許永　孔維松　王晉　黃海濤　劉欣　李雪梅　楊葉昆　向明　田麗梅　李晶

摘要[目的]采用超高效液相色譜法測定卷煙主流煙氣中的7種酚類物質(zhì)。[方法]卷煙主流煙氣中的酚類用劍橋濾片捕集，然后用自主設(shè)計的新型樣品前處理裝置以1%乙酸超聲提取，萃取液采用ACQUITYUPLCBEHC₁₈色譜柱（50mm×2.1mm，1.7μm）分離，以1%乙酸（內(nèi)含0.01moL/LB-CD）和70%乙腈（內(nèi)含1%乙酸和0.01moL/LB-CD）為流動相進行梯度洗脫，卷煙主流煙氣中的主要7種酚類物質(zhì)在5.0min內(nèi)可達到基線分離。[結(jié)果]采用新的樣品前處理裝置可以有效簡化前處理步驟，提高分析效率；7種酚類物質(zhì)在濃度為0.02～25.00μg/mL時具有較好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)>0.99900；檢出限為2.5～6.5μg/L；在不同添加水平下，平均回收率為93.8%～98.5%，日內(nèi)精密度和日間精密度考察均小于5%，具有較好的重復(fù)性。[結(jié)論]該方法能較好地應(yīng)用于卷煙主流煙氣中7種酚類物質(zhì)的測定。

關(guān)鍵詞 卷煙；主流煙氣；酚類；超高效液相色譜法（UPLC）；新型前處理裝置

中圖分類號 0657.7⁺2；TS41⁺1 文獻標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2018）11-0157-04

簡單酚類化合物（苯酚、苯二酚、甲基苯酚等）是卷煙主流煙氣中的一類重要有害成分，它們不但有較難聞的氣味，很難被掩蓋，對卷煙感觀評吸產(chǎn)生不良影響，而且還對皮膚及呼吸道黏膜有強烈的刺激作用和致癌作用。該類化合物被加拿大政府列入46種有害成分名單，并被世界衛(wèi)生組織（WHO）“煙草制品管制研究小組”列為建議的管制成分清單。因此準確測定卷煙主流煙氣中酚類物質(zhì)對于降低卷煙中的有害成分，提高卷煙的抽吸品質(zhì)十分重要。

主流煙氣中酚類物質(zhì)的測定已有較多報道，主要有液相色譜法、氣相色譜法、連續(xù)流動分析法、分光光度法等。用連續(xù)流動分析法和分光光度法只能測定酚類的總量，而采用氣相色譜直接測定時峰形易拖尾，一般需要用衍生化。液相色譜法由于分離效率高，選擇性好，檢測靈敏度高，操作自動化，在簡單酚類化合物分析中得到了廣泛應(yīng)用。按照我國煙草行業(yè)標(biāo)準YC/T255-2008，采用高效液相色譜法測定卷煙主流煙氣中的酚，方法色譜分離時間長，每個樣品需要40min以上，不能滿足樣品快速測定的要求。

為了尋找更簡便、快速的分析方法，筆者采用超高效液相色譜法縮短了樣品分析時間，并通過自主設(shè)計的樣品萃取瓶，簡化樣品前處理流程，使樣品前處理周期明顯縮短。改進方法和目前常規(guī)液相色譜分析方法相比，日樣品分析量明顯提高。該方法的建立為卷煙主流煙氣中酚類化合物的測定提供了快速、準確、可靠的高通量分析方法。

1材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1主要材料。市售卷煙5種，購自昆明市某超市。

1.1.2主要試劑。鄰甲酚、間甲酚、對甲酚、鄰苯二酚、間苯二酚、對苯二酚和苯酚標(biāo)準品（純度>99%，購自瑞士Fluka公司）；β-環(huán)糊精（β-CD，分析純，購自上海國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；乙腈（HPLC級，購自Merk公司）；乙酸（分析純，購自上海國藥集團化學(xué)試劑有限公司）。

無酚蒸餾水：每升水中加入1g硫酸銅，用石英亞沸蒸餾器重蒸，并用Millipore-Q50超純水儀（美國Millipore公司）處理。

1.1.3主要儀器。SM400直線型吸煙機（英國斯茹林公司）；WatersAcQUITY超高效液相色譜系統(tǒng)，包括二元梯度泵，Empower色譜工作站，熒光檢測器（美國waters公司）；AE240電子分析天平（精確至0.0001g，Mettler公司）；電熱恒溫超聲波水浴鍋（常州諾基儀器有限公司）；Millipore-Q50超純水儀（美國Millipore公司）。

1.2方法

1.2.1樣品前處理裝置。試驗設(shè)計的新型樣品前處理裝置結(jié)構(gòu)見圖1，裝置由帶密封圈的外套管（圖1a）和帶0.45μm過濾篩板的內(nèi)套管（圖1b）組成。樣品提取狀態(tài)為圖lc，樣品過濾及轉(zhuǎn)移狀態(tài)為圖1d。

