鐘 宇，陳 濱，李 健，楊青錦，文 娟， 蔡 春

(廣東醫(yī)科大學(xué)分析中心，廣東 湛江 524023)

花生四烯酸(arachidonic acid, AA)是一種二十碳四烯酸，屬于ω-6多不飽和脂肪酸，AA及其代謝產(chǎn)物在調(diào)節(jié)新陳代謝、維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)、調(diào)節(jié)細(xì)胞組織生理功能等方面具有重要作用。脂肪酸的代謝產(chǎn)物單羥基十八碳烯酸(hydroxyoctadecadienoic acids, HODEs)有13-羥基十八碳烯酸(13-hydroxyoctadecadienoic acid, 13-HODE)和9-羥基十八碳烯酸(9-hydroxyoctadecadienoic acid, 9-HODE)兩種異構(gòu)體。亞油酸(linoleic acid, LA)在非酶促作用下產(chǎn)生等摩爾的13-HODE與9-HODE混合物；在15-脂氧酶作用下，LA氧化產(chǎn)生13-HODE；而在5-脂氧酶作用下，LA氧化產(chǎn)生9-HODE[1-2]。羥基十八碳烯酸在炎癥、代謝綜合征及腫瘤發(fā)生過程中具有多重病理生理學(xué)作用。Vangaveti等[1]指出9-HODE和13-HODE是不同細(xì)胞系統(tǒng)炎癥的主要調(diào)節(jié)因子，可作為感染免疫狀態(tài)的潛在生物標(biāo)志物[3]。Leghmar等[4]研究表明，在感染人巨細(xì)胞病毒(HCMV)的永生化人絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞(HIPEC)中釋放13-HODE的量增加，在孕期13-HODE參與炎癥調(diào)節(jié)和脈管系統(tǒng)的形成。通過吡格列酮刺激可以提高13-HODE的水平，有助于調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝和通過調(diào)控糖尿病患者的PPAR通路降低患心血管疾病的風(fēng)險[5-7]。9-HODE和13-HODE在細(xì)胞有絲分裂和凋亡中作為程序性細(xì)胞死亡過程的調(diào)控因子，在維持正常細(xì)胞代謝中發(fā)揮重要作用，同時也有研究表明，9-HODE和13-HODE與腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)[8-9]。

目前，有關(guān)羥基十八碳烯酸的研究主要集中在病理生理學(xué)功能，以及其在體內(nèi)代謝的產(chǎn)生途徑方面，而關(guān)于羥基十八碳烯酸分析方法的報道較少。Dumlao等[10]采用LC-MS/MS法檢測細(xì)胞中類花生四烯酸；An等[11]采用HPLC法檢測細(xì)菌中13-HODE等成分；王秀娟等[12]采用液質(zhì)聯(lián)用法對海帶中的氧化脂類成分進(jìn)行檢測；Schober等[13]利用GC/MS法檢測了紅細(xì)胞中脂肪酸含量。GC/MS法需要樣品衍生化，且不適合分析熱不穩(wěn)定代謝物；而LC/MS和 LC-MS/MS的前處理方法相對簡單，樣品提取后不需衍生等前處理方法就可以直接上機(jī)分析。因此，本研究擬通過優(yōu)化固相萃取處理技術(shù)，采用LC-MS/MS法同時測定血漿中AA、13-HODE和9-HODE，以期為血漿中脂肪酸的代謝研究提供方法參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1200-6430A液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：美國Agilent公司產(chǎn)品；3K15臺式高速冷凍離心機(jī)：德國Sigma公司產(chǎn)品。

花生四烯酸標(biāo)準(zhǔn)品、13-羥基十八碳烯酸標(biāo)準(zhǔn)品、9-羥基十八碳烯酸標(biāo)準(zhǔn)品、氘代花生四烯酸(arachidonic acid-d8, AA-d8)：美國Cayman Chemical公司產(chǎn)品；乙腈：德國Merck公司產(chǎn)品；實(shí)驗(yàn)用水：由美國Millipore公司的超純水系統(tǒng)制備。

