張立新 吳治然　林彬　王琦　檀根甲

摘要

由致病性鏈格孢引起的葉枯病是栝蔞生產上出現的一種新病害，在安徽大別山栝蔞生產區(qū)發(fā)生嚴重。本研究采用菌絲生長速率法測試了12個代表性栝蔞葉枯病菌菌株對4種常用殺菌劑的敏感性。結果表明，栝蔞葉枯病菌對咪鮮胺敏感性較高，其EC50為0.013 0～0.219 μg/mL；代森錳鋅和百菌清對栝蔞葉枯病菌均有一定的抑制作用，但各菌株對代森錳鋅和百菌清的敏感性差異較大，其EC50分別為0.997～95.64 μg/mL和1.66～185.84 μg/mL；多菌靈對栝蔞葉枯病菌的菌絲生長抑制作用較差。

關鍵詞

栝蔞葉枯病； 鏈格孢； 敏感性； 殺菌劑

中圖分類號：

S 436.68

文獻標識碼： B

DOI： 10.16688/j.zwbh.2017260

Sensitivity of Alternaria alternata in Trichosanthes kirilowii to

four fungicides in Anhui Province

ZHANG Lixin， WU Zhiran， LIN Bin， WANG Qi， TAN Genjia

（College of Plant Protection， Anhui Agricultural University， Hefei 230036， China）

Abstract

A new leaf blight disease caused by Alternaria alternata was observed and reported on Trichosanthes kirilowii Maxim. in the southwest region of Anhui Province， which has become a serious disease limiting snakegourd fruit production in recent years. 12 representative strains of A.alternata were isolated from T.kirilowii plants in different farms， and the sensitivities of 12 strains to 4 fungicides were measured by the mycelial growth rate method. The results showed that the isolates were sensitive to prochloraz with the EC50 values of 0.013 0-0.219 μg/mL.Mancozeb and chlorothalonil had certain inhibitory effects on the growth of A.alternata， with the EC50 values of 0.997-95.64 μg/mL and 1.66-185.84 μg/mL， respectively， while there were variations in sensitivities to the same fungicide among isolates from different areas. Moreover， the isolates were less sensitive to carbendazim.

Key words

leaf blight disease of snakegourd fruit； Alternaria alternata； sensitivity； fungicide

栝蔞Trichosanthes kirilowii Maxim.為葫蘆科栝蔞屬多年生攀緣草本植物，也稱瓜蔞、野葫蘆、藥瓜、野苦瓜等，在我國安徽、河南、浙江、江西等地均有種植[1]。栝蔞果實、根均可入藥，有清熱散結、潤肺化痰、養(yǎng)胃生津等作用，同時栝蔞籽含有豐富的不飽和脂肪酸而被人們喜愛食用。因栝蔞具有較高的藥用和食用價值，其引種分布區(qū)域逐年擴大，近年來在安徽大別山區(qū)乃至江淮地區(qū)廣泛種植。2014年開始，在安徽省的懷寧、宿松等縣的栝蔞產區(qū)發(fā)生一種新病害，該病害危害栝蔞葉片，通常植株下部葉片首先發(fā)病，然后向上部葉片擴展。初期植株下部葉片邊緣出現典型黃褐色壞死斑，且周圍環(huán)繞黃色暈圈，隨著時間的延長，病斑逐漸向葉片基部擴展延伸，病斑相互結合成大面積壞死斑，最終葉片枯死脫落。外部氣候條件適宜時，感病植株葉片迅速萎蔫，隨后變黃脫落。2015年夏初在宿松縣栝蔞種植區(qū)調查發(fā)現，田間栝蔞葉片發(fā)病率平均達到80%，給當年栝蔞種植大戶造成較大的經濟損失。