1.2.2標(biāo)準溶液配制。分別準確稱取50mg的7種酚類化合物于50mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容，得1.0mg/mL的7種酚類標(biāo)準儲備液，儲備液在4℃下避光保存。使用時分別取1.0mL儲備液于10mL容量瓶中，用乙腈定容，得O.1mg/mL的酚類混合標(biāo)準溶液，用該混合標(biāo)準溶液逐級稀釋成所需濃度的標(biāo)準工作液。

1.2.3色譜條件。色譜柱：ACQUITYUPLCBEHC₁₈色譜柱（50mm×2.1mm，1.7μm）；柱溫30℃；柱流速0.5mL/min；進樣量5.0μL；流動相A：1%的乙酸水溶液（內(nèi)含0.01mol/LB-CD）；流動相B：70%的乙腈（內(nèi)含1%的乙酸和0.01mol/LB-CD）；洗脫梯度：0～1.5min，10%B；>1.5～3.0min，10%～40%B；>3.0～4.5min，40%～80%B；>4.5～5.0min，80%B；>5.0～5.5min，10%B；>5.5～7.5min，10%B。

采用熒光檢測器程序波長檢測，檢測波長（激發(fā)波長/發(fā)射波長，mm）為0～1.5min，284/332nm；>1.5～2.0min，275/315nm；>2.0～2.8min，277/319nm；>2.8～3.8min，272/309nm；>3.8～6.0min，273/323nm。采用比較標(biāo)樣與樣品的熒光光譜色譜峰保留時間法定性，外標(biāo)法定量。

1.2.4試驗設(shè)計。每種卷煙樣品取1條，在GB/T16447規(guī)定的條件下進行平衡，參照文獻用SM400直線型吸煙機按照標(biāo)準GB/T19609-2004規(guī)定的條件抽吸卷煙，每個孔道抽吸4支煙，用44mm劍橋濾片捕集卷煙主流煙氣。吸煙完畢，空吸一口空氣后，取出濾片。

將裝置放到固定架上，并將劍橋濾片置于外套管中（圖1a），用50mL移液槍在裝有樣品的套管中加入50mL1%的乙酸水溶液，然后把內(nèi)套管卡在外套管的口部（圖1c）。裝好后將固定架放到恒溫超聲波水浴鍋中超聲萃取25min。萃取完后把內(nèi)套管向下壓，萃取溶液通過過濾篩板進入到內(nèi)套管中，并從內(nèi)套管中的細彎管流出，達到樣品過濾的效果（圖1d）。從細彎管口收集萃取液，棄去最初的2.0～3.0mL，然后用色譜進樣瓶直接收集1.0～1.5mL的樣品萃取液，供液相色譜分析。

2結(jié)果與分析

2.1樣品前處理 試驗參照YC/T255-2008的方法，每個44mm劍橋濾片抽吸4支卷煙，用50mL1%的乙酸水溶液超聲萃取。試驗結(jié)果表明，超聲萃取20min左右7種酚類化合物可萃取完全，收集殘渣再萃取1次，已經(jīng)沒有酚類化合物檢出，延長超聲萃取時間對酚類化合物的測定結(jié)果沒有影響，該試驗選擇超聲萃取25min。

為了進一步減少樣品前處理環(huán)節(jié)，該研究設(shè)計了樣品前處理裝置（圖1），該裝置由帶密封圈的外套管（圖la）和帶0.45μm過濾篩板的內(nèi)套管（圖1b）組成。在外套管中加入劍橋濾片（圖1a），然后加入萃取溶劑（1%乙酸水溶液）。把內(nèi)套管卡在外套管的口部（圖1c），可防止樣品萃取過程中萃取溶液濺出或超聲水浴鍋中的水濺入。裝好后將裝置放到超聲波水浴鍋中超聲萃取，萃取完后將萃取瓶的內(nèi)套管向下壓，萃取溶液就通過過濾篩板進入到內(nèi)套管中，并從內(nèi)套管中的細彎管流出，用色譜進樣瓶從細彎管口部收集流出的萃取溶液，可直接進行液相色譜分析。

整個樣品前處理過程中不需要樣品轉(zhuǎn)移就能得到過濾好的待分析樣品，前處理操作得到簡化。試驗操作過程中樣品前處理步驟得到簡化，有可能會增加引入誤差的環(huán)節(jié)也會相應(yīng)減少，分析結(jié)果的精密度也會提高。另外，按常規(guī)方法進行樣品前處理操作，用針頭過濾器過濾，超聲過程中產(chǎn)生的劍橋濾片碎屑會堵塞過濾頭，過濾速度較慢。而在改進的處理方法中，超聲萃取完成后稍加放置，劍橋濾片碎屑就沉到底下，過濾時內(nèi)套管中的篩板只與上層清液接觸，這樣可有效避免過濾過程中的篩板堵塞，過濾速度更快，過濾操作更容易實現(xiàn)。

