劉亞倩　劉克勤　高嬌娜　操小棟　葉永康

摘要 [目的]構(gòu)建一種新型DNA電化學(xué)傳感器，并用于花椰菜花葉病毒35S啟動子片段檢測。[方法]通過使用氨基化多壁碳納米管對玻碳電極進(jìn)行修飾，利用氨基化多壁碳納米管對硫堇-金納米粒子-DNA納米復(fù)合物的吸附固定得到用于識別目標(biāo)DNA的捕獲界面，并將親和素-辣根過氧化物酶修飾的金納米粒子作為結(jié)構(gòu)末端的信號分子，完成夾心結(jié)構(gòu)傳感器組裝。試驗采用循環(huán)伏安法對辣根過氧化物酶催化過氧化氫得到的還原電流進(jìn)行測試。[結(jié)果]該傳感器可實現(xiàn)對目標(biāo)DNA定量檢測，線性范圍為1×10-18 ～1×10-11 mol/L，檢測限低至6.95×10-20 mol/L，可特異性識別錯配序列，并且表現(xiàn)出良好的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性。[結(jié)論]該傳感器在轉(zhuǎn)基因食品的檢測方面有良好的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞 電化學(xué)DNA生物傳感；花椰菜花葉病毒35S啟動子；多壁碳納米管；硫堇；辣根過氧化物酶

中圖分類號 TS207 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2018）17-0183-04

Abstract [Objective] The research aimed to construct a DNA electrochemical sensor to detect the Cauliflower Mosaic Virus 35S promoter（CaMV35S）. [Methods]We choosed avidinhorseradish peroxidasegold nanoparticles（AuNPsHRPSA） and thioninegold nanoparticlesDNA nanocomposite（ThiAuNPsDNA） as signal amplification molecule to construct the DNA electrochemical sensor. We used multiwalled carbon nanotubes functionalized by amino （NH3MWCNTs） as the bottom layer to immobilize ThiAuNPsDNA which could identify target DNA and AuNPsHRPSA as the terminal signal amplifying molecule. The hybridization reaction was monitored by cyclic voltammetry upon HRP as an electrochemical indicator and H2O2 as enzyme substrate. [Result] The sensor could achieve the goal of quantitative detection of tDNA and obtain a linear range from 1×10-18 mol/L to 1×10-11 mol/L with the detection limits of 6.95×10-20 mol/L（S/N=3）. The sensor also show good application prospect with good selectivity， repeatability and stability. [Conclusion] The sensing method has a good prospect in the detection of genetically modified foods.

Key words Electrochemical DNA biosensor；Cauliflower Mosaic Virus 35S promoter；Multiwalled carbon nanotubes；Thionine；Horseradish peroxidase

轉(zhuǎn)基因食品隨著基因工程技術(shù)的深入發(fā)展廣泛進(jìn)入普通大眾生活，其潛在風(fēng)險已引起世界各國廣泛關(guān)注。目前對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品進(jìn)行檢測的方法普遍建立在對啟動子和終止子的檢測上，花椰菜花葉病毒35S啟動子廣泛被作為檢測對象[1]。電化學(xué)DNA傳感器是以核酸作為分子識別元件，將目標(biāo)分析物引起的電化學(xué)性質(zhì)的改變轉(zhuǎn)換為可檢測電信號的檢測方法，被廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)和生物技術(shù)研究等重要領(lǐng)域[2-3]。為了增強傳感器的靈敏度和選擇性，一些納米材料被運用于電化學(xué)傳感器的構(gòu)建。多壁碳納米管（MWCNT）的穩(wěn)定性好、拉伸強度高[4]，可通過化學(xué)法對其表面進(jìn)行改性使其具備特定官能團(tuán)，從而固定納米復(fù)合物、生物酶等分子。多壁碳納米管常被用于增加活性分子的負(fù)載量與密度，是構(gòu)建電化學(xué)傳感器一種常用的材料[5-6]。金納米粒子、銀納米粒子、鉑納米粒子等金屬納米粒子常被應(yīng)用于電化學(xué)傳感器的構(gòu)建[7-11]。金納米粒子（AuNPs）擁有巨大的比表面積、良好生物相容性和導(dǎo)電性，其可以通過Au-S鍵、Au-N鍵共價固定單鏈DNA探針，也可吸附多種金屬納米粒子、硫堇（Thi）以及辣根過氧化物酶（HRP）等物質(zhì)[12-14]，因此金納米粒子以多種方式被應(yīng)用于加大探針或活性物質(zhì)的負(fù)載量，從而提高電化學(xué)檢測方法的靈敏度。筆者利用多壁碳納米管和金納米粒子制備納米復(fù)合物材料，構(gòu)建一種新型的DNA電化學(xué)傳感方法對花椰菜花葉病毒35S啟動子片段進(jìn)行檢測研究，以期為轉(zhuǎn)基因食品檢測提供靈敏度更高的檢測方法。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