鑒于該病害在栝蔞生產上造成的嚴重危害，筆者前期對該病害的病原進行了組織分離、致病性測定、形態(tài)學和分子生物學鑒定，確定了該病害是由交鏈格孢Alternaria alternata侵染引致栝蔞葉枯的真菌性病害[2]。由鏈格孢引起的植物病害已被廣泛報道，包括番茄、甘藍、煙草、梨樹和蘋果樹等[34]。目前生產上防治鏈格孢引起的病害主要還是依賴于化學藥劑。常用藥劑有代森錳鋅、咪鮮胺、百菌清、嘧霉胺、苯醚甲環(huán)唑和多菌靈等[57]。針對當前在栝蔞產區(qū)新發(fā)生的鏈格孢葉枯病，且尚未明確抗性品種情況下，本研究采用菌絲生長速率法測定了從栝蔞葉枯病重發(fā)區(qū)分離的交鏈格孢對4種常用殺菌劑的敏感性，以期明確栝蔞葉枯病菌對殺菌劑的抗藥性程度，為該病害的科學合理用藥提供參考。

1 材料和方法

1.1 供試菌株

2014年-2015年，在安徽省懷寧、宿松等縣的栝蔞主生產區(qū)，于栝蔞葉枯病發(fā)生時期采集具有典型癥狀的葉枯病葉樣本，采用組織分離法對病葉上的病菌進行分離和純化。在PCA培養(yǎng)基上誘導產孢后，采用稀釋法進行單孢分離得到純培養(yǎng)物。通過致病性測定、形態(tài)學觀察和分子生物學方法對病原菌進行鑒定[2]，選取不同來源和采集時期的12個代表性栝蔞葉枯病菌菌株進行藥劑的敏感性測定。菌株編號以各自分離的地點命名開頭，HN11～HN14于2014年采集于懷寧縣；SS15～SS16，SS17～SS22分別于2014和2015年采集于宿松縣。

1.2 供試藥劑和培養(yǎng)基

1.2.1 供試藥劑

25%咪鮮胺乳油，江蘇輝豐農化股份有限公司；75%百菌清可濕性粉劑，天津市前進農藥廠；80%代森錳鋅可濕性粉劑，浙江永農化工有限公司；80%多菌靈可濕性粉劑，江蘇泰倉農化有限公司。將供試藥劑分別配制成質量濃度為104 μg/mL的母液，放置于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 供試培養(yǎng)基

PCA培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯100 g，胡蘿卜100 g，瓊脂20 g， 蒸餾水1 000 mL。

PDA培養(yǎng)基：去皮馬鈴薯200 g， 葡萄糖20 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL。

1.3 栝蔞葉枯病菌對不同殺菌劑的敏感性測定

采用菌絲生長速率法[89]測定栝蔞葉枯病菌對4種常用殺菌劑的敏感性水平。根據預試驗結果，各供試藥劑均選擇對病菌菌絲生長抑制率在10%～90%范圍內的5～6個濃度梯度。用移液器量取1 mL藥液加入到9 mL約50℃熔化的PDA培養(yǎng)基中，混勻后立即倒入滅菌的培養(yǎng)皿中制成含藥平板。

將活化培養(yǎng)的栝蔞葉枯病菌，用打孔器沿菌落的邊緣打取直徑為6 mm的菌餅，分別移到不同濃度的含藥PDA平板中央，以加無菌水的培養(yǎng)基平板為對照，每個濃度重復3次。接種后將培養(yǎng)皿置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72～96 h，采用十字交叉法測量菌落直徑，以平均值代表菌落大小，計算各藥劑濃度對菌絲生長的抑制率[10]。所得數據經DPS統(tǒng)計軟件進行處理， 求出4種藥劑對各供試菌株的毒力回歸方程、相關系數和EC50。

2 結果與分析

2.1 栝蔞葉枯病菌對咪鮮胺的敏感性

咪鮮胺對12個菌株的EC50分布在0.013 0～0.219 μg/mL之間，均值為（0.120±0.070 7）μg/mL，其中菌株HN14的EC50最大，HN11的EC50最小，為最敏感菌株，前者的EC50是后者的16.8倍；其他菌株的敏感性在15倍以下，表明各供試菌株對咪鮮胺比較敏感（表1）。

