嚴(yán)鴻林

摘? 要：本期主要介紹纖維素酶在細(xì)菌體系中的作用方式、細(xì)菌共培養(yǎng)以及纖維素酶基因在異源宿主中的克隆與表達(dá)。

關(guān)鍵詞：纖維素酶;共培養(yǎng);克隆;細(xì)菌

中圖分類(lèi)號(hào)：S851.6 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：C 文章編號(hào)：1001-0769（2018）12-0018-03

6? 纖維素酶在細(xì)菌體系中的作用方式

研究人員關(guān)注對(duì)纖維素特異性黏附有重要作用的四種結(jié)構(gòu)：（1）被稱(chēng)為纖維小體的大型多組分復(fù)合物;（2）菌毛或菌毛黏連;（3）細(xì)菌糖萼層表面的碳水化合物;（4）酶結(jié)合結(jié)構(gòu)域。

6.1 通過(guò)類(lèi)纖維體復(fù)合物的黏附

纖維小體是大的、穩(wěn)定的多酶復(fù)合物，特異性地黏附和降解位于細(xì)胞表面上可見(jiàn)突起的纖維素。多纖維素酶復(fù)合物由包含纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域和多附著位點(diǎn)（稱(chēng)為黏附素）的中央非催化亞基（稱(chēng)為支架蛋白）組成，附著位點(diǎn)用于結(jié)合酶促遞送。酶促提交物包含催化結(jié)構(gòu)域和對(duì)接結(jié)構(gòu)域[稱(chēng)為碼頭蛋白（dockerin）]，后者與支架蛋白上的內(nèi)聚相互作用。研究最徹底和最好的纖維小體是嗜熱細(xì)菌熱纖維梭菌。

6.2 通過(guò)纖毛黏附

纖毛參與表面附屬物的細(xì)菌黏附。革蘭氏陰性菌中纖毛的寬度為5 nm～7 nm，長(zhǎng)度為100 nm～200 nm。隨著對(duì)纖毛在細(xì)菌黏附作用中了解的加深，我們清楚地認(rèn)識(shí)到纖毛的結(jié)構(gòu)亞單位負(fù)責(zé)細(xì)菌黏附。革蘭氏陽(yáng)性菌黏放線(xiàn)菌和血鏈球菌中纖毛的一些亞基單位已經(jīng)被鑒定。大腸桿菌具有三種類(lèi)型的纖毛，其碳水化合結(jié)合位點(diǎn)均在纖毛小的（28 kDa～? 35 kDa）重復(fù)亞基中，并且大部分位于纖維的唇部，剩余的重復(fù)亞基位于纖毛其他位置。在白色瘤胃球菌中，一種新型的纖維素結(jié)合蛋白（cbpC，17.7 kDa）已經(jīng)被認(rèn)為屬于丸蛋白，并且最類(lèi)似于革蘭氏陰性致病菌的4型菌毛蛋白。

6.3 通過(guò)細(xì)菌糖萼的碳水化合物表面黏附

電子顯微鏡觀(guān)察發(fā)現(xiàn)了大部分有關(guān)通過(guò)碳水化合物表位黏附的證據(jù)。許多研究表明，圍繞白色瘤胃球菌和瘤胃黃瘤菌的黏液層由糖蛋白（碳水化合物殘基）組成，參與細(xì)菌的黏附。如果用蛋白酶和葡聚糖酶處理通過(guò)高碘酸鹽氧化去除糖萼碳水化合物，那么白色瘤胃球菌和產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌對(duì)纖維素的黏附會(huì)顯著降低。更多的碳水化合物黏附作用的直接證據(jù)在纖維桿菌中已給出。

6.4 通過(guò)纖維素分解酶的纖維素結(jié)合域黏附

已經(jīng)揭示了在纖維素酶結(jié)構(gòu)中發(fā)現(xiàn)的兩個(gè)功能域，即負(fù)責(zé)水解切割糖苷鍵的活性催化結(jié)構(gòu)域和將細(xì)菌酶結(jié)合到其底物上的結(jié)合結(jié)構(gòu)域。在許多情況下，纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域通過(guò)富含羥基氨基酸的接頭與催化核心連接，并且大多數(shù)纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域具有四個(gè)保守的色氨酸和兩個(gè)另外的半胱氨酸殘基。由于保守的芳香族殘基，人們認(rèn)為纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域通過(guò)氫鍵或疏水相互作用連接到纖維素上。已經(jīng)有研究表明，缺乏這些結(jié)構(gòu)域的細(xì)菌黏附性較差，在某些情況下，其消化晶體纖維素的能力較差。人們已經(jīng)在產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌中鑒定了不同的結(jié)合結(jié)構(gòu)域，包括內(nèi)切葡聚糖酶2和EGF。Karita等克隆了來(lái)自白色瘤胃球菌F-40的基因egVI，發(fā)現(xiàn)該酶含有不同的纖維素結(jié)合結(jié)構(gòu)域。

