陳興　楊瑩　李珊輝

摘要[目的]研究卷煙加工及儲存過程中細菌群落結(jié)構(gòu)以及多樣性的變化。[方法]采用二代高通量測序平臺，以云煙（軟珍，R）不同制絲工藝的加工工序及儲存過程的煙葉表面微生物為研究對象，對其進行16S rRNA 基因高通量測序。[結(jié)果] 盡管不同制絲工藝在相同加工工序中微生物群落豐富度不盡相同，但主要高豐富度微生物類群的種類比較一致；此外，煙葉在不同城市的不同儲存時間下，微生物類群的變化具有類似的趨勢。[結(jié)論]該研究對從微生物角度改進煙葉制絲工藝具有一定的借鑒意義，同時表明煙葉的儲存時間可能是影響微生物后期群落發(fā)生變化的主要因素。

關鍵詞制絲工藝；高通量測序；微生物群落結(jié)構(gòu)；煙葉品質(zhì)

中圖分類號TS452文獻標識碼

A文章編號0517-6611（2018）08-0015-04

Effects of Cigarette Processing and Storage Process on Bacterial Community Structure

CHEN Xing1，YANG Ying1，LI Shanhui2，3 et al（1.Technology Center，China Tobacco Yunnan Industrial Co.，Ltd.，Kunming，Yunnan 650231；2.School of Life Science，Sun YatSen University，Guangzhou ，Guangdong 510275；3.Yunnan Institute of Microbiology，Yunnan University，Kunming ，Yunnan 650091）

Abstract[Objective]In order to study the changes of bacterial community structure and diversity in cigarette processing and storage process [Method]The two generation highthroughput sequencing platforms were used to study the processing technology of Yunyan tobacco （R） and the surface microorganism of tobacco leaves during storage.The 16S rRNA gene was sequenced by highthroughput sequencing.[Result]Although different technics in the same processing in the process of microbial community richness was not the same，but the main types of high richness microbial communities were consistent.In addition，the results also showed that the storage time of tobacco leaves could be the main factor affecting the changing of microbial community rather than the cities where they storage.[Conclusion]The study has a certain reference significance for improving tobacco processing technology from microorganism angle.Meanwhile，it indicates that the storage time of tobacco leaves may be the main factor that affects the later stage of microbial community.

Key wordsCigarette processing；Highthroughput sequencing；Microbial community structure；Tobacco quality

卷煙是用特定的技術和設備將煙草原料和輔助材料加工制作成消費者可吸食商品的過程。根據(jù)煙葉原料的性質(zhì)，卷煙生產(chǎn)的工藝流程是通過各種加工方法或設備逐步把煙葉原料和其他輔助材料制成合格卷煙產(chǎn)品所必須經(jīng)過的加工制造過程。該流程包括的主要工藝除制絲外，還包括卷接和包裝。有研究表明，煙葉在生長和調(diào)制過程中均有微生物在煙葉上生長，其微生物種類和數(shù)量會隨著煙葉品種、產(chǎn)地、等級、調(diào)制方式的不同而存在一定差異。對于煙葉表面微生物群落的研究始于1933 年，Reid等[1]首次發(fā)現(xiàn)雪茄煙葉表面具有大量的細菌和霉菌，其主要的細菌類群是巨大芽孢桿菌，而主要的霉菌類群為曲霉和青霉。Tamayo等[2]從西班牙煙葉中分離出的微生物主要是球菌和芽孢桿菌。謝和等[3]從烤煙中分離到了放線菌、細菌和霉菌，但未發(fā)現(xiàn)酵母菌。邱立友等[4]的研究發(fā)現(xiàn)，烤煙NC89在自然醇化過程中煙葉表面存在著占有絕對優(yōu)勢的細菌和數(shù)量較少的霉菌和放線菌。王革等[5]在國內(nèi)初次從自然發(fā)酵的煙葉上分離到酵母菌。研究結(jié)果均表明，發(fā)酵煙葉表面微生物群落的多樣性較豐富，盡管細菌、霉菌和酵母菌等均有存在，但以細菌群落為主，且細菌中的芽孢桿菌所占的豐富度較高。煙葉品質(zhì)發(fā)生復雜變化的主要特征是煙葉中化合物的分解與轉(zhuǎn)化，其中影響煙葉香氣和吸味品質(zhì)的重要過程是將不具備香味特性的大分子物質(zhì)，如氨基酸、蛋白質(zhì)、高級脂肪酸、纖維素、還原性糖和煙堿等化合物，轉(zhuǎn)化為各種揮發(fā)性酸或揮發(fā)性香氣成分的小分子化合物[6]。此過程中，微生物在煙葉品質(zhì)和口味的改變過程中發(fā)揮著舉足輕重的作用。然而，對于煙葉加工及儲存運輸過程煙葉表面微生物多樣性研究較少，這就使得實際工業(yè)應用中缺乏科學依據(jù)。

