孔蘭芬　楊式華　楊盼盼

摘要[目的]建立以超高效液相色譜法（UPLC）測定檳榔提取液中檳榔堿含量的方法。[方法]采用Waters公司的ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）色譜柱，柱溫35 ℃，流動(dòng)相：乙腈-甲醇-0.1%冰醋酸溶液（每1 000 mL含磷酸二氫鉀0.6 g，十二烷基磺酸鈉1.0 g）=25∶20∶55，等度洗脫，進(jìn)樣量1.0 μL，流速0.2 mL/min，檢測波長215 nm。[結(jié)果]整個(gè)洗脫在5.0 min之內(nèi)完成，檳榔堿在2.0 min左右出峰，峰型較好，且檳榔堿在0.013～0.663 mg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.999 8，平均回收率為98.1%，RSD為2.26%（n=5）。[結(jié)論]該方法操作簡便、快速，靈敏度高，重復(fù)性好，可用于控制檳榔提取液及其制成方劑中檳榔堿的含量。

關(guān)鍵詞超高效液相色譜法；檳榔提取液；檳榔堿

中圖分類號(hào)R284.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611（2018）08-0177-02

Determination of Arecoline from Areca Nut Extract by Ultrahigh Performance Liquid Chromatography （UPLC）

KONG Lanfen， YANG Shihua， YANG Panpan et al（Yunnan Comtestor Co.， Ltd.，Kunming， Yunnan 650106）

Abstract[Objective] To establish a UPLC method for determination of arecoline in areca nut extract. [Method] The compound was determined by UPLC with WATERS ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm） column. The column temperature was set at 35.0 ℃. The mobile phase consisted of acetonitrile， methanol and 0.1% glacial acetic acid （containing 0.6 g potassium dihydrogen phosphate and 1.0 g twelve alkyl sodium sulfonate per 1 000 mL solution）（25∶20∶55）， with isocratic elution at the flow rate of 0.2 mL/min. The sample volume was 1.0 μL. The determination wavelength was 215 nm. [Result] The whole elution was completed in 5.0 min. The better peak of arecoline appeared in about 2.0 min and there was a good linear range between 0.013-0.663 mg/mL. The correlation coefficient was 0.999 8 with the average recovery rate of the method was 98.1%， RSD =2.26%（n=5）. [Conclusion] The proposed method had the advantages of easy operation， rapid， high sensitivity and reproducible for the content control of arecoline in areca nut extract and its preparation.

Key wordsUltrahigh performance liquid chromatography（UPLC）；Areca nut extract；Arecoline

作者簡介孔蘭芬（1984—），女，云南建水人，工程師，碩士，從事醫(yī)藥品、食品等分析研究。*通訊作者，副研究員，博士，從事分析化學(xué)研究。

收稿日期2017-12-25；修回日期2018-01-05

檳榔屬于棕櫚科植物類，具有殺蟲消積、降氣、行水、截瘧等功效，其主要的有效成分為檳榔堿（Arecoline），檳榔堿的化學(xué)名為N-甲基-1，2，5，6-四氫煙酸甲酯，其具有一定毒性[1]，且性質(zhì)并不十分穩(wěn)定，所以檳榔及其制成方劑中檳榔堿含量有必要得到更好的控制。目前，測定檳榔堿含量的方法主要有酸堿滴定法[2]、薄層色譜法[3]、毛細(xì)管電泳法[4]、分光光度法[5]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀[6]、陽離子交換色譜法[7-8]、反相高效液相色譜法[9-14]及高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[15-16]等，鮮見有用UPLC法來測定的報(bào)道。筆者采用UPLC法考察了色譜條件和定量的線性范圍，并對(duì)檳榔堿進(jìn)行含量測定，以期為今后測定并控制檳榔及其制成方劑中檳榔堿含量提供參考。

1材料與方法

1.1儀器與試藥

1.1.1

儀器。ACQUITY UPLC超高效液相色譜系統(tǒng)，配ACQUITY PDA檢測器，Empower色譜工作站（Waters公司）；電子天平（Mettler Toledo New Classic MF）。

1.1.2

試藥。氫溴酸檳榔堿對(duì)照品（百靈威科技有限公司，含量≥98.0%）；檳榔提取液（云南某有限公司）。乙腈、甲醇為色譜純（DIMA公司），磷酸二氫鉀為分析純（廣東汕頭市西隴化工廠，含量≥99.0%），十二烷基磺酸鈉為優(yōu)級(jí)純（西亞試劑，含量≥99.0%），冰醋酸為分析純（西隴化工股份有限公司，含量≥99.5%），無水乙醇（西隴化工股份有限公司，含量≥99.8%）。

1.2方法

1.2.1

色譜條件。色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）分析柱，流動(dòng)相為乙腈-甲醇-0.1%冰醋酸溶液（每1 000 mL含磷酸二氫鉀0.6 g、十二烷基磺酸鈉1.0 g）=25∶20∶55，進(jìn)樣量1.0 μL，流速0.2 mL/min，柱溫35.0 ℃，檢測波長215 nm，分析時(shí)間5.0 min。

1.2.2

對(duì)照品溶液的制備。精密稱取氫溴酸檳榔堿對(duì)照品10.3 mg，置于10 mL容量瓶中，加無水乙醇溶解且定容至刻度，搖勻，制成每1 mL含檳榔堿663.46 μg的儲(chǔ)備溶液。

1.2.3

供試品溶液的制備。精密移取檳榔堿提取液0.5 mL于50 mL容量瓶中，加無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，去續(xù)濾液，即得。

