薛秀榮 來祝檁 韓惠云

[摘要] 血站開展核酸檢測是保證血液安全的重要舉措。氣溶膠污染是核酸檢測過程中最主要且最常見污染，也是困擾絕大多數(shù)實驗室的一個難題，如果不加以重視，氣溶膠會污染整個實驗室，嚴重時可導致實驗室不能正常運行。該文在核酸檢測防污染方面進行初步總結。

[關鍵詞] 防污措施；核酸檢測；氣溶膠污染

[中圖分類號] R331 [文獻標識碼] A [文章編號] 1672-5654（2018）09（b）-0144-02

到2015年，血液核酸篩查檢測基本覆蓋全國[1]。核酸檢測反應的最大特點是具有較大擴增能力與極高的靈敏性，但在操作過程中易受到污染，極其微量的污染即可造成假陽性的產生。該站核酸實驗室運行至今已完成了將近27萬人次的核酸樣本檢測，在核酸檢測防污染方面積累了一定的工作經驗，現(xiàn)報道如下。

1 布局合理的實驗室是保證實驗能正常進行的前提

該站核酸實驗室按工作需要分為：試劑儲存區(qū)（一區(qū)）、樣本處理區(qū)（二區(qū)）、擴增區(qū)（三區(qū)），各區(qū)均設有緩沖間。各區(qū)在空間上完全獨立，不能相通。各區(qū)有獨立的通風系統(tǒng)，一、二、三區(qū)壓力依次遞減，一區(qū)、二區(qū)保持正壓，三區(qū)保持負壓狀態(tài)，各區(qū)間壓差≥5 Pa，二區(qū)、三區(qū)可適當加大壓差。進風口和出風口不能設在建筑的同一平面，要避免排出的空氣被重新吸進實驗室。各區(qū)域只用于特定的操作，工作衣和清潔消毒物品不得跨區(qū)混用，實驗室人員和物品應按照從一區(qū)→二區(qū)→三區(qū)的單向工作流向制度，不得逆向流動。

2 質量控制

實驗室應建立合理、科學的室內質控標準操作規(guī)程（SOP），根據檢測模式的不同選擇不同的質控方法和質控規(guī)則，且質控應從樣本處理到報告發(fā)放全程參與，對每一批檢測至少設立一組質控品，并包括至少一個弱陽性室內質控品。

2.1 人員和培訓

真正決定工作質量的關鍵是人。防污染的關鍵是工作人員安全的操作行為和嚴格執(zhí)行標準操作規(guī)程。實驗室人員配備應該符合核酸檢測工作量的要求，崗位設置與選擇的檢測系統(tǒng)和檢測策略配合一直，工作人員需要通過相關的質量管理規(guī)范要求，定期參加核酸檢測技術培訓并合格，定期為實驗室人員進行時長不低于1 W的核酸理論和實際操作專項培訓。

2.2 試劑的儲存

相對于酶免疫試劑，核酸檢測試劑種類多樣，且對溫度敏感，分別要求于-20℃、-4℃～8℃及常溫25℃環(huán)境中，故在接收試劑時需要對其進行嚴格的運輸溫度檢查以及到貨是質量檢查，確認不同種類試劑在運輸過程中的溫度控制是否滿足說明書要求，試劑是否有破損，是否存在外包裝標識或者條碼不完整等情況。在儲存時，試劑儲存區(qū)僅用于核酸試劑和耗材的存儲，是核酸擴增實驗室最為“潔凈”的區(qū)域，不應有任何核酸的存在。核酸質控品和試劑盒中的陽性對照不能進入試劑儲存區(qū)，可存放于樣本處理區(qū)冷凍保存[2]。

2.3 標本的采集

在影響血液篩查結果的眾多因素中，標本因素是首要的[3]。用于核酸檢測實驗的采血管必須采用無菌、無DNA酶、無RNA酶、帶惰性分離膠、一次性使用的EDTA-K2抗凝真空采血管，采血管應無裂痕，無滲漏[4]。標本采集過程中若遇采血管負壓不足，應更換一支采血管重新留樣，標記后兩管同時送檢。嚴禁開帽留樣，以防外界酶及抑制物進入標本，影響檢測結果。