筆者通過高通量測序技術，以卷煙加工及儲存中的不同過程下的細菌群落為研究對象，對其組成及變化進行研究，以期通過對烤煙煙葉表面微生物進行全面、系統(tǒng)的認知，充分了解煙葉品質(zhì)變化過程中烤煙煙葉表面微生物群落結(jié)構(gòu)的變化，從而認知微生物群落變化與煙葉品質(zhì)改變之間的關系，為煙葉品質(zhì)的調(diào)控和微生物資源的挖掘提供科學指導。

1材料與方法

1.1材料及設計

該試驗所用到的云煙（軟珍，代號R）卷煙由云南中煙工業(yè)有限責任公司提供。根據(jù)制絲工藝的不同，分為薄板模塊（代號B）和氣流模塊（代號Q），所有樣品均來自這2個卷煙制絲工藝的各個加工工序，樣品信息如表1所示。

表1中原料煙葉（代號01）是指陳化完成后待加工的片狀煙葉，片狀煙葉經(jīng)過長時間的陳化過程被擠壓成塊狀，這個時期的煙葉水分含量較少。在松散回潮工序（代號02）中，煙葉在加入水蒸氣后充分吸收水分而變得松軟，然后通過機械的方式把結(jié)成塊狀的煙葉抖散，煙葉充分分散之后開始進入加料工序。制絲過程中加料分2次進行（一加入口，代號03；一加出口，代號04；二加入口，代號05；二加出口，代號06），料液的加入使煙葉的耐加工性能和感官品質(zhì)提高。儲存柜的作用是待加料工序完成后，煙葉在儲柜中儲存，使料液和煙葉充分作用。煙葉從櫥柜取出后（代號07），煙葉經(jīng)過切絲工序后進入烘絲工序。烘絲完成后（代號08），再經(jīng)過冷卻后（代號09），最終進入添加香精香料的加香工序。

研究所用R牌號卷煙的儲存方式根據(jù)城市的不同和放置時間的不同進行取樣，并以剛剛包裝成型的卷煙產(chǎn)品作為對照，具體樣品信息如Rcontrol*（對照），RM01*、RM02*、RM03、RM04、RM05、RW01*、RW02*、RW03、RW04、RW05、RH01、RH02*、RH03、RH04、RH05、RK01、RK02*、RK03、RK04、RK05。樣品制備和采集時均帶一次性無菌聚乙烯（PE）手套進行操作，取樣完成后，立即用無菌封口袋包扎密封，放入-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

對于不同城市放置不同時間的未拆封卷煙產(chǎn)品樣品分別來自牡丹江市（代號M）、烏魯木齊市（代號W）、?？谑校ù朒）和昆明市（代號K），在各個城市的放置時間分別為7 d（代號01）、30 d（代號02）、120 d（代號03）、180 d（代號04）和360 d（代號05），“*”代表樣品是由Roche 454 GS FLX+平臺進行測序，而其余樣品在Illumina Miseq平臺下測序。

1.2方法

1.2.1樣品表面微生物的收集及宏基因組DNA的提取。

參考2009年Zhao等煙葉表面微生物的收集方法[7]，根據(jù)煙葉的實際情況作了部分改良，且所有步驟均保證在無菌條件下進行。DNA的提取采用土壤DNA提取試劑盒（PowerSoil DNA Isolation kit，code：12888-100）對收集的各個煙葉表面微生物樣品進行DNA提取，提取過程參照試劑盒的操作說明進行了相關優(yōu)化[8]。

