★楚淑芳 趙恒俠 劉德亮 劉雪梅 渠昕 李增英 李金花 劉玲 李惠林*（深圳市中醫(yī)院 廣東 深圳 518033）

糖尿病（diabetes mellitus， DM）已成為世界范圍的嚴(yán)重危害人們健康的疾病，據(jù)國際糖尿病聯(lián)盟統(tǒng)計，到2030年，全球?qū)⒂?.52億人受到糖尿病的困擾。到2030年，全球?qū)⒂?.52億人受到糖尿病的困擾。目前，我國已成為僅次于印度的糖尿病第二大國［1］。糖尿病性骨質(zhì)疏松（diabetic osteoporosis， DOP）是一種常見的糖尿病并發(fā)癥，其主要癥狀除糖尿病及其他并發(fā)癥癥狀之外，還伴有髖部、腰骶部等部位疼痛或持續(xù)性肌肉疼痛等表現(xiàn)，并且容易發(fā)生骨折。其主要病理改變?yōu)閱挝惑w積內(nèi)骨量減少，骨強度減弱、脆性增加等。流行病學(xué)資料顯示，在DM患者中，DOP的發(fā)病率可達(dá)60%［2］，DM是OP發(fā)展的一個重要因素［3］。目前DOP的治療，主要以抗骨質(zhì)疏松藥物治療為主，然而此類藥物治療效果仍存在爭議，且價格昂貴，有些患者對其副作用不能耐受。由此，中藥的抗骨質(zhì)疏松作用逐漸受到重視。

糖尿病歸屬中醫(yī)學(xué)“消渴”范疇，而中醫(yī)文獻(xiàn)無骨質(zhì)疏松癥病名，目前多數(shù)醫(yī)家認(rèn)為描述較準(zhǔn)確者應(yīng)屬“骨痿”，《丹溪心法》中就有兩者相關(guān)性的論述：“消腎，腎虛受之，腰膝枯細(xì)，骨節(jié)酸疼?！爆F(xiàn)代醫(yī)家通過多年的實驗及臨床研究證明了腎虛、血瘀、痰濕是消渴與骨痿并發(fā)的重要病機(jī)。中醫(yī)藥對于其治療主要是在補益脾腎基礎(chǔ)上合以益氣養(yǎng)陰、活血化瘀通絡(luò)之法。滋腎降糖丸是深圳市中醫(yī)院自行研發(fā)的中藥復(fù)方，具有益氣養(yǎng)陰，滋腎壯骨的作用，符合從“腎主骨”理論入手治療骨質(zhì)疏松。前期研究發(fā)現(xiàn)，滋腎降糖丸不僅具有良好的降糖、調(diào)脂、提高胰島素敏感性等作用，而且體外研究發(fā)現(xiàn)其可發(fā)揮多靶點抗骨質(zhì)疏松作用，但作用機(jī)制不明，因此需要對其進(jìn)一步研究。因此，本課題首先建立DOP的動物模型，進(jìn)行不同劑量滋腎降糖丸的干預(yù)治療，對其骨密度（bone mineral density，BMD）、骨組織形態(tài)學(xué)進(jìn)行研究。

1 實驗材料

2月齡SPF級健康雄性Wistar大鼠60只（合格 證 號：44002100006561），體 重 160～190g，購自南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。動物飼養(yǎng)于深圳市疾病預(yù)防控制中心SPF級動物房，環(huán)境溫度18℃～22℃，自然晝夜節(jié)律光照（12h：12h），自由飲水、攝食，環(huán)境濕度40%～70%；SPF級大鼠飼料購自廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心。

滋腎降糖丸：由深圳市中醫(yī)院藥學(xué)部制備，組成成分主要有黃芪、生地黃、熟地黃、淫羊藿、五味子、仙茅、仙靈脾、狗脊、鱉甲、龜板等，滋腎降糖丸（批號：粵Z20070085）用溫?zé)嵴麴s水融化，并濃縮成含生藥1g/mL。實驗時用0.5%

羧甲基纖維素鈉配成所需要濃度的混懸液。鏈脲佐菌素（streptozocin，STZ）購自美國Sigma公司。

雙能X線骨密度儀（GE，美國），BX61顯微鏡（OLYMPUS，日本），sp1600硬組織切片機(jī)（Leica，德國），Tissue-Tek DRS 2000染色機(jī)（SAKURA，日本）。