2.4 樣本的處理

①盡量減少開蓋樣本在實驗室環(huán)境中的暴露時間。實驗開始前在生物安全柜或正壓環(huán)境中使用全自動開蓋系統(tǒng)或手工開蓋，加樣結束后，立即使用一次性使用的硅膠塞或試管帽對樣本密封，避免未知核酸陽性樣本對陰性樣本的污染，從而影響拆分結果。

②實驗過程中避免在已開蓋的樣本上方活動，以免抑制物進入標本，導致假陰性。

③檢測后核酸樣本放置在冰箱指定位置暫存，經高壓蒸汽滅菌器消毒處理后按醫(yī)療廢物處置。

2.5 陰、陽性對照和質控品的配制

設立陰、陽性對照有利于監(jiān)測反應體系各成份的污染情況。但陽性對照和質控品在核酸提取設備中混勻、振蕩時會產生氣溶膠或液滴濺出，成為潛在的污染源。核酸實驗室陰、陽性對照的配制及質控標準品的復融、混勻、開蓋均應在生物安全柜中進行。為防止陽性對照和質控品對標本造成污染，應在標本全部上機后，再配制陰、陽性對照和質控品[5]。陽性對照及質控品復融后應先確認各管帽已擰緊，上下顛倒混勻時液體不會濺出或漏出，混勻后離心，把管壁和管帽上的液體收集于管底，防止開蓋時液體濺出污染生物安全柜。開蓋后在生物安全柜內靜置5 s以上，待管內產生的氣溶膠經生物安全柜抽濾清除后再轉移至樣本架。

2.6 試劑配制及耗材擺放

試劑和耗材均屬于潔凈無污染的實驗物品，使用前認真檢查試劑和耗材外觀，應無破損、滲漏等。配制試劑時應正確使用加樣器，吸樣時，應緩慢勻速，避免液體濺到加樣器頭上，盡量一次性吸完，忌反復多次抽吸，以免交叉污染或產生氣溶膠。打出液體后拇指不應松開按鈕，應先將吸嘴壓掉再將拇指松開，避免液體回吸[6]。核酸提取結束后，取下廢棄試劑和耗材，用自封袋密封后放入醫(yī)療廢物桶中。

2.7 核酸擴增

擴增產物是最容易出現(xiàn)的污染，通常一次典型的PCR擴增可以產生109拷貝的靶序列，若氣溶膠化，最小的氣溶膠都會含106拷貝的擴增序列，這些氣溶膠的累積會污染實驗室內的試劑、儀器設備和通風設備，使檢測結果出現(xiàn)異常[7]。因此，應對核酸擴增的每一個環(huán)節(jié)進行嚴格的規(guī)范操作。

①擴增反應液和樣本核酸模板分裝完畢檢查管內液面高度一致后，加蓋八聯(lián)管蓋，逐孔按緊，混勻離心后再次檢查八聯(lián)管有無滲漏。

②八聯(lián)管轉移至96孔擴增盤時再次確認管蓋已封嚴，以防擴增過程中爆管導致實驗室污染[8]。

③擴增結束后要及時將擴增產物從擴增儀里取出（禁止打開八聯(lián)管），檢查管內液面無變化后放入自封袋內封嚴，然后帶出擴增區(qū)，按醫(yī)療廢物處理。每次擴增后，可使用可移動紫外燈對擴增熱循環(huán)儀進行照射。

2.8 實驗結束后的清潔消毒

清潔消毒方法不當也是實驗室污染的一個主要原因，實驗結束后應遵從先清潔區(qū)域后污染區(qū)域消毒的原則，及時對實驗室空氣、設備表面、工作臺面和地面等實施有效的消毒。核酸實驗室不同的實驗區(qū)域應有其各自的清潔用具以防交叉污染。先用75%酒精對實驗室空氣進行密集噴淋，以對實驗過程中產生的氣溶膠產生較好的沉降效果。噴淋結束立即采用500 mg/L的84液擦拭工作臺面/拖擦地面，作用10 min后用清水擦拭工作臺面，以防止84液殘留抑制實驗結果；設備表面用一次性潔凈紗布沾取75%酒精擦拭消毒。擦拭消毒結束工作人員離開實驗室，打開實驗室各處的紫外燈和紫外燈車對實驗室空氣和臺面照射消毒，照射時間≥1 h。