1.2.216S rRNA基因PCR擴增及測序。

該研究中，所有PCR擴增引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司提供。對于Roche 454 GS FLX+平臺測序的樣品，采用融合barcode序列的V6F3引物（5′CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGbarcodeTGCAACGCGAAGAACCTTACC3′）和V8R2引物（5′CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGGCCCGGGAACGTATTCACCG3′）進行擴增。PCR反應體系包括：10×PCR buffer 5.0 μL；dNTP（10 mmol/L each） 0.5 μL；Genomic DNA 10 ng；BarPCR primer F（50 μmol/L） 0.5 μL；Primer R （50 μmol/L）0.5 μL；Plantium Taq（5 U/μL） 0.5 μL；ddH2O加至50.0 μL。

反應條件如下所示： 94 ℃、3 min；94 ℃、30 s，45 ℃、20 s，65 ℃、30 s，5個循環(huán)；94 ℃、20 s，55 ℃、20 s，72 ℃、30 s，20個循環(huán)；72 ℃、5 min；10 ℃、 ∞。

對于在Illumina Miseq 300PE平臺測序的樣品，采用融合barcode序列的引物341F（5′CCTACACGACGCTCTTCCGATCTNbarcodeCCTACGGGNGGCWGCAG3′）和805R（5′GACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCAGACTACHVGGGTATCTAATCC3′）。PCR反應體系包括：10×PCR buffer 5.0 μL；dNTP（10 mmol/L each） 0.5 μL；Genomic DNA 10 ng；BarPCR primer F（50 μmol/L）1.0 μL；Primer R （50 μmol/L）1.0 μL；Plantium Taq（5 U/μL）0.5 μL；ddH2O加至50.0 μL。

反應條件如下所示： 94 ℃、30 s；94 ℃、20 s，45 ℃、20 s，65 ℃、60 s，5個循環(huán)；94 ℃、20 s，55 ℃、20 s，72 ℃、20 s，20個循環(huán)；72 ℃、5 min；10 ℃、∞。

PCR產(chǎn)物檢測后，采用生工瓊脂糖回收試劑盒（code： SK8131）對DNA進行純化回收，由生工生物工程（上海）股份有限公司進行16S rRNA基因高通量測序。

1.2.3數(shù)據(jù)分析。

該研究中Roche 454 GS FLX+平臺和Illumina Miseq 300PE平臺測序所得的序列主要通過QIIME[9]軟件來進行分析。采用QIIME中的“split_libraries.py”命令根據(jù)barcode序列對樣品進行區(qū)分，并刪除低質(zhì)量序列：①序列長度小于200或大于1 000個堿基；②序列中存在6個及以上的模糊堿基；③測序時Q值的平均值低于25；④序列中存在的單堿基重復超過6個；⑤前端的barcode序列有1個及以上堿基的錯配；⑥引物序列有1個及1個以上堿基錯配。高質(zhì)量序列通過uclust[10]的方法在97%相似度的水平上對所有樣品進行OTU劃分，并選取代表序列利用blast[11]方法與Greengenes[12]數(shù)據(jù)庫比對，獲得分類學信息。

2結(jié)果與分析

2.1卷煙加工過程中細菌群落的結(jié)構(gòu)分析

2.1.1薄板制絲工藝中細菌群落的組成及變化。

在云煙（軟珍）薄板制絲工藝各加工工序樣品（RB01～09）中，共獲得高質(zhì)量序列95 603條，平均每個樣品包含10 622條有效序列。所有序列共被注釋到了包含12個已知的菌門在內(nèi)的16個菌門中（圖1），其中包括以厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）和藍藻菌門（Cyanobacteria）為主要豐富度的微生物類群，還包括擬桿菌門（Bacteroidetes）、酸桿菌門（Acidobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）、異常球菌-棲熱菌門（DeinococcusThermus）、梭桿菌門（Fusobacteria）、硝化螺旋菌門（Nitrospira）、螺旋體門（Spirochaetes）和疣微菌門（Verrucomicrobia），此外，還有3個分類地位不明確類群（OD1、OP10和TM7）以及未被分類類群（Unclassified bacteria）。在12個已知門類的微生物類群中，厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）和藍藻菌門（Cyanobacteria）的平均序列量分別占到云煙（軟珍）薄板制絲工藝各加工工藝所有樣品細菌類群的總注釋序列量的59.2%、24.9%、6.5%和8.8%?？梢?，厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）這2個菌門在煙葉處理過程的細菌群落結(jié)構(gòu)組成中為主要優(yōu)勢類群。對比薄板制絲工藝不同階段的優(yōu)勢菌門相對豐度的變化，結(jié)果表明，隨著薄板制絲工藝加工過程的不同，細菌群落的組成豐度也顯著變化，變形菌門（Proteobacteria）、藍藻菌門（Cyanobacteria）和放線菌門（Actinobacteria）的相對豐度大體呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，而厚壁菌門（Firmicutes）卻呈現(xiàn)出先減少后增加的趨勢。