7? 共培養(yǎng)

細(xì)菌共培養(yǎng)用于改善纖維素的水解和提高產(chǎn)物利用率以獲得更值得需要的發(fā)酵產(chǎn)物。熱纖梭菌有其優(yōu)勢(shì)與能夠?qū)⑽焯前l(fā)酵成乙醇的生物進(jìn)行共培養(yǎng)，因?yàn)闊崂w梭菌只能發(fā)酵己糖。因此，熱纖梭菌已經(jīng)與其他厭氧嗜熱梭狀芽孢桿菌、熱硫化氫梭菌和布氏熱厭氧桿菌培養(yǎng)。這些生物體具有與厭氧嗜熱梭狀芽孢桿菌共生的能力，可用于纖維素和半纖維素的水解，最終轉(zhuǎn)化成乙醇（圖2）。共培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)是增加產(chǎn)量，但挑戰(zhàn)是副產(chǎn)物（如乙酸和乳酸）的產(chǎn)生，通過(guò)影響細(xì)胞的生長(zhǎng)速率來(lái)降低乙醇產(chǎn)量。開(kāi)發(fā)細(xì)菌共培養(yǎng)是一項(xiàng)艱巨的任務(wù)。培養(yǎng)基和生長(zhǎng)條件，如溫度/空氣和碳源必須是同步的，因?yàn)楸ＷC每個(gè)菌株的均勻生長(zhǎng)是建立共同培養(yǎng)所必需的。穩(wěn)定的共同培養(yǎng)也可以通過(guò)更特定地控制代謝相互作用（即相互關(guān)系或相互作用）和其他相互作用（即生長(zhǎng)促進(jìn)或生長(zhǎng)抑制如抗生素）來(lái)實(shí)現(xiàn)。

細(xì)菌共培養(yǎng)的替代途徑是基因工程菌的開(kāi)發(fā)，這種菌能夠從頭到尾完成纖維到乙醇的轉(zhuǎn)化。這意味著，代謝工程改造的熱纖梭菌可以發(fā)酵戊糖和己糖，但是，由于梭菌對(duì)遺傳操作的頑固性，對(duì)梭狀芽孢桿菌的分子改造將是一項(xiàng)艱巨的任務(wù)。因此，共培養(yǎng)具有優(yōu)勢(shì)，因?yàn)樗梢詼p少由單個(gè)細(xì)菌群體產(chǎn)生的外源性產(chǎn)物的量，從而減少宿主細(xì)胞代謝失衡的機(jī)會(huì)。此外，分工將優(yōu)化每個(gè)反應(yīng)路徑。盡管細(xì)菌共培養(yǎng)是生物轉(zhuǎn)化木質(zhì)纖維素生物質(zhì)的一個(gè)常見(jiàn)的概念，但尚處于不成熟的階段，并且具有很大的潛力。

8? 纖維素酶基因在異源宿主中的克隆與表達(dá)

Pasternak和Glick已經(jīng)綜述了纖維素酶基因在細(xì)菌宿主中的克隆和表達(dá)。Forsberg等綜述了細(xì)菌纖維素酶的特性和克隆，特別是來(lái)源于瘤胃厭氧菌產(chǎn)琥珀酸擬桿菌。其中最重要的是：（1）由于原核與真核生物翻譯機(jī)制的差異，從真核宿主中克隆纖維素酶基因不能直接在原核細(xì)胞中表達(dá);（2）由于與原核生物相比真核基因組更大，來(lái)自真核細(xì)胞的基因組克隆庫(kù)需要用長(zhǎng)度為20 kb～40 kb的DNA來(lái)構(gòu)建。像pBR322這樣的載體插入片段大于10 kb～15 kb的DNA不能很好地復(fù)制和得到令人滿(mǎn)意的結(jié)果。重組纖維分解策略將非纖維素分解微生物改造成可分解纖維微生物涉及功能性纖維素酶系統(tǒng)的異源表達(dá)。這種異源表達(dá)已在各種微生物中構(gòu)建來(lái)實(shí)現(xiàn)多種用途。

8.1 異源纖維素酶在細(xì)菌中的表達(dá)

8.1.1 運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌

一些纖維素酶編碼基因已經(jīng)在運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌中克隆和表達(dá)，并取得了不同程度的成功。通過(guò)可移動(dòng)的質(zhì)粒載體將來(lái)自熒光假單胞菌的內(nèi)切葡聚糖酶基因（eglX）引入運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌。然而，該重組菌株在整個(gè)生長(zhǎng)期在細(xì)胞內(nèi)異源內(nèi)切葡聚糖酶的產(chǎn)生與培養(yǎng)基中的葡萄糖濃度無(wú)關(guān)。類(lèi)似地，將枯草芽孢桿菌內(nèi)切葡聚糖酶導(dǎo)入運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌中該酶表達(dá)量低，并且在轉(zhuǎn)化體的培養(yǎng)上清液中也沒(méi)有檢測(cè)到活性。