2.2 栝蔞葉枯病菌對代森錳鋅的敏感性

代森錳鋅對12個菌株的EC50分布在0.997～95.64 μg/mL之間，均值為（27.90±29.05）μg/mL，其中菌株SS17的EC50最大，菌株HN13的EC50最小，為最敏感菌株，前者的EC50是后者的95.9倍；其他菌株的敏感性在2～67倍范圍內，表明供試菌株對代森錳鋅的敏感性存在明顯差異（表2），這種差異可能與部分菌株出現抗藥性有關。

2.3 栝蔞葉枯病菌對百菌清的敏感性

百菌清對12個菌株的EC50分布在1.66～185.84 μg/mL之間，均值為（72.58±63.51）μg/mL。其中菌株SS21的EC50最大，菌株HN12的EC50最小，為最敏感菌株，前者的EC50是后者的112.2倍；其他菌株的敏感性在65倍以下；表明供試菌株對百菌清的敏感性差異顯著，部分菌株表現出一定的抗藥性（表3）。

2.4 栝蔞葉枯病菌對多菌靈的敏感性

將多菌靈藥劑104 μg/mL母液稀釋成為1 000、500、100、10、1、0.1 μg/mL的不同濃度藥液，測定該藥劑對栝蔞葉枯病菌的毒力。結果表明，供試菌株均對多菌靈不敏感，在多菌靈濃度為500 μg/mL時，其對各供試菌株的抑制率均在35%以下，表明多菌靈對栝蔞葉枯病菌的菌絲生長的抑制作用較差。

3 結論與討論

鏈格孢屬真菌是一種分布于全球的重要植物病原菌，其寄主范圍非常廣泛，可侵染多種植物尤其是農作物和經濟作物[11]，其中交鏈格孢可侵染小麥、馬鈴薯、核桃、梨和柑橘等多種作物而致其發(fā)病[1216]。近年來有研究報道引致植物發(fā)病的交鏈格孢對代森錳鋅、嘧霉胺和苯醚甲環(huán)唑等殺菌劑敏感性強，而對多菌靈藥劑的敏感性低[6，1213]。本研究通過菌絲生長速率法測定了安徽省大別山栝蔞葉枯病發(fā)生區(qū)分離的交鏈格孢對咪鮮胺、代森錳鋅、百菌清和多菌靈的敏感性，其中各供試菌株對咪鮮胺的敏感性高，其EC50在0.013 0～0.219 μg/mL范圍內；供試菌株對代森錳鋅和百菌清的敏感性則表現出明顯的差異，其EC50分別分布在0.997～95.64 μg/mL和1.66～185.84 μg/mL之間；而供試菌株對多菌靈的敏感性較差。

從測定的EC50看，咪鮮胺、代森錳鋅和百菌清對栝蔞葉枯病菌均有一定的抑制作用，但不同殺菌劑之間的抑制作用存在明顯差異，這可能是由于不同殺菌劑的作用方式不同。咪鮮胺是咪唑類殺菌劑，通過抑制微生物麥角甾醇的生物合成使菌體的細胞膜受到破壞而干擾病原菌的正常生長[14]；百菌清為廣譜保護性殺菌劑，能與真菌細胞中的三磷酸甘油醛脫氫酶中含有半胱氨酸的蛋白質相結合從而破壞該酶活性，使真菌細胞的新陳代謝受破壞而失去生命力；代森錳鋅為硫代氨基甲酸酯類殺菌劑，作用位點多，殺菌范圍廣，是優(yōu)良的保護性殺菌劑[12]。

多菌靈為苯并咪唑類殺菌劑，其作用機制是通過與真菌微管蛋白結合從而破壞紡錘絲的形成，阻礙細胞的正常有絲分裂，對子囊菌、半知菌類的大多數病原真菌有較好防效[1718]。從本研究結果看，多菌靈對栝蔞葉枯病菌的菌絲生長抑制效果差，這與多篇文獻報道的多菌靈對引起植物病害的鏈格孢作用效果差的研究結果相一致[6，12，19]，這可能緣于多菌靈的作用方式單一，長期頻繁使用已造成病原菌產生抗藥性有關。因此，建議在進行栝蔞葉枯病害防治時，依據藥劑的作用特點，將咪鮮胺與代森錳鋅、百菌清或類似的殺菌劑交替使用或混用，以延緩病原菌抗藥性的產生，延長咪鮮胺、代森錳鋅等化學藥劑的使用壽命。

參考文獻

[1] 高燕會，李慧慧，朱玉球，等.基于ISSR的栝樓遺傳多樣性分析[J].中草藥，2011，42（2）：363366.