2.1.2氣流制絲工藝中細菌群落的組成及變化。

在云煙（軟珍）氣流制絲工藝各加工工序樣品（RQ01～09）中，共獲得高質(zhì)量序列113 995條，平均每個樣品包含12 666條有效序列。所有序列共被注釋到了包括21個已知的菌門中（圖2），主要包括優(yōu)勢門類：變形菌門（Proteobacteria）、藍藻菌門（Cyanobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、放線菌門（Actinobacteria）和擬桿菌門（Bacteroidetes），以及酸桿菌門（Acidobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）、浮霉菌門（Planctomycetes）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）、異常球菌-棲熱菌門（DeinococcusThermus）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、互養(yǎng)菌門（Synergistetes）、梭桿菌門（Fusobacteria）、軟壁菌門（Tenericutes）、衣原體門（Chlamydiae）、綠菌門（Chlorobi）、纖維桿菌門（Fibrobacteres）、黏膠球形菌門（Lentisphaerae），硝化螺旋菌門（Nitrospira）、螺旋體門（Spirochaetes）和熱袍菌門（Thermotogae），此外還有6個分類地位不明確類群（TM7、Bacteria_incertae_sedis、BRC1、OD1、OP10和WS3）和未被分類類群（Unclassified bacteria）。和薄板制絲工藝類似，變形菌門（Proteobacteria）、藍藻菌門（Cyanobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）和放線菌門（Actinobacteria）為云煙（軟珍）氣流制絲工藝各加工工序樣品中的主要優(yōu)勢菌群，分別占總序列數(shù)的46.2%、32.3%、9.9%和8.4%；此外，氣流制絲工藝中擬桿菌門（Bacteroidetes）占總序列量的1.1%。

2.2不同放置形式下的煙葉表面微生物結(jié)構(gòu)分析

在不同城市放置不同時間下的云煙（軟珍）產(chǎn)品（Rcontrol、RM01、RM02、RM03、RM04、RM05、RW01、RW02、RW03、RW04、RW05、RH01、RH02、RH03、RH04、RH05、RK01、RK02、RK03、RK04、RK05）在門一級水平上，所有序列共被注釋到了24個門，其中包括以厚壁菌門（Firmicutes）、藍藻菌門（Cyanobacteria）和變形菌門（Proteobacteria）為主的優(yōu)勢菌門，還包括擬桿菌門（Bacteroidetes）、放線菌門（Actinobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）、嗜熱絲菌門（Caldiserica）、衣原體門（Chlamydiae）、綠彎菌門（Chloroflexi）、脫鐵桿菌門（Deferribacteres）、異常球菌-棲熱菌門（DeinococcusThermus）、纖維桿菌門（Fibrobacteres）、梭桿菌門（Fusobacteria）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）等。此外，還有4個分類地位不明確類群（OD1、OP10、TM7和Bacteria_incertae_sedis） 和未被分類類群（Unclassified bacteria）。具體物種相對豐度如圖3所示。