2 實驗方法

2.1 模型制作與實驗分組 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)2周（標(biāo)準(zhǔn)飲食），隨機(jī)取10只作為正常對照，余50只為模型組。所有大鼠禁食12h后，造模組按60mg/kg劑量腹腔注射0.2%STZ（稀釋液為0.1M檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，pH值4.5），正常對照組腹腔注射相同量的0.1M檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液（pH值4.5）。采用血糖儀測給藥后72h大鼠尾靜脈血糖值，選取空腹血糖＞16.7mmol/L者，普通飼料喂養(yǎng)2周后同樣方法再次測量空腹血糖仍＞16.7mmol/L認(rèn)為造模成功。造模成功者共30只，隨機(jī)分為模型組、中藥高劑量組（3.0g/kg）、中藥低劑量組（1.5g/kg）。加正常組，共4組，每組10只大鼠。造模成功后次日開始治療，治療方案如下。

正常組與模型組予0.5%羧甲基纖維素鈉10mL/kg/天灌胃；中藥高、低劑量組按不同的濃度（中藥高劑量組濃度為3.0g/kg、中藥低劑量組濃度為1.5g/kg）給予10mL/kg/d灌胃。治療療程為3個月。處理結(jié)束后行雙能X線檢查。1周后，所有大鼠禁食12h，戊巴比妥鈉（50mg/kg）腹腔注射麻醉，腹主動脈采血處死，取骨組織固定及-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 骨密度檢測 各組大鼠治療結(jié)束后，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，應(yīng)用雙能X線骨密度儀及小動物專用軟件檢測分析骨密度，測量參數(shù)為雙能電壓41kVp和100kVp，掃描窗寬18cm，掃描速率4.8s/cm，處死前進(jìn)行全身骨密度、股骨以及腰椎骨密度測量。

2.3 骨硬組織切片及HE染色

2.3.1 硬組織切片 取股骨髁樣本，去除骨膜及軟組織，修整；立即放入4%多聚甲醛溶液中，固定；清水沖洗24h；以75%、85%、95%、100%梯度乙醇脫水；放入無水丙酮以置換組織中的乙醇；以聚甲基丙烯酸甲脂（PMMA）包埋；以硬組織切片機(jī)與植入體垂直橫行截面、切片；砂紙磨片至50μm。

2.3.2 HE染色 二甲苯5min，二甲苯3 min，100%酒精30s，100%酒精30s，95%酒精30s，90%酒精 30s，自來水洗 10～30s，蘇木素染色 10～15min，流水洗20秒，1%鹽酸酒精分化切片10s，流水沖洗15min，1%伊紅染色3min，90%酒精30s，95%酒精30s，95%酒精30s，100%酒 精30s，100%酒精30s，100%酒精30s，石炭酸二甲苯30s，二甲苯30s，二甲苯30s，二甲苯30s；中性樹膠封片。

2.4 統(tǒng)計學(xué)處理 所得數(shù)據(jù)應(yīng)用State12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析、處理，計量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。計量資料組內(nèi)比較采用配對t檢驗，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗；計數(shù)資料采用χ2檢驗。各組間差異采用單因素方差分析（ANOVA），組間多重比較用Bonferroni檢驗。以P＜0.05表示有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 實驗結(jié)果

3.1 各組大鼠不同部位骨密度（Bone mineral density，BMD）的比較 經(jīng)單因素方差分析知，各組大鼠全身BMD之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），進(jìn)一步行Bonferroni檢驗得，正常組與模型組、中藥高劑量組與模型組之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），而中藥低劑量與模型組、中藥低劑量與中藥高劑量之間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。對于脊柱及股骨BMD，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析得各組大鼠脊柱BMD之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），經(jīng)Bonferroni檢驗可知，模型組與正常組，中藥高、低劑量組與模型組之間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 各組大鼠不同部位BMD（，n=10） g/cm2

表1 各組大鼠不同部位BMD（，n=10） g/cm2

注：與正常組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

分組 全身 脊柱 股骨正常組 0.18±0.014 0.16±0.012 0.18±0.013模型組 0.13±0.008** 0.11±0.007** 0.13±0.013**中藥高劑量組 0.15±0.006▲ 0.12±0.006▲ 0.14±0.005▲▲中藥低劑量組 0.14±0.011 0.13±0.01▲▲ 0.15±0.015▲

3.2 骨硬組織切片HE染色

圖1 各組大鼠股骨硬組織切片（HE染色，×200）

由圖1可以看出，正常組骨小梁分布均勻，排列整齊（圖A）；而模型組骨小梁結(jié)構(gòu)變細(xì)，排列疏松，甚至大片區(qū)域骨小梁缺失（圖B）；而中藥高劑量組骨小梁分布均勻，排列尚可，骨小梁較模型組粗大、均勻（圖C）；中藥低劑量組骨小梁結(jié)構(gòu)較模型組亦有改善，數(shù)目較模型組增多，排列較模型組整齊（圖D）。