氨基化多壁碳納米管（NH3-MWCNTs）購自南京吉倉納米科技有限公司；氯金酸（HAuCl4）、Thi、H2O2購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；親和素-辣根過氧化物酶（HRP-SA）購自斯信生物科技有限公司；乙二胺四乙酸（EDTA）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、三羧基乙基膦（TCEP）購自阿拉丁化學(xué)試劑有限公司。化學(xué)試劑都是分析純級，試驗用水均為超純水。

花椰菜花葉病毒35S啟動子片段及相關(guān)序列由上海生工生物科技有限公司合成，序列如下：

目標(biāo)序列（tDNA）：5′-GGCTCCTACAAATGCCATCATT-3′

捕獲探針（cDNA）：5′-SH-AATGATGGCA-3′

信號探針（sDNA）：5′-GTAGGAGCCAAA-Biotin-3′

單堿基錯配序列（Mis-1）：5′-GGCTCCTACAAATGCGATCATT-3′

三堿基錯配序列（Mis-3）：5′-GGCTCGTACAAATGCGATCTTT-3′

完全不互補序列（N-DNA）：5′-CATATACGTGGTCAGGTAGTAA-3′

試驗使用CHI832D型電化學(xué)工作站，采用玻碳電極（GCE）為工作電極，鉑絲電極為對電極，Ag/AgCl為參比電極的三電極體系。

1.2 方法

1.2.1 緩沖液配制。首先配制pH 7.4的濃度為10 mmol/L Tris-HCl緩沖溶液。取100 mL Tris-HCl緩沖溶液加入0.1 mmol EDTA作為DNA儲存溶液。取100 mL Tris-HCl緩沖溶液加入0.1 mmol EDTA、0.1 mmol TCEP、5 mmol NaCl作為cDNA固定緩沖液。取100 mL Tris-HCl緩沖溶液加入0.1 mmol EDTA、5 mmol NaCl作為DNA雜交緩沖液。

1.2.2 Thi-AuNPs-cDNA復(fù)合物的制備。用錐形瓶取100 mL氯金酸溶液（0.01%）于磁力加熱攪拌器上加熱至沸騰，持續(xù)攪拌加熱并加入1.4 mL檸檬酸鈉（1%），觀察溶液顏色由淺黃色變?yōu)榫萍t色，停止加熱得到AuNPs溶液。

取100 μL Thi溶液（0.01 mmol/L）與1 mL AuNPs溶液混合，振蕩30 min。另取10 μL cDNA（10 μmol/L），10 μL Tris-HCl（50 mmol/L，pH 8.2）緩沖溶液和10 μL TCEP溶液（10 mmol/L）混合均勻并靜置1 h。將這2種溶液充分混合后在37 ℃下溫育16 h，隨后13 000 r/min下離心水洗3次，用PBS緩沖液（pH 7.4）定容至1 mL，得到Thi-AuNPs-cDNA納米復(fù)合物[15]。

1.2.3 AuNPs-HRP-SA制備。取1 mL制備好的AuNPs溶液于離心管中，10 000 r/min下離心10 min，棄去上清液，用PBS（pH 7.4）緩沖液重新定容至300 μL，完成AuNPs溶液的濃縮，加入20 μL SA-HRP（0.1 mg/mL）溶液，4 ℃振蕩24 h，之后8 000 r/min下離心15 min，離心水洗3次后用緩沖液定容，4 ℃條件下儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 玻碳電極的處理及傳感器組裝。首先將直徑為3 mm的GCE電極依次用粒徑1.00、0.30和0.05 μm 的Al2O3粉末拋光，用1∶1的硝酸水溶液、乙醇和超純水超聲清洗干凈，以含0.1 mol/L KCl的5 mmol/L鐵氰化鉀溶液為底液，采用循環(huán)伏安法（CV）在-0.2～0.6 V對電極進(jìn)行多次檢測，直到得到電壓差小于80 mV的氧化還原峰，隨后用超純水清洗，N2吹干。

