朱衛(wèi)麗　薛小萍

【摘 要】本文旨在研究聯(lián)合使用凍干血小板和冷沉淀對糖尿病難治創(chuàng)面的愈合作用。首先，選擇健康雄性小鼠作為研究對象，制作糖尿病難治創(chuàng)面模型。隨后，分別將凍干冷沉淀、凍干血小板、凍干血小板和凍干冷沉淀聯(lián)合作用于創(chuàng)面，作用5、10、15和20天后觀察難治創(chuàng)面的再上皮化速率；作用第15天后收集創(chuàng)面組織并檢測血管內(nèi)皮生長因子、一氧化氮合酶和一氧化氮的表達(dá)量。結(jié)果表明，F(xiàn)DP組，F(xiàn)DC組和FDP-FDC聯(lián)合組的再上皮化速率以及血管內(nèi)皮生長因子、一氧化氮合酶和一氧化氮的表達(dá)量均顯著高于糖尿病模型組，且FDP與FDC聯(lián)合組對糖尿病難治創(chuàng)面的愈合效果顯著高于FDP組或FDC組。因此，聯(lián)合使用凍干血小板和冷沉淀對糖尿病難治創(chuàng)面具有較好的促愈合作用。

【關(guān)鍵詞】凍干血小板；凍干冷沉淀；糖尿病；創(chuàng)面愈合

中圖分類號： R318.08 文獻(xiàn)標(biāo)識碼： A 文章編號：2095-2457（2018）06-0090-003

【Abstract】The object of this study is to reveal the effect of combined use of freeze-dried platelets （FDP） and freeze-dried cryoprecipitate （FDC） on promotion the healing of diabetic wound. The model of refractory diabetic wound was first established by using the healthy male mice. The wound was then treated with FDP and/or FDC for 5， 10， 15 and 20 days， respectively. The re-epithelialization rate of the treated wound was observed. Besides， the productions of vascular endothelial growth factor， endothelial nitric oxide synthase and nitric oxide in the treated wound were also determined. Results showed the re-epithelialization rate and the productions of vascular endothelial growth factor， endothelial nitric oxide synthase and nitric oxide of the wound treated by FDP and/or FDC were much better than those of the control model. Moreover， the combined use of FDP and FDC was better than the single use of FDP or FDC. Therefore， the combined use of FDP and FDC was benefit for the healing of diabetic wound.

【Key words】Freeze-dried platelets； Freeze-dried cryoprecipitate； Diabetic； Refractory wound

糖尿病患者的創(chuàng)面常呈現(xiàn)病程長、創(chuàng)面深、反復(fù)感染、創(chuàng)面上皮化遲緩等特征，形成創(chuàng)傷后很難治愈，常常導(dǎo)致病人截肢或死亡[1]。尋找能促進(jìn)糖尿病難治創(chuàng)面愈合的制劑已成為臨床急待解決的問題。血小板能釋放多種生長因子并誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生遷移，促進(jìn)細(xì)胞增殖、分化，從而促進(jìn)創(chuàng)面收縮，血管生成和組織重塑。而冷沉淀中含有VIII因子、纖維蛋白原、XIII因子以及纖維粘連蛋白等，具有促進(jìn)組織修復(fù)、愈合、肉芽組織再生、止血、抑菌等多種生物學(xué)功能[2-3]。因此，血小板和冷沉淀對創(chuàng)面均具有促愈合作用。

然而，由于新鮮血小板和冷沉淀都不易保存，不方便攜帶。若將二者凍為干粉，制成凍干血小板（Freeze-Dried Platelets，F(xiàn)DP）和凍干冷沉淀（Freeze-Dried Cryoprecipitate，F(xiàn)DC），不僅體積小、重量輕，而且可以長期儲存、便于運(yùn)輸，易于量化[4]。本文首次將FDP和FDC聯(lián)合用于糖尿病難治創(chuàng)面的愈合，將為新型促糖尿病難治創(chuàng)面愈合制劑的開發(fā)奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗動物選用健康雄性ICR小鼠，共40只，由揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)中心提供，鏈脲佐菌素購于 sigma公司，新鮮血小板和冷沉淀由揚(yáng)州市紅十字中心血站提供，酶聯(lián)免疫吸附試劑盒購買于廣州潤坤生物科技有限公司。