1.2 血漿樣品中脂肪酸及代謝產(chǎn)物的提取和處理

取100 μL血漿，加入1 mL甲醇和10 μL 100 μg/L內(nèi)標(biāo)，于4 ℃下攪拌10 min，以13 000 r/min離心5 min，取上清液；用1 mL甲醇和1 mL 0.1%甲酸溶液活化固相萃取柱(Strata-X, 10 mg)，向上清液中添加4 mL 0.1%甲酸溶液，上樣；用1 mL 0.1%甲酸和1 mL 15%乙醇溶液按次序淋洗萃取柱，最后用200 μL甲醇洗脫，收集洗脫液，進(jìn)行LC/MS分析。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別準(zhǔn)確量取一定量的AA、13-HODE、9-HODE標(biāo)準(zhǔn)品溶液，用流動相定容，配制成1 mg/L的AA、13-HODE、9-HODE標(biāo)準(zhǔn)儲備液。準(zhǔn)確量取一定量的AA-d8內(nèi)標(biāo)溶液，用甲醇定容，配制成1 mg/L的AA-d8內(nèi)標(biāo)儲備液。儲備液置于-20 ℃保存，使用時用流動相逐級稀釋成混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.4 實(shí)驗(yàn)條件

1.4.1色譜條件 BEH C18色譜柱(2.1 mm×100 mm×1.7 μm)；流動相：A為水，B為乙腈；流速0.2 mL/min，柱溫40 ℃，進(jìn)樣量10 μL；梯度洗脫程序：0～2 min(40%B)，2～20 min(40%～95%B)，20～20.5 min(40%B)。

1.4.2質(zhì)譜條件 電噴霧離子源(ESI)，負(fù)離子模式；多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)；干燥器溫度350 ℃，干燥氣流速10 L/min；毛細(xì)管電壓4 000 V。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

在正、負(fù)離子模式下，分別進(jìn)樣10 μL 1 g/L的AA、13-HODE、9-HODE和AA-d8標(biāo)準(zhǔn)溶液，在m/z50～400范圍內(nèi)全掃描，以選擇合適的電離模式和準(zhǔn)分子離子峰。AA、13-HODE、9-HODE和AA-d8在負(fù)離子模式下的響應(yīng)值較高，示于圖1。在選擇離子監(jiān)測模式下，優(yōu)化AA、13-HODE、9-HODE和AA-d8的錐孔電壓，使離子峰強(qiáng)度達(dá)到最高；在多反應(yīng)監(jiān)測模式下，優(yōu)化AA、13-HODE、9-HODE和AA-d8的定性和定量離子的碰撞能量，分別選用m/z303.3>259.5、m/z295.3>195.3、m/z295.3>171.2、m/z311.4>267.3作為定量離子。

圖1 AA、13-HODE、9-HODE、AA-d8的全掃描圖(a,c,e,g)和子離子掃描圖(b,d,f,h)Fig.1 Full-scan (a, c, e, g) and product ion (b, d, f, h) mass spectra of AA, 13-HODE, 9-HODE and AA-d8

13-HODE和9-HODE互為同分異構(gòu)體，其色譜分離特性相似，在液相色譜中難以分離。在優(yōu)化質(zhì)譜條件時，由于二者母離子相同，主要對其子離子進(jìn)行條件優(yōu)化，選用2個化合物中質(zhì)荷比不同的子離子作為定量離子。為了監(jiān)測13-HODE和9-HODE在分析過程中是否相互干擾，在進(jìn)行13-HODE定量離子MRM分析時，同時監(jiān)測了9-HODE定量離子m/z295.3>171.2，結(jié)果顯示13-HODE的MRM色譜圖中沒有m/z295.3>171.2離子峰。同樣，在進(jìn)行9-HODE定量離子MRM分析時，同時監(jiān)測了13-HODE定量離子m/z295.3>195.3，結(jié)果顯示9-HODE子離子掃描圖中也沒有m/z295.3>195.3離子峰，故兩者不存在互相干擾。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

為了優(yōu)化AA、13-HODE、9-HODE在色譜柱上的保留時間和分離條件，探討了流動相中乙腈的比例和流速的影響。在固定流速下，將乙腈比例從30%升至40%，發(fā)現(xiàn)AA、13-HODE、9-HODE的響應(yīng)值升高，峰形變好；將乙腈比例從30%降至20%，或?qū)⒁译姹壤?5%、60%時，分離度均有不同程度的降低。在優(yōu)化梯度洗脫條件下，同時優(yōu)化了流動相流速，最終選擇1.4.1節(jié)中的梯度洗脫程序進(jìn)行洗脫。在優(yōu)化條件下，AA、13-HODE、9-HODE、AA-d8標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖示于圖2。