[2] ZHANG L X， SHI Y R， YU J H， et al. First report of leaf blight caused by Alternaria alternata on Trichosanthes kirilowii Maxim in China [J]. Plant Disease， 2016， 100（5）： 1021.

[3] 嚴清平，袁善奎，王曉軍，等.5種鏈格孢屬植物病原真菌對10種殺菌劑的敏感性比較[J].植物保護，2008，34（2）：124127.

[4] 練啟仙，桑維鈞，李小霞，等.柚木褐斑病病原菌的鑒定及室內藥劑篩選[J].廣東農業(yè)科學，2010（2）：9395.

[5] LANDSCHOOT S， CARRETTE J， VANDECASTEELE M， et al. Boscalidresistance in Alternaria alternata and Alternaria solani populations： An emerging problem in Europe [J].Crop Protection，2017，92：4959.

[6] 藺經，楊青松，李曉剛，等.嘧霉胺對梨黑斑病菌（Alternaria alternata）的毒力及其藥效評價[J].植物保護，2009，35（4）：162163.

[7] 李云國，阮應珍，羅嶸，等.代森錳鋅防治蘋果斑點落葉病田間藥效試驗[J].農藥科學與管理，2008，29（3）：3335.

[8] 方中達.植病研究方法[M].北京：中國農業(yè)出版社，1998：4647.

[9] 馬建英，張小風，王文橋，等.灰葡萄孢霉Botrytis cinerea對啶菌惡唑的敏感性和不同殺菌劑的交互抗性[J].植物保護學報，2009，36（1）：6164.

[10]楊曉云，張斌，劉郵洲，等.4種常用殺菌劑對江蘇省番茄枯萎病菌的毒力[J].植物保護，2016，42（1）：208213.

[11]康子騰，姜黎明，羅義勇，等.植物病原鏈格孢屬真菌的致病機制研究進展[J].生命科學，2013，25（9）：908914.

[12]王春明，韓青梅，黃麗麗，等.3種殺菌劑對小麥黑胚病菌的毒力測定及病害防治作用[J].西北農林科技大學學報（自然科學版），2006，34（7）：5560.

[13]范子耀，王文橋，孟潤杰，等.馬鈴薯早疫病病原菌鑒定及其對不同藥劑的敏感性[J].植物病理學報，2013，43（1）：6974.

[14]劉霞，楊克強，姜興印，等.危害核桃的鏈格孢（Alternaria alternata）對4種殺菌劑的敏感性[J].農藥，2013，52（1）：6770.

[15]何美仙，符雨詩，阮若昕，等.柑橘鏈格孢褐斑病菌對4種新型殺菌劑敏感性評價[J].浙江大學學報（農業(yè)與生命科學版），2016，42（5）：535542.

[16]周求根，李誠，蔣軍喜，等.貢梨果實黑斑病病原菌鑒定及室內防治藥劑篩選[J].中國南方果樹，2013，42（5）：3538.

[17]詹家綏，吳娥嬌，劉西莉，等.植物病原真菌對幾類重要單位點殺菌劑的抗藥性分子機制[J].中國農業(yè)科學，2014，47（17）：33923404.

[18]時春喜，李恩才，祁志軍，等.多菌靈與代森錳鋅混配對梨黑星病菌和蘋果斑點落葉病菌的增效研究[J].西北農林科技大學學報（自然科學版），2003，31（4）：131134.

[19]趙永安，胡軍華，姚延山，等.柑桔鏈格孢菌殺菌劑的室內篩選[J].中國南方果樹，2012，41（1）：3641.

（責任編輯：楊明麗）