3結(jié)論與討論

高通量測序技術是目前微生物多樣性研究應用最為廣泛高效的方法[13]。該研究采用高通量測序技術對不同制絲工藝的卷煙及其運輸過程中煙葉表面微生物多樣性進行研究，每個樣品平均獲得12 842條高質(zhì)量序列，劃分為21個已知門類。對不同制絲工藝及不同運輸過程煙葉表面微生物群落的研究均表明，包括變形菌門（Proteobacteria）、藍藻菌門（Cyanobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes），以及放線菌門（Actinobacteria）在內(nèi)的類群為主要微生物門類。已有研究表明，發(fā)酵煙葉表面微生物多樣性較為豐富，且以細菌為主，其中芽孢桿菌類群較為豐富，這與該研究所得宏基因組數(shù)據(jù)分析結(jié)果相一致。韓錦峰等[14]研究表明，葉面微生物數(shù)量會隨著人工發(fā)酵和自然醇化而逐漸減少。雷麗萍等[15]對煙葉生長和晾制階段細菌種群的動態(tài)變化進行了系統(tǒng)研究，發(fā)現(xiàn)白肋煙在晾制過程中，煙葉干燥速度和相對濕度與細菌總量的變化密切相關。該研究表明，隨著加工工藝的改變和儲存地域及時間的變化，煙葉表面微生物的類群和豐度不斷發(fā)生變化，但主要類群的種類相對穩(wěn)定。制絲工藝作為卷煙生產(chǎn)過程中至關重要一環(huán)，對其表面微生物群落研究表明，云煙（軟珍）卷煙在薄板和制絲工藝下，各加工工序中煙葉表面細菌類群的變化具體表現(xiàn)為：不同的制絲工藝中優(yōu)勢菌群的相對豐度有明顯差異，主要原因可能與原料煙葉的品質(zhì)不同有關，也充分說明了煙草煙葉表面微生物的數(shù)量和種類隨煙葉品種、產(chǎn)地、等級及加工方式的不同而存在一定差異[14-17]。在同一制絲工藝下，隨著加工工序的不斷進行，優(yōu)勢類群的相對豐度也在逐漸發(fā)生變化，這可能是不同加工工序的處理導致了外界環(huán)境因子（如溫度和濕度等）的不斷變化，從而影響了煙葉表面細菌的生理機能，而不同的微生物類群具有不同的生理適應性，因此產(chǎn)生了細菌優(yōu)勢類群數(shù)量和種類上的變化，也可能是外界物質(zhì)進入后直接與細菌類群發(fā)生作用而影響其群落結(jié)構(gòu)；不同制絲工藝的相同加工工序中優(yōu)勢菌群相對豐度同樣具有明顯差異，可能因為薄板和氣流2種不同的制絲工藝的處理在影響著煙葉表面的群落結(jié)構(gòu)，也可能因為原料煙葉自身所攜帶的細菌類群的種類和數(shù)量就不同，因此導致了這種差異的形成。盡管2種制絲工藝中微生物群落的變化沒有明顯趨勢，但在二加入口的樣品（RB05和RQ05）中，放線菌類群豐度均明顯增多，這可能是由于隨著松散回潮之后，微生物與外界空氣接觸充足，消耗煙葉中的糖類、纖維素、半纖維素、蛋白質(zhì)等大分子有機物質(zhì)，使得環(huán)境中的營養(yǎng)物質(zhì)極度下降，而對環(huán)境適應能力較強的放線菌豐度顯著升高。在這個過程中，蛋白質(zhì)的消耗可以有效減少因蛋白質(zhì)含量過多而產(chǎn)生的惡臭味[18]；糖類物質(zhì)轉(zhuǎn)化為醇類、脂類、單萜類等小分子化合物可以產(chǎn)生一定香氣[19-23]；纖維素的減少可以有效減少煙葉的辛辣和刺激性[24]。因此，在此過程中很有可能是微生物影響煙葉品質(zhì)（包括口感和氣味）的重要環(huán)節(jié)。根據(jù)不同城市放置時間的煙葉表面微生物研究表明，除昆明之外，不同城市的煙葉在放置7 d后，微生物類群與對照的變化基本不大，且隨著時間的變化，不同城市放置的煙葉表面主要微生物群落豐度的變化大體一直，也就是說，相對于時間因素來講，空間地理因素可能不是影響煙葉微生物主要類群豐度變化的主要原因。煙葉品質(zhì)的改變，可能隨放置的時間不同而逐漸改變。

總之，該研究通過高通量測序技術解析了煙葉在不同制絲工藝加工及儲存過程中微生物群落結(jié)構(gòu)的變化，發(fā)現(xiàn)在一加出口和二加入口的過程中可能是與煙葉品質(zhì)相關的重要階段，為微生物制劑指導煙葉加工工藝提供理論借鑒。此外，研究還表明，在儲存過程中，煙葉的儲存時間可能是影響煙葉表面微生物群落變化的主要因素，而其所在地理位置環(huán)境對煙葉的影響不大。

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