔48 h處理小鼠，4周齡取合子數(shù)明顯比8周齡多。4周齡和8周齡C57BL/6J的超排效果比較，4周齡優(yōu)于8周齡。

2.2 季度對(duì)C57BL/6J小鼠超排的影響

由圖1可知，C57BL/6J小鼠秋季組超排效果好于冬季組，秋季組小鼠的取合子數(shù)為30枚以上，而冬季組同樣激素的劑量處理4周齡、5周齡、6周齡小鼠，收集的合子數(shù)差別不大，效果都不理想。秋季超排實(shí)驗(yàn)，6周齡小鼠的取合子數(shù)比4周齡、5周齡略微好一些。

2.3 PMSG初始注射時(shí)間對(duì)C57BL/6J小鼠超排的影響

由圖2可知，對(duì)于4周齡C57BL/6J小鼠，12：00—13：00初始注射PMSG可獲得比較多的合子；而5周齡C57BL/6J小鼠13：00、17：00初始注射PMSG，均可獲取比較多的合子；8周齡C57BL/6J小鼠13：00初始注射PMSG，超排效果最佳。若初始PMSG時(shí)間相同，同一天的12：00、13：00、15：00、16：00、17：00注射PMSG，不同周齡的小鼠超排效果差異比較明顯。

2.4 C57BL/6J小鼠受精卵的體外培養(yǎng)

由圖3可知，用KSOM胚胎培養(yǎng)液培養(yǎng)C57BL/6J小鼠的受精卵，1.5 d后有雙原核的受精卵基本都可發(fā)育至2-細(xì)胞，2-細(xì)胞的2個(gè)分裂球?qū)ΨQ均勻，顏色清晰，透明帶完整光滑。3.5 d后2-細(xì)胞中的絕大部分可發(fā)育至囊胚階段，極少部分皺縮退化。KSOM胚胎培養(yǎng)液中小鼠受精卵發(fā)育的同步化程度較高。

3 結(jié)論與討論

3.1 周齡對(duì)超排的影響 宋紹征等[2]比較了5周齡與8周齡C57BL/6J的超排效果，發(fā)現(xiàn)8周齡效果略好； Esmail等[3]發(fā)現(xiàn)4周齡C57BL/6J更適合超排 ；陳曉娟等[4]比較了獲得的卵母細(xì)胞數(shù)、2-細(xì)胞數(shù)等，認(rèn)為4周齡C57BL/6J超排更好；而Kolbe等[5]認(rèn)為21～32日齡比32日齡以上的C57BL/6J小鼠獲得的卵母細(xì)胞更多。該實(shí)驗(yàn)后期采用4周齡C57BL/6J小鼠進(jìn)行超排。

3.2 注射時(shí)間對(duì)超排的影響 對(duì)大多數(shù)小鼠品系來說，內(nèi)源黃體素（LH）的釋放時(shí)間為注射PMSG之后的第2個(gè)暗期中點(diǎn)之后的15～20 h，而排卵發(fā)生在注射HCG后10～13 h，但要人為控制排卵時(shí)間，就需在內(nèi)源LH釋放前注射HCG。唐一岷等[6]認(rèn)為C57BL/6J小鼠超排后14～15 h取的卵最多；陳曉娟等[4]發(fā)現(xiàn)，4周齡的C57BL/6J小鼠對(duì)PMSG應(yīng)答產(chǎn)生的內(nèi)源黃體素（LH）釋放量不足以引起排卵，HCG注射時(shí)間為注射PMSG后48～49 h，此時(shí)獲得卵母細(xì)胞數(shù)較多。該實(shí)驗(yàn)中4周齡的C57BL/6J小鼠內(nèi)源性LH釋放不足，排卵的高峰時(shí)間就和上述的“HCG10～13 h”不一致。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，注射PMSG（10 IU）時(shí)間為第1天12：00—13：00，間隔48 h同樣的時(shí)間再注射HCG（10 IU），注射HCG后18～21 h取胚，也能獲得比較好的超排效果。

3.3 C57BL/6J小鼠早期胚胎體外發(fā)育 小鼠的早期胚胎即從受精卵開始經(jīng)過卵裂、2-細(xì)胞、8-細(xì)胞、桑椹胚、囊胚等階段，尚未與子宮建立組織聯(lián)系的游離階段的胚胎。體外培養(yǎng)效率首先依賴于超排獲得優(yōu)質(zhì)的卵母細(xì)胞和受精卵。該實(shí)驗(yàn)中小鼠受精卵收集時(shí)間固定為第4天09：00。光照周期為05：00—19：00，PMSG時(shí)間也相應(yīng)提前到中午，才能保證受精卵的存活率[7]。而Takeo等[8-10]采用其他激素（IAS和eCG，輔以體外授精（IVF）， 2-細(xì)胞百分比、原代出生率都非?？捎^。該實(shí)驗(yàn)采用自然交配獲得受精卵，發(fā)育到2-細(xì)胞的百分比可達(dá)27.91%。后續(xù)實(shí)驗(yàn)若采用IVF，受精率可大幅提升，能進(jìn)一步提高小鼠早期胚胎體外發(fā)育質(zhì)量。實(shí)驗(yàn)小鼠的發(fā)情周期、營養(yǎng)狀況對(duì)超排效果的影響還有待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)

[1] ARMSTRONG D T（趙曉霞，高昌恒，譯）.家畜超排的生理基礎(chǔ)（下）[J].國外畜牧科技，1991，18（2）：18-20.

[2] 宋紹征，王怡，王寶珠，等.激素劑量、小鼠品系及周齡對(duì)超數(shù)排卵的影響[J].實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)，2011，28（4）：5-8.

[3] ESMAIL M Y， QI P， CONNOR A B， et al. Generating chimeric mice by using embryos from nonsuperovulated BALB/c mice compared with superovulated BALB/c and albino C57BL/6 mice[J].Journal of the American association for laboratory animal science，2016，55（4）：400-405.

[4] 陳曉娟，王芊芊. C57BL/6J小鼠促性腺激素注射時(shí)間對(duì)誘導(dǎo)超排卵的影響[J].畜牧獸醫(yī)科技信息，2015（3）：38-39.

[5] KOLBE T， LANDSBERGER A， MANZ S， et al. Productivity of superovulated C57BL/6J oocyte donors at different ages[J].Lab animal，2015，44（9）： 346-349.

[6] 唐一岷，劉麗均，徐平.小鼠超排后的取卵時(shí)間對(duì)體外受精率的影響[J].上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)（農(nóng)業(yè)科學(xué)版），2003，21（3）：185-188.

[7] 安德拉斯·納吉，瑪麗娜·格特森斯坦，克里斯蒂娜·文特斯藤，等.小鼠胚胎操作實(shí)驗(yàn)手冊(cè)[M].孫青原，陳大元，譯.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2006：1.

[8] TAKEO T，NAKAGATA N.Superovulation using the combined administration of inhibin antiserum and equine chorionic gonadotropin increases the number of ovulated oocytes in C57BL/6 female mice[J].PLoS One，2015，10（5）：1-11.

[9] TAKEO T，NAKAGATA N.Efficient production of mouse oocytes using superovulation by immunization against inhibin[J].Transgenic research，2016，25（2）：211-212.

[10] TAKEO T，NAKAGATA N.Immunotherapy using inhibin antiserum enhanced the efficacy of equine chorionic gonadotropin on superovulation in major inbred and outbred mice strains[J]. Theriogenology，2016，86（5）：1341-1346.