將NH3-MWCNTs粉末溶于10 mg/mL殼聚糖溶液中超聲2 h，得到1 mg/mL均勻的NH3-MWCNTs溶液。傳感器組裝過程如圖1所示，首先將NH3-MWCNTs溶液5 μL滴加到GCE表面，放置干燥后繼續(xù)滴加5 μL Thi-AuNPs-cDNA復(fù)合物，1 h后用0.1% SDS溶液和Tris-HCl緩沖液洗滌電極表面，得到Thi-AuNPs-cDNA /NH3-WMCNTs /GCE電極，將得到的電極先后在tDNA溶液和sDNA溶液（1×10-9 mol/L）中37 ℃溫育一段時間，隨后用Tris-HCl溶液和SDS溶液（0.1%）分別洗滌5 min，以除去非特異雜交的DNA，之后滴加5 μL AuNPs-HRP-SA復(fù)合物，30 min后用Tris-HCl緩沖溶液和超純水洗滌并吹干，得到AuNPs-HRP-SA/sDNA-tDNA/Thi-AuNPs-cDNA/NH3-WMCNTs/GCE用于電化學(xué)測試。

1.2.5 電化學(xué)測試方法。采用循環(huán)伏安法（CV）檢測，底液為包含1.5 mmol/L H2O2的PBS緩沖溶液（pH 7.4），CV掃描范圍為-1.0～0 V，掃描速率為50 mV/s。

2 結(jié)果與分析

2.1 Thi-AuNPs-DNA復(fù)合物的紫外-可見光譜表征

Thi-AuNPs-cDNA及相關(guān)復(fù)合物的紫外光譜表征如圖2所示，Thi（曲線a）出現(xiàn)2個特征吸收峰，分別位于283和598 nm，歸因于Thi芳香族的π-π*和C=N鍵的n→π*躍遷[15]。AuNPs（曲線b）最大吸收峰出現(xiàn)在532 nm，這是AuNPs的典型吸收峰[12]。Thi-AuNPs-cDNA（曲線d）出現(xiàn)3個吸收峰，其中283、601 nm出現(xiàn)的吸收峰與Thi相關(guān)，而與Thi-AuNPs（曲線c）相比，540～565 nm出現(xiàn)強峰值波長，金納米粒子吸收峰從532 nm移至561 nm，這是由于cDNA與AuNPs自組裝導(dǎo)致的，表明Thi-AuNPs-cDNA復(fù)合物成功制備。

2.2 傳感器組裝電化學(xué)表征

在鐵氰化鉀溶液中對電極組裝過程進(jìn)行CV分析，結(jié)果如圖3所示。裸電極（曲線a）有一對弱鐵的氧化還原峰，當(dāng)電極表面修飾NH3-MWCNTs之后（曲線b），氧化還原峰電流明顯增大，證明NH3-MWCNTs充分提高了電極導(dǎo)電性，加速電子轉(zhuǎn)移。用Thi-AuNPs-cDNA復(fù)合物修飾電極后，在-0.15～0.28 V出現(xiàn)一對明顯的非對稱氧化還原峰（曲線c），電信號顯著增強，這是因為復(fù)合物中Thi和AuNPs增強了電極電子傳遞能力，表明Thi-AuNPs-cDNA復(fù)合物成功通過Au-N鍵作用吸附到NH3-MWCNTs修飾GCE電極表面。隨著溫育tDNA和sDNA（曲線d和e）后，CV響應(yīng)電流明顯下降，這是由于DNA磷酸骨架所帶的負(fù)電荷阻礙了電子傳輸，證明通過DNA堿基互補作用，tDNA和sDNA成功組裝到電極上，夾心結(jié)構(gòu)形成。