1.2 建立STZ 糖尿病小鼠模型

選用健康雄性ICR小鼠，在實驗環(huán)境中預(yù)飼養(yǎng)1周。建模前禁食12h，按65mg/kg劑量一次性腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ）溶液，用以誘發(fā)糖尿病。于72 h后測定血糖、尿糖，同時每周測體重。若注射后血糖濃度>16.7mmol/L，尿糖高于2+，即判定為糖尿病動物模型建模成功。

1.3 FDP和FDC的制備

FDP的制備：血小板中加入凍干保護(hù)劑（150mmol/L海藻糖、1μmol/LPGE、5mmol/LL-Arg、0.5mmol/L Phy、0.5μmol/L Biva、3% DMSO和5%人血清白蛋白），將處理后的血小板轉(zhuǎn)移到凍干瓶中，每瓶4mL（厚度不超過1.5cm）置于-80℃超低溫冰箱中預(yù)凍過夜，次日，先將凍干機(jī)溫度降至-45℃，再將樣品迅速移入凍干機(jī)進(jìn)行真空干燥，即得FDP。

FDC的制備：新鮮冰凍血漿在4 ℃下離心，棄去上清液，所得的不溶解絮狀物即為冷沉淀，將其冷凍干燥，即得FDC。

1.4 檢驗聯(lián)合使用 FDP和FDC對難治創(chuàng)面愈合作用

將實驗動物分為四組（每組10只小鼠）：（1）糖尿病模型組：在糖尿病小鼠創(chuàng)面噴灑無菌生理鹽水作為對照，無菌紗布包扎，每天一次；（2）FDP治療組：以FDP：無菌水=3：1（v/v）將FDP復(fù)水，調(diào)節(jié)細(xì)胞數(shù)，在凝血酶作用下活化，涂于糖尿病小鼠創(chuàng)面，無菌紗布包扎，每天用藥一次；（3）FDC治療組：將FDC中加入無菌生理鹽水復(fù)溶，涂于糖尿病小鼠創(chuàng)面，無菌紗布包扎，每天用藥一次；（4）FDP-FDC聯(lián)合治療組：將凍干血小板與冷沉淀復(fù)溶后混合涂于小鼠創(chuàng)面，無菌紗布包扎，每天一次。

1.5 創(chuàng)面愈合效果及分子表達(dá)的評價方法

創(chuàng)面愈合速度比較：分別于第 1、5、10、15、20 d用透明膜描記法和數(shù)碼相機(jī)記錄各組創(chuàng)面大小和變化，在分度為0.1mg的分析天平稱取透明膜質(zhì)量并換算成面積，計算再上皮化率。再上皮化率=（原始創(chuàng)面面積未愈創(chuàng)面的面積）/原始創(chuàng)面面積×100%。

干預(yù)后15d時，每組小鼠隨機(jī)挑選6只處死，剪取創(chuàng)面組織進(jìn)行勻漿，將勻漿得到的懸液在4℃離心機(jī)中以12000r/min的速度離心20min，取上清液，采用酶聯(lián)免疫吸附試劑盒測定血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、一氧化氮合酶（eNOS）、一氧化氮（NO）以及總蛋白含量，并計算每毫克總蛋白中VEGF、eNOS與NO的含量。

1.6 統(tǒng)計分析

采用 SPSS軟件錄入并分析實驗數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)均以x±s表示，p < 0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 創(chuàng)面再上皮化速率比較

如表1所示，干預(yù)后第5，10，15，20 d時，F(xiàn)DP組、FDC組和FDP-FDC聯(lián)合組的再上皮化速率均顯著高于糖尿病模型組，且FDP-FDC聯(lián)合組的再上皮化速率顯著高于FDP組和FDC組，各組兩兩比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（p<0.05）。

2.2 創(chuàng)面中血管新生分子VEGF、eNOS、NO的表達(dá)量

表2所示，干預(yù)第15d后，F(xiàn)DP組、FDC組和FDP-FDC聯(lián)合組小鼠難治創(chuàng)面中的VEGF、eNOS、NO的含量顯著高于糖尿病模型組，F(xiàn)DP-FDC聯(lián)合組的VEGF、eNOS、NO的含量顯著高于FDP組和FDC組，各組兩兩比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（p < 0.05）。