2.2色譜條件優(yōu)化 為了縮短分析時間，該試驗通過超高效液相色譜分析，采用ACQUITYUPLCBEHC₁₈色譜柱（50mm×2.1mm，1.7μm）分離7種酚類化合物，參照YC/T255--2008的流動相條件，對甲酚和問甲酚無法實現(xiàn)分離。根據(jù)文獻報道，對甲酚、間甲酚和鄰甲酚與β-環(huán)糊精（β-CD）空腔的契合程度不同，所形成的包結(jié)物穩(wěn)定性不同，會導(dǎo)致保留時間有更大差異，可將甲酚異構(gòu)體分離。該試驗參照文獻的方法，在流動相中添加β-CD，使鄰、對、間甲酚達到分離。用1%乙酸（內(nèi)含0.01mol/Lβ-CD）和70%乙腈（內(nèi)含1%乙酸和0.01mol/Lβ-CD）為流動相，試驗結(jié)果表明，A為1%乙酸，B為70%乙腈，按0～1.5min，10%B；>1.5～3.0min，10%～40%B；>3.0～4.5min，40%B～80%B；>4.5～5.0min，80%B；>5.0～5.5min，10%B；>5.5～7.5min，10%B梯度條件，7種酚類化合物均可達到基線分離且分離時間短，因此試驗優(yōu)選該流動相條件進行色譜分離。

采用熒光檢測器檢測，不同的酚類化合物具有不同的激發(fā)波長和發(fā)射波長，對苯二酚激發(fā)波長284nm，發(fā)射波長332nm；間苯二酚激發(fā)波長275nm，發(fā)射波長315nm；鄰苯二酚激發(fā)波長277nm，發(fā)射波長319nm；苯酚激發(fā)波K272nm，發(fā)射波長309nm；對甲酚、間甲酚、鄰甲酚激發(fā)波長273nm，發(fā)射波長323nm。試驗參照YC/T255-2008采用程序波長檢測，選擇的檢測波長（激發(fā)波影發(fā)射波長，nm）為0～1.5min，284/332nm；>1.5～2.0min，275/315nm；>2.0～2.8min，277/319nm；>2.8～3.8min，272/309nm；>3.8～6.0min，273/323nm。

2.3方法的線性關(guān)系和檢出限 分別配制不同濃度酚類化合物的標(biāo)準溶液，在選定試驗條件下進行色譜進樣，圖2為7種酚類物質(zhì)的標(biāo)準色譜圖。從圖2可看出，各待測組分均達到了基線分離，而且色譜峰對稱性好，無明顯拖尾。包括回到起始梯度和平衡時間在內(nèi)，整個樣品色譜分析時間只需7.5min，與YC/T255-2008方法相比分離時間縮短至1/5。

根據(jù)不同濃度的峰面積，計算出回歸方程，根據(jù)信噪比S/N=3計算檢測限，根據(jù)信噪比S/N=10計算定量限，結(jié)果見表1。

2.4加標(biāo)回收率及方法精密度 取相同卷煙2份，其中1份作為空白，另外1份加入已知量酚類物質(zhì)的標(biāo)樣（2.5、10.0、40.0μg），另1份不加，通過加標(biāo)樣品測出量減去未加標(biāo)樣品測出量再除以標(biāo)準加入量計算回收率，結(jié)果見表2。從表2可以看出，方法的回收率為93.8%～98.5%，說明方法具有很高的回收率。取3個不同卷煙樣品，按選定試驗條件在同一天內(nèi)和不同天內(nèi)分別平行測定7次，計算7次平行測定結(jié)果的相對標(biāo)準偏差。結(jié)果表明7種酚類物質(zhì)測定結(jié)果的日內(nèi)精密度RSD為1.4%～2.5%，日間精密度RSD為1.8%～3.3%，說明方法精密度好，可以應(yīng)用于主流煙氣中酚類物質(zhì)的檢測。

2.5實際樣品分析 選擇不同類型的5個卷煙樣品，按選定試驗條件進行測定，圖3為某個實際樣品色譜圖。實驗室方法結(jié)果與煙草行業(yè)標(biāo)準YC/T255-2008的分析結(jié)果比較見表3。從表3可以看出，5個樣品中7種酚類化合物的分析結(jié)果均和煙草行業(yè)標(biāo)準的測定結(jié)果相符合。說明該方法測定結(jié)果準確，可以應(yīng)用于實際樣品檢測，相較于行業(yè)標(biāo)準檢測效率明顯提高。

3結(jié)論

該研究針對目前煙草行業(yè)標(biāo)準測定卷煙主流煙氣中的酚類化合物分析周期長的特點，對超高效液相色譜技術(shù)在卷煙煙氣酚類化合物分析中的應(yīng)用進行了研究。研究通過自主設(shè)計的樣品前處理裝置，明顯簡化了樣品前處理操作，使樣品前處理周期有效縮短，改進方法和目前行業(yè)標(biāo)準相比，日樣品分析量可提高5倍以上；色譜分離方面，實現(xiàn)了煙草中的7種酚類物質(zhì)在5min內(nèi)完全分離，提高了樣品分析效率。該方法的建立為卷煙主流煙氣中酚類化合物的測定提供了快速、準確、可靠的高通量分析方法。