2.3 試驗條件優(yōu)化

為了獲得試驗的最佳條件，分別對底液pH、底液H2O2濃度、tDNA的溫育時間、sDNA的溫育時間進(jìn)行優(yōu)化。底液pH影響HRP的活性，在tDNA濃度為1×10-12 mol/L，tDNA和sDNA溫育時間均為90 min時，在pH不同的底液條件下，對組裝電極AuNPs-HRP-SA/sDNA-tDNA/Thi-AuNPs-cDNA/NH3-MWCNTs/GCE進(jìn)行CV表征，如圖4a所示。當(dāng)pH為6.6～7.4時CV的還原峰電流逐漸增高，并在pH 7.4達(dá)到最高，之后峰電流逐漸降低，證明pH為7.4反應(yīng)體系的催化效果最好，因此選用pH為7.4的PBS緩沖溶液。

H2O2是HRP的反應(yīng)底物，其濃度大小影響催化電流的大小，對H2O2濃度進(jìn)行優(yōu)化的結(jié)果如圖4b所示。當(dāng)H2O2濃度達(dá)到1.5 mmol/L時，還原峰電流達(dá)到最大，并在之后基本保持恒定，因此選擇1.5 mmol/L作為底液H2O2濃度。

tDNA溫育時間、sDNA溫育時間的長短影響固定在電極表面的tDNA和sDNA的數(shù)量，進(jìn)而會影響AuNPs-HRP-SA的結(jié)合數(shù)量，最終影響峰電流的大小，因此在溫育溫度為37 ℃條件下分別對tDNA和sDNA的溫育時間進(jìn)行改變，并最終在含1.5 mmol/L H2O2的PBS緩沖液（pH 7.4）進(jìn)行CV測試，結(jié)果如圖4c～d所示。tDNA和sDNA溫育時間延長過程中還原峰電流不斷增強，并且分別在溫育時間90和60 min時電流達(dá)到峰值，表明這時電極捕獲的探針數(shù)量飽和，因此選擇tDNA雜交時間為90 min、sDNA雜交時間為60 min來構(gòu)建DNA傳感器。

2.4 電化學(xué)循環(huán)伏安法檢測目標(biāo)DNA

當(dāng)不同濃度tDNA與cDNA雜交后電極結(jié)合的HRP的數(shù)量會發(fā)生改變，進(jìn)而會影響反應(yīng)電流的大小，采用CV法對不同濃度的tDNA在優(yōu)化后的最佳反應(yīng)條件下進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖5所示，峰電流隨著目標(biāo)序列tDNA濃度的增加而增大，峰電流與tDNA濃度呈現(xiàn)正相關(guān)，校準(zhǔn)曲線（圖6）顯示了峰電流和分析物濃度的對數(shù)之間有著良好線性關(guān)系，在tDNA濃度1×10-18～1×10-15和1×10-15～1×10-11 mol/L分別獲得了標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性回歸方程分別為I= 0.146 logC+ 2.93（R2=0.990）、I=0.080 logC+ 1.91（R2= 0.983），在信噪比為3時，檢測限為6.95×10-20 mol/L。

2.5 傳感器的選擇性、重現(xiàn)性和穩(wěn)定性

為了研究該DNA生物傳感器對tDNA識別選擇性能，對1×10-12 mol/L的tDNA、Mis-1、Mis-3、N-DNA 這4種DNA序列分別進(jìn)行檢測。N-DNA的電流值與空白對照相近，Mis-1、Mis-3的峰電流值與tDNA相比下降了21.9%和66.4%，結(jié)果表明，與完全互補的tDNA序列相比，錯配堿基序列與捕獲探針的雜交效率降低顯著，因此得出該傳感方法有高選擇性。

試驗對該電化學(xué)DNA傳感器的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性進(jìn)行了研究，使用3根不同的GCE電極在tDNA濃度為1×10-12 mol/L條件下制備傳感器，對AuNPs-HRP-SA/sDNA-tDNA/Thi-AuNPs-cDNA/ NH3-MWCNTs/GCE組裝電極進(jìn)行CV法測試，得到3根電極的電信號之間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為6.1%，表明該傳感方法可進(jìn)行重復(fù)，且重復(fù)性好。為了研究傳感方法的穩(wěn)定性，將3根組裝完成的電極在4 ℃條件下放置7 d后進(jìn)行檢測，得到的響應(yīng)信號保持了原信號的96%，因