3 討論

糖尿病是一種常見的慢性病。隨著人們生活水平的提高，糖尿病的發(fā)病率呈逐年上升趨勢， 糖尿病的危害不僅在于以糖代謝為主的一系列代謝紊亂，還包括長期高血糖所引起的并發(fā)癥，其中，糖尿病性潰瘍是糖尿病并發(fā)癥當(dāng)中最嚴(yán)重且最難治愈的一種，給個人、家庭乃至國家?guī)砹藝?yán)重的經(jīng)濟(jì)和社會負(fù)擔(dān)。

血小板能釋放出20多種生長因子，在傷口愈合過程中，這些生長因子可增加血管的通透性、促進(jìn)血管生成、軟組織上皮化、傷口收縮和組織重塑等[5]。目前，局部應(yīng)用血小板濃縮物已被越來越多地用于口腔頜面部手術(shù)、整形外科、運(yùn)動醫(yī)學(xué)、泌尿外科等臨床醫(yī)學(xué)中[6-7]。由于新鮮濃縮血小板多采用22℃振蕩保存，有效期僅為5d，F(xiàn)DP將濃縮血小板經(jīng)過預(yù)處理液處理后冷凍真空干燥，以固態(tài)形式在室溫下長期儲存的一種血小板保存方式，具有體積小、質(zhì)量輕、不需要特殊保存設(shè)備、使用方便等優(yōu)點(diǎn)。Wolkers[8]等通過電鏡及紅外光譜分析證明復(fù)水化后的FDP的超微結(jié)構(gòu)及膜蛋白成分與新鮮血小板極其相似，在難治創(chuàng)面的治療方面具有顯著優(yōu)勢。FDC是將新鮮冰凍血漿在4℃離心后形成的不溶解的絮狀物，經(jīng)冷凍干燥制備而成的凍干制品，冷沉淀中主要含有VIII因子、纖維蛋白原、血管性血友病因子、XIII因子、以及纖維粘連蛋白等，可在細(xì)胞表面形成堅固的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，具有止血、促進(jìn)組織修復(fù)、愈合和創(chuàng)面肉芽組織的再生，維持滲透壓，使炎癥反應(yīng)局限等多種生物學(xué)功能。目前，冷沉淀已被局部外用于燒傷創(chuàng)面、肛腸手術(shù)、包皮環(huán)切術(shù)等術(shù)后的愈合[9-10]。為了明確兩者聯(lián)合使用對糖尿病難治創(chuàng)面愈合的影響，本文對干預(yù)后的創(chuàng)面再上皮化速率進(jìn)行了動態(tài)分析，發(fā)現(xiàn)干預(yù)后第5、10、15、20 d時，F(xiàn)DP組、FDC組和FDP-FDC聯(lián)合組的再上皮化速率均顯著高于糖尿病模型組，F(xiàn)DP-FDC聯(lián)合組的再上皮化速率顯著高于FDP組和FDC組，說明凍干血小板和凍干冷沉淀均有促進(jìn)糖尿病難治創(chuàng)面愈合的效果，而且聯(lián)合使用凍干血小板和冷沉淀對糖尿病難治創(chuàng)面的愈合作用更優(yōu)于單獨(dú)使用。

NO是反映血管內(nèi)皮功能的重要標(biāo)志物之一，NO生理水平增加引起血管擴(kuò)張，增加循環(huán)血量和氧供應(yīng)，可發(fā)揮保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用。通常，在內(nèi)皮細(xì)胞中，NO主要是由eNOS介導(dǎo)催化生成，因此，作為血管內(nèi)皮保護(hù)因子通過調(diào)節(jié)NO生物合成發(fā)揮作用[11-12]。VEGF 是血小板釋放的多種生長因子的一種，是體內(nèi)促血管生成作用最強(qiáng)的有絲分裂原，對內(nèi)皮細(xì)胞的分化、增殖以及遷移具有促進(jìn)作用。我們對糖尿病難治創(chuàng)面的上述三種血管新生分子的分析發(fā)現(xiàn)，干預(yù)后第15 d，F(xiàn)DP組、FDC組和FDP-FDC聯(lián)合組小鼠潰瘍創(chuàng)面中的VEGF、NO的含量顯著高于糖尿病模型組，F(xiàn)DP-FDC聯(lián)合組的VEGF、NO的含量顯著高于FDP組和FDC組，說明凍干冷沉淀和凍干血小板對血管的新生具有促進(jìn)作用，而且聯(lián)合使用凍干血小板和冷沉淀的作用更優(yōu)于單獨(dú)使用。