與上述熒光假單胞菌和枯草芽孢桿菌基因相反，菊歐文氏菌的內(nèi)切葡聚糖酶基因（celZ）可在運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌中有效表達(dá)。運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌所產(chǎn)酶的活性與菊歐文氏菌的親本菌株相當(dāng)。據(jù)報(bào)道，內(nèi)切葡聚糖酶基因的生物合成發(fā)生于運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的指數(shù)生長(zhǎng)期期間，約35%的酶釋放到培養(yǎng)基中而不參與細(xì)胞裂解。另一個(gè)纖維素酶基因已被成功克隆，并在運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞桿菌中表達(dá)。來(lái)自木質(zhì)醋酸菌的CMCase基因在運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌中有效表達(dá)，并且在周質(zhì)間隙中檢測(cè)到約75%的酶活性。

8.1.2 腸原桿菌

由celY和celZ編碼的兩種菊花內(nèi)切葡聚糖酶和木質(zhì)醋酸菌的纖維素酶基因已經(jīng)在大腸桿菌以及相關(guān)腸桿菌產(chǎn)酸克雷伯氏菌中有表達(dá)。由于啟動(dòng)子構(gòu)建，celY最初在大腸桿菌中的表達(dá)很差。然而，通過(guò)使用來(lái)自運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌的替代啟動(dòng)子，大腸桿菌中celZ的表達(dá)增加了6倍。

9? 纖維素酶生物技術(shù)：未來(lái)

使用木質(zhì)纖維素材料或其他化學(xué)原料生產(chǎn)乙醇是生物技術(shù)史上遇到的最困難的任務(wù)之一。通過(guò)對(duì)培養(yǎng)物中的酶進(jìn)行定量、純化、鑒定和應(yīng)用來(lái)研究微生物纖維素的利用，這同時(shí)也是微生物生物技術(shù)的重要方面之一。纖維素水解的定量描述包括纖維素酶的吸附、酶水解速率、微生物纖維素利用的生物能量學(xué)以及與可溶性底物動(dòng)力學(xué)對(duì)比的特征。從生物學(xué)角度來(lái)看，纖維素生物質(zhì)的處理具有預(yù)處理底物和替代工藝配置的特點(diǎn)。生物體發(fā)育被認(rèn)為是“整合生物加工”，其中纖維素分解酶的生產(chǎn)、生物質(zhì)的水解和糖發(fā)酵成所需產(chǎn)物在一步發(fā)生。我們對(duì)兩種生物開(kāi)發(fā)策略的“整合生物加工”進(jìn)行了審查：（1）可改善能夠利用纖維素的微生物的產(chǎn)物產(chǎn)量和耐受性;（2）實(shí)現(xiàn)纖維利用分解菌的高產(chǎn)和耐受性酶體系的異源表達(dá)。

10? 結(jié)論

微生物轉(zhuǎn)化纖維素生物質(zhì)是開(kāi)發(fā)新型生物工藝和產(chǎn)品潛在的可持續(xù)方法。目前，微生物纖維素酶正在全球多個(gè)行業(yè)進(jìn)行商業(yè)化生產(chǎn)，并在食品、動(dòng)物飼料、燃料、造紙業(yè)、紡織業(yè)以及各種化學(xué)工業(yè)中得到廣泛應(yīng)用。纖維素酶研究主要集中于真菌，但由于細(xì)菌具有較高的生長(zhǎng)速率、熱穩(wěn)定性和堿穩(wěn)定性，因此人們對(duì)用細(xì)菌產(chǎn)生纖維素酶的興趣也在增加。在不適宜環(huán)境中篩選來(lái)自微生物的纖維素酶的快速和可靠方法的發(fā)展將允許更多數(shù)量的新型細(xì)菌纖維素酶被分離出來(lái)用于工業(yè)用途。我們目前對(duì)這些酶和生產(chǎn)菌的生產(chǎn)、純化、鑒定、生物化學(xué)、分子生物學(xué)的認(rèn)識(shí)是可觀(guān)的。然而，通過(guò)合理的設(shè)計(jì)，可以利用現(xiàn)有的酶結(jié)構(gòu)和功能知識(shí)來(lái)進(jìn)一步設(shè)計(jì)這些新型酶。或者，可以通過(guò)隨機(jī)誘變技術(shù)對(duì)其改進(jìn)，重點(diǎn)是要通過(guò)定向進(jìn)化選擇理想的性狀加以增強(qiáng)。此外，通過(guò)蛋白質(zhì)工程改善細(xì)菌纖維素酶活性或賦予所需的酶特征可能是纖維素酶研究的另一個(gè)領(lǐng)域。盡管迄今為止我們?nèi)〉昧思?xì)菌纖維素酶的一些研究進(jìn)展，但對(duì)纖維素酶和細(xì)菌還需要付出更多的努力才能產(chǎn)生重要的工業(yè)影響。

（續(xù)完）