3 結(jié)論

該研究成功構(gòu)建了以NH3-WMCNTs為底層，Thi-AuNPs-cDNA納米復(fù)合物及AuNPs-HRP-SA復(fù)合物為信號放大分子的新型組合模式DNA傳感器，基于HRP對H2O2的催化還原實現(xiàn)特異識別并檢測花椰菜花葉病毒35S啟動子DNA序列，通過對試驗條件的優(yōu)化，在最佳試驗條件下，檢測限低至6.95×10-20 mol/L。該電化學(xué)傳感器簡便、靈敏度高、重現(xiàn)性及穩(wěn)定性好，在檢測轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品方面具有很好的應(yīng)用潛力。

參考文獻(xiàn)

[1] LI Y Q，SUN L，LIU Q，et al.Photoelectrochemical CaMV35S biosensor for discriminating transgenic from nontransgenic soybean based on SiO2@CdTe quantum dots coreshell nanoparticles as signal indicators[J].Talanta，2016，161（1）：211-218.

[2] AMOUZADEH TABRIZI M，SHAMSIPUR M.A labelfree electrochemical DNA biosensor based on covalent immobilization of salmonella DNA sequences on the nanoporous glassy carbon electrode[J].Biosensors and bioelectronics，2015，69：100-105.

[3] LIU X，SHUAI H L，LIU Y J，et al.An electrochemical biosensor for DNA detection based on tungsten disulfide/multiwalled carbon nanotube composites and hybridization chain reaction amplification[J].Sensors and actuators B，2016，235（1）：603-613.

[4] XIAO F，SONG J B，GAO H C，et al.Coating graphene paper with 2Dassembly of electrocatalytic nanoparticles：A modular approach toward highperformance flexible electrodes[J].ACS Nano，2012，6（1）：100-110.

[5] WANG D Y，HUANG B T，LIU J，et al.A novel electrochemical sensor based on Cu@Ni/MWCNTs nanocomposite for simultaneous determination of guanine and adenine[J].Biosensors and bioelectronics，2018，102（15）：389-395.

[6] PARVEEN S，PATHAK A，GUPTA B D.Fiber optic SPR nanosensor based on synergistic effects of CNT/Cunanoparticles composite for ultratrace sensing of nitrate[J].Sensors and actuators B，2017，246：910-919.

[7] 洪敏，朱進(jìn)，尹漢東.納米材料應(yīng)用于DNA檢測領(lǐng)域的研究進(jìn)展[J].分析化學(xué)，2011，39（1）：146-154.

[8] WALEKAR L S，PAWAR S P，GORE A H，et al.Surfactant stabilized AgNPs as a colorimetric probe for simple and selective detection of hypochlorite anion（ClO）in aqueous solution：environmental sample analysis[J].Colloids and surfaces A，2016，491：78-85.

[9] ZHANG J，YUAN Y L，SHUN B X，et al.Amplified amperometric aptasensor for selective detection of protein using catalasefunctional DNAPtNPs dendrimer as a synergetic signal amplification label[J].Biosensors and bioelectronics，2014，60：224-230.

[10] LI Y，WANG Q，ZHANG Y T，et al.A labelfree electrochemical aptasensor based on graphene oxide/doubiestranded DNA nanocompisite[J].Colloids and surfaces B，2016，145：160-166.

[11] YUAN Y H，CHI B Z，WEN S H，et al.Ratiometric electrochemical assay for sensitive detecting microRNA based on dualamplification mechanism of duplexspecific nuclease and hybridization chain reaction[J].Biosensors and bioelectronics，2018，102：211-216.

[12] ZHAO J，ZHANG Y Y，LI H T，et al.Ultrasensitive electrochemical aptasensor for thrombin based on the amplification of aptamerAuNPsHRP conjugates[J].Biosensors and bioelectronics，2011，26（5）：2297-2303.

[13] CAO X Y.Ultrasensitive electrochemical DNA biosensor based on signal amplification using gold nanoparticles modified with molybdenum disulfide，graphene and horseradish peroxidase[J].Microchim acta，2014，181（9/10）：1133-1141.

[14] DING Y H，ZHANG X M，LIU X X，et al.Adsorption characteristics of thionine on gold nanoparticles[J].Langmuir，2006，22（5）：2292-2298.

[15] LIU Y X，WANG W W，WEI H，et al.Simultaneous determination of dihydroxybenzene isomers based on thionine functionalized multiwall carbon nanotubes modified electrode [J].Journal of applied electrochemistry，2014，44（5）：667-674.