綜上所述，聯(lián)合使用凍干血小板和冷沉淀具有促進(jìn)糖尿病難治創(chuàng)面愈合的作用，且其作用大于單獨(dú)使用凍干血小板或凍干冷沉淀。由于凍干血小板及凍干冷沉淀均為生理性凝血物質(zhì)，組織相容性好，易降解、吸收，無毒副作用；且體積小，運(yùn)輸方便，可室溫長期保存，在保存期內(nèi)可保持內(nèi)部成分穩(wěn)定。因此，若將凍干血小板和凍干冷沉淀聯(lián)用作為促糖尿病難治創(chuàng)面愈合制劑，必然會具有廣闊的臨床應(yīng)用前景。

【參考文獻(xiàn)】

[1]Seshasai，S.R.K.，Kaptoge，S.，Thompson，A.，Di Angelantonio，E.，Gao，P.，Sarwar，N.，& Njolstad，I.（2011）.Diabetes mellitus， fasting glucose，and risk of cause-specific death.The New England Journal of Medicine，364（9），829-841.

[2]De Pascale，M.R.，Sommese，L.，Casamassimi，A.，& Napoli， C.（2015）.Platelet derivatives in regenerative medicine：an update. Transfusion Medicine Reviews，29（1），52-61.

[3]Morrison，J.J.，Ross，J.D.，Dubose，J.J.，Jansen，J.O.Midwinter， M.J.，& Rasmussen，T.E.（2013）.Association of cryoprecipitate and tranexamic acid with improved survival following wartime injury： findings from the MATTERs II Study.JAMA surgery，148（3），218-225.

[4]Horimizu，M.，Kawase，T.，Nakajima，Y.，Okuda，K.，Nagata， M.， Wolff， L. F.， & Yoshie，H.（2013）.An improved freeze-dried PRP-coated biodegradable material suitable for connective tissue regenerative therapy.Cryobiology，66（3），223-232.

[5]Gobbi，G.，& Vitale，M.（2012）.Platelet-rich plasma preparations for biological therapy：applications and limits. Operative Techniques in Orthopaedics，22（1），10-15.

[6]Preeja，C.，& Arun，S.（2014）.Platelet-rich fibrin：Its role in periodontal regeneration.The Saudi Journal for Dental Research，5（2），117-122.

[7]Alviti，F(xiàn).，Mangone，M.，Vanadia，M.，F(xiàn)iorentino，C.，&Santilli;，V.（2014）. Surgical Achilles tendon tears using platelet-rich fibrin matrices and conventional methods：Kinetics and kinematics evaluation.Annals of Physical and Rehabilitation Medicine，57，e280.

[8]Wolkers，W.F.，Walker，N.J.，Tablin，F(xiàn).，&Crowe;，J.H. （2001）. Human platelets loaded with trehalose survive freeze-drying. Cryobiology，42（2），79-87.

[9]Grassetti，L.，Scalise，A.，Lazzeri，D.，Carle，F(xiàn).，Agostini，T.，Gesuita，R.，&Di; Benedetto，G.（2014）.Perforator flaps in late-stage pressure sore treatment：outcome analysis of 11–year-long experience with 143 patients.Annals of Plastic Surgery，73（6），679-685.

[10]Nascimento，B.，Goodnough，L.T.，& Levy，J.H.（2014）.Cryoprecipitate therapy.British Journal of Anaesthesia，113（6），922-934.

[11]King，A.L.，Polhemus，D.J.，Bhushan，S.，Otsuka，H.，Kondo，K.，Nicholson，C.K.，&Lefer;，D.J.（2014）.Hydrogen sulfide cytoprotective signaling is endothelial nitric oxide synthase-nitric oxide dependent.Proceedings of the National Academy of Sciences，111（8），3182-3187.

[12]Kincer，J.F.，Uittenbogaard，A.，Dressman，J.，Guerin，T.M.，F(xiàn)ebbraio，M.，Guo，L.，& Smart，E.J.（2013）.Hypercholesterolemia promotes a CD36-dependent and endothelial nitric-oxide synthase-mediated vascular dysfunction.The Journal of Biological Chemistry，288（9），6584.