2結(jié)果與分析

2.1線性關(guān)系考察

使用梯度稀釋方法配制1/2、1/5、1/10、1/20、1/50儲(chǔ)備液濃度的校準(zhǔn)溶液，使用UPLC測定并制作工作曲線，以檳榔堿峰面積與對(duì)應(yīng)的濃度做線性回歸，得到線性回歸方程（Y=1.65e+007x+1.52e+005），相關(guān)系數(shù)（0.999 8），線性范圍0.013～0.663 mg/mL。由此可見，該方法具有良好的線性關(guān)系，滿足樣品的定量測定。此外，對(duì)照品及供試品溶液的色譜圖見圖1。

2.2精密度試驗(yàn)

精密吸取濃度為331.73 μg/mL的氫溴酸檳榔堿對(duì)照品溶液連續(xù)進(jìn)樣5次，每次1.0 μL，測得氫溴酸檳榔堿峰面積平均值為5 796 852 μV·s，峰面積的RSD值為0.17%，表明氫溴酸檳榔堿進(jìn)樣精密度良好。

2.3穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一批樣品的供試品溶液分別在0、2、4、6、8、16、20、24 h進(jìn)樣1.0 μL，按上述色譜條件測定，峰面積的RSD值為0.30 %，表明供試品溶液至少在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批樣品的供試品溶液5份，平行測定，進(jìn)樣量為1.0 μL，檳榔堿含量為0.115、0.114、0.115、0.115、0.116 mg/mL，平均含量為0.115 mg/mL，含量的RSD值為0.61%，表明該方法重復(fù)性較好。

2.5回收率試驗(yàn)

稱取同一批樣品的檳榔提取液0.5 mL于50 mL容量瓶中（5份），分別加入對(duì)照品儲(chǔ)備液1.5 mL，再加無水乙醇稀釋至刻度，搖勻，濾過，去續(xù)濾液，精密吸取1.0 μL，按照“2.1”色譜條件測定，得平均回收率為98.1 %，RSD值為2.26%（表1）。

2.6樣品測定

分別精密吸取供試品溶液1.0 μL，注入U(xiǎn)PLC，測定，記錄峰面積，計(jì)算含量，結(jié)果3批樣品的含量，分別為0.115、0.120、0.118 mg/mL。

3結(jié)論與討論

3.1不同儀器對(duì)比

分別取同一對(duì)照品在HPLC（Agilent 1260）及UPLC（ACQUITY HClass）上試驗(yàn)，色譜條件除色譜柱型號(hào)及規(guī)格不同外，其余條件相同。HPLC中是以Symmetry C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）為分析柱，15.224 min出峰，總分析時(shí)間為30 min，與“2.1”相比，分析時(shí)間增加6.0倍，表明HPLC及UPLC在相同條件下檢測檳榔提取液中的檳榔堿時(shí)，UPLC在準(zhǔn)確、快速方面顯示出更大的優(yōu)勢。

3.2不同流動(dòng)相選擇

經(jīng)查閱相關(guān)資料[16-17]，選擇①乙腈-0.5%甲酸溶液（50∶50或10∶90）；②乙腈-甲醇-0.5%甲酸溶液（20∶35∶45）；③乙腈-0.1%冰醋酸溶液（每1 000 mL含磷酸二氫鉀0.6 g，十二烷基磺酸鈉1.0 g）（42∶58）或（80∶20）為流動(dòng)相時(shí)，結(jié)果檳榔堿在8 min以內(nèi)均未出峰；④選擇甲醇-0.1%冰醋酸溶液（每1 000 mL含磷酸二氫鉀0.6 g、十二烷基磺酸鈉1.0 g）（48∶52）或（55∶45）為流動(dòng)相，結(jié)果檳榔堿在4 min及2.2 min以內(nèi)出峰，但峰型及峰純度較差，峰內(nèi)包含了2個(gè)物質(zhì)的信息；⑤選擇乙腈-甲醇-0.1%冰醋酸溶液（每1 000 mL含磷酸二氫鉀0.6 g，十二烷基磺酸鈉1.0 g）（15∶30∶55）為流動(dòng)相，3.2 min出峰，但基線不平穩(wěn)，且拖尾。經(jīng)反復(fù)試驗(yàn)，確定該試驗(yàn)的色譜條件，檳榔堿在2.0 min左右出峰，峰型較好，拖尾明顯改善。從上述各種條件嘗試后還得出，隨著甲醇比例的加大，出峰時(shí)間會(huì)相應(yīng)提前，加入一定量的乙腈，有利于改善峰型。

采用該法測定檳榔提取液中的檳榔堿含量，分析時(shí)間為5.0 min，與HPLC法相比，該法操作簡便、快速，靈敏度高，重復(fù)性好，為今后測定并控制檳榔及其制成方劑中檳榔堿的含量提供參考。

參考文獻(xiàn)

[1] 柯銘清.中草藥有效成分理化與藥理特性[M].長沙：湖南科學(xué)技術(shù)出版社，1992：426.

[2] 國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典：2005年一版[S].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：254.

[3] 林勵(lì)，徐鴻華，鄧沛峰，等.檳榔中檳榔堿含量的薄層掃描測定[J].中國中藥雜志，1992，17（8）：491-492.

[4] 袁煒，呂建德，傅小蕓.檳榔中檳榔堿和檳榔次堿的毛細(xì)管電泳分析[J].分析化學(xué)，2000，28（6）：749-752.

[5] 高敏，高淑芹.光度法測定檳榔中檳榔堿的含量[J].化學(xué)分析計(jì)量，2003，12（1）：28-30.

[6] 陳妤，閆曉楠.藿香正氣軟膠囊中檳榔堿的限量檢查方法研究[J].天津藥學(xué)，2017，29（5）：21-23.