2.9 儀器和設備

應該給予實驗室配備滿足檢驗工作需要的相關核算檢測系統(tǒng)、混樣儀、生物安全柜、離心機、樣品開蓋機、冷藏冷凍、不間斷電源（UPS）、消毒柜等基本設備，并且在系統(tǒng)及設備安裝、運行過程中對其及逆行效能、交叉污染、穩(wěn)定性檢測，在廠家提供的操作說明書的基礎上，制定檢測過程中或者日維護、周維護、月維護和校準驗證計劃，確保設備正常有效運行。

3 其它方面

3.1 每個月對實驗室進行環(huán)境監(jiān)測

監(jiān)測實驗室是否存在污染，清潔消毒效果是否良好?？墒褂貌潦梅▽Ρ溟T把手、實驗室門把手、實驗室臺面、生物安全柜、設備臺面、傳遞窗等部位進行監(jiān)測，用空氣沉降法對實驗室各區(qū)空氣質量進行監(jiān)測。任一方法/部位環(huán)境監(jiān)測結果不合格，均應采取相應措施加強實驗室清潔消毒，直至環(huán)境監(jiān)測結果全部合格。

3.2 實驗室溫、濕度控制

相對條件下，氣溶膠濃度與溫度是負相關，與濕度成正相關[7]，可在規(guī)范要求范圍內合理控制實驗室溫度、濕度的波動范圍，減少氣溶膠的產生。

3.3 防護措施

實驗過程中必須穿戴工作衣、帽、口罩，戴一次性無粉手套，疑有污染立即更換。

3.4 消毒設備

紫外燈管累計工作1 000 h或輻射強度低于70 μW/cm2時應更換燈管。

3.5 對儀器設備的輔助用品如離心機，離心杯，試管架，手推車等定期進行消毒

核酸檢測實驗室防污染措施可結合實驗過程中的具體操作方法以達到最佳效果，措施包括但不僅限于上面幾種。細節(jié)決定成敗，尤其對于實驗環(huán)境和操作要求極高的核酸實驗室，任何一個環(huán)節(jié)做不好都可能影響整個實驗結果。因此，操作人員應具有“無核酸”“無基因”概念[9]，把防污染思想貫穿于整個實驗過程中，嚴格遵守操作規(guī)程，保證檢測質量，確保臨床用血安全。

[參考文獻]

[1] 林松峰.核酸實驗室溫濕度控制、清潔消毒及防污染措施[J].醫(yī)療裝備，2016，29（22）：43-44.

[2] 陳越康，李活，王飛，等.核酸篩查實驗室RNA酶污染防止對策探討[J].中國自然醫(yī)學雜志，2007，9（2）：137-138.

[3] 余霖，陳慶愷，何子毅.核酸檢測應注意的幾個問題[J].臨床輸血與檢驗，2017，19（5）：528-529，536.

[4] 國家衛(wèi)生計生委.血站技術操作規(guī)程（2015版）（Z），2015-12-17.

[5] 李園.PCR實驗室的消毒與防污染措施[J].檢驗醫(yī)學與臨床，2010，7（3）：285-286.

[6] 李金明.實時熒光PCR技術[M].北京.人民軍醫(yī)出版社，2014.

[7] 倪沈陽，石巍，陳琬玥，等.溫濕度對氣溶膠濃度影響的模擬研究[J].吉林建筑大學學報，2016，33（6）：53-56.

[8] 蔡麗娜，陳寶安.核酸擴增技術（NAT）在獻血者血液初篩中的應用現(xiàn)狀[J].中國實驗血液學雜志，2014，22（4）：1171-1177.

[9] 冷嬋，王中梅，于磊，等.血站核酸檢測實驗室風險識別、評估及控制方法探討[J].中國輸血雜志，2011，24（7）：547-550.

（收稿日期：2018-06-19）