圖2 化合物 AA(a)、13-HODE(b)、9-HODE(c)、AA-d8(d)的分離色譜圖Fig.2 Chromatograms of AA (a), 13-HODE (b), 9-HODE (c) and AA-d8 (d)

2.3 樣品前處理條件的優(yōu)化

本實(shí)驗(yàn)考察了兩種方式淋洗固相萃取柱時的回收率。第一種方式為先分別用0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、0.25%甲酸溶液淋洗固相萃取柱，再用15%乙醇溶液淋洗，結(jié)果顯示，用0.1%甲酸溶液和15%乙醇溶液淋洗時的回收率最高。第二種方式為先用0.1%甲酸溶液淋洗固相萃取柱，再分別用30%、20%、15%、10%、5%乙醇溶液淋洗，用0.1%甲酸溶液和15%乙醇溶液淋洗時的回收率最高。故選擇0.1%甲酸-15%乙醇溶液作為淋洗液。

2.4 線性范圍、檢出限及定量限

本實(shí)驗(yàn)配制了0.5、1、2、5、10、20、50 μg/L的AA、13-HODE、9-HODE混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，各濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液的內(nèi)標(biāo)濃度均為50 μg/L。在優(yōu)化的條件下，以定量離子的峰面積對質(zhì)量濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，在0.5～50 μg/L濃度范圍內(nèi)，3種脂肪酸代謝物均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均大于0.99。以信噪比大于3為樣品的檢出限(LOD)，以信噪比大于10為樣品的定量限(LOQ)，其結(jié)果列于表1。

2.5 重復(fù)性和精密度

取10 mg/L的AA、13-HODE、9-HODE混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，在同一樣品、同一天的3、6、9、12 h和第1、2、3天進(jìn)行重復(fù)測試，連續(xù)進(jìn)樣6次。結(jié)果表明：AA、13-HODE、9-HODE日內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為6.11%、3.89%和3.72%，日間標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為6.39%、4.76%和3.87%，精密度RSD分別為2.77%、1.95%和1.48%。說明該方法的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性較好。

2.6 方法的回收率

向樣品中分別加入200 μL 0.5、5、20 μg/L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.2節(jié)方法操作，每個濃度分別連續(xù)進(jìn)樣6次。在不同的加標(biāo)濃度下，AA的回收率均在98.50%～100.07%之間，RSD在3.7%～5.6%之間；13-HODE的回收率均在97.43%～101.46%之間，RSD在3.6%～5.1%之間；9-HODE的回收率均在97.42%～100.85%之間，RSD在3.8%～4.8%之間，其結(jié)果列于表2。

表1 AA、13-HODE和9-HODE的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限Table 1 Linear equations, correction coefficiencts (R2),limits of detection (LODs) and limits of quantification (LOQs) of AA, 13-HODE and 9-HODE

表2 AA、13-HODE、9-HODE的加標(biāo)回收率和精密度(n=6)Table 2 Recoveries and precisions of AA, 13-HODE and 9-HODE (n=6)

2.7 實(shí)際樣品分析

取6份年齡為50～60周歲的結(jié)直腸癌病人血漿，同時采集6份同一年齡段健康人的血漿樣品，按照1.2節(jié)方法處理，用LC-MS/MS檢測。樣品中AA、13-HODE、9-HODE的色譜分離圖示于圖3。血漿中AA、13-HODE、9-HODE的含量示于圖4。結(jié)果表明，正常組血漿中AA、13-HODE、9-HODE的含量均略高于結(jié)直腸癌組。

圖3 實(shí)際樣品中13-HODE(a)、9-HODE(b)、AA(c)的分離色譜圖Fig.3 Chromatograms of 13-HODE (a), 9-HODE (b) and AA (c) in the actual samples

圖4 血漿樣品中AA、13-HODE和9-HODE的含量Fig.4 Contents of AA, 13-HODE and 9-HODE in plasma samples

3 結(jié)論

通過對血漿樣品進(jìn)行前處理，建立了LC-MS/MS法分析血漿中脂肪酸代謝產(chǎn)物AA、13-HODE、9-HODE，該方法具有良好的靈敏度、回收率和重現(xiàn)性，適用于血漿中脂肪酸及代謝產(chǎn)物的分析測定。

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