4 討論

本課題主要從骨密度、骨組織形態(tài)學(xué)方面對滋腎降糖丸的抗骨質(zhì)疏松作用進(jìn)行了系統(tǒng)研究?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為骨質(zhì)疏松是一種以骨量減少及骨組織微結(jié)構(gòu)退化為主要表現(xiàn)的骨骼代謝疾病，其導(dǎo)致骨強度降低，骨脆性增加，易致骨折［4］。在本實驗研究中，應(yīng)用DEXA檢測后發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠骨密度明顯下降（P＜0.05），而經(jīng)過滋腎降糖丸治療后，DM大鼠的全身、腰椎及股骨骨密度明顯提高（P＜0.05）。

DOP除了骨量減少的因素外，還與骨結(jié)構(gòu)因素和骨內(nèi)微損傷的數(shù)量有關(guān)，骨微損傷存在于活體骨中并影響骨組織微結(jié)構(gòu)性質(zhì)和功能［5］。骨小梁退行性改變與顯微骨折導(dǎo)致了骨小梁結(jié)構(gòu)強度下降，因此骨顯微結(jié)構(gòu)的改變可以更直接地反映骨質(zhì)疏松情況。在本實驗中，骨硬組織切片HE染色結(jié)果則提示糖尿病大鼠骨皮質(zhì)變薄，骨小梁數(shù)目及面積減少，部分?jǐn)嗔?，結(jié)構(gòu)不連續(xù)；而經(jīng)高、低劑量滋腎降糖丸治療后，糖尿病大鼠骨形成明顯活躍，松質(zhì)骨與皮質(zhì)骨骨量明顯增加，骨密度升高，同時骨組織形態(tài)獲得顯著改善，骨量丟失得到抑制。

本課題以腹腔注射大劑量STZ構(gòu)建T1DM模型，此種方法誘導(dǎo)的T1DM動物模型已被證實可導(dǎo)致低骨形成，誘導(dǎo)后8～12周可出現(xiàn)骨量減少［6-7］，我們的前期的預(yù)實驗通過腹腔注射60mg/Kg 0.2%STZ成功構(gòu)建T1DM動物模型后，普通飼料喂養(yǎng)8周后檢測血清骨形成及骨吸收標(biāo)志，測大鼠全身、脊柱及股骨骨密度，行股骨下段HE染色，均證實了此模型可以誘導(dǎo)骨質(zhì)疏松。成功構(gòu)建DOP模型后，給予不同劑量滋腎降糖丸治療，經(jīng)治療3個月后，治療組大鼠骨密度得到明顯改善，，同時骨組織形態(tài)獲得顯著改善，骨量丟失得到抑制。Silva等［8］的研究也表明，STZ誘導(dǎo)的T1DM大鼠骨小梁骨密度逐漸喪失，皮質(zhì)骨生長過早停止，骨整體硬度和強度的降低導(dǎo)致骨干轉(zhuǎn)動力矩的降低。骨材料強度略有下降也可導(dǎo)致整體骨強度的降低，和非酶膠原交聯(lián)增加有關(guān)，故得出結(jié)論：T1DM短期內(nèi)占主導(dǎo)作用的是改變骨結(jié)構(gòu)而非骨骼質(zhì)量。這和我們的研究結(jié)論相符合。

滋腎降糖丸是我院自行研發(fā)的中藥復(fù)方，具有益氣養(yǎng)陰，滋腎壯骨的作用，符合從“腎主骨”理論入手治療骨質(zhì)疏松。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，滋腎降糖丸降糖具有明確的降糖調(diào)脂作用，并且能使胰島素敏感性提高，同時還能夠抗氧化，保護(hù)血管內(nèi)皮，降低炎癥因子水平等作用［9-12］。更重要的是，在抗骨質(zhì)疏松方面，體外研究發(fā)現(xiàn)，滋腎降糖丸含藥血清能通過下調(diào)人脂肪酸結(jié)合蛋白4（Fatty Acid Binding Protein 4， FABP4）及氧化物酶體增殖物激活受體γ2（peroxisome proliferators-activated receptors γ2，PPAR γ2）表達(dá)抑制小鼠骨髓間質(zhì)干細(xì) 胞（Bone marrow derived mesenchymal stem cells，BMSCs）成脂分化，上調(diào)RUNX2和BMP-2基因表達(dá)，促進(jìn)BMSCs成骨分化，從多靶點發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松作用［13-14］。而本實驗通過觀察不同濃度滋腎降糖丸對DOP大鼠骨密度及骨組織形態(tài)學(xué)的影響，從組織形態(tài)學(xué)角度證明了其抗骨質(zhì)疏松作用，但對于其具體機(jī)制還需要更深入的研究，比如隨著現(xiàn)代生物學(xué)的發(fā)展，可以應(yīng)用基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)等系統(tǒng)生物學(xué)研究方法對其進(jìn)行更深入的研究，加之計算機(jī)、數(shù)學(xué)等學(xué)科的協(xié)助以及生物信息學(xué)的不斷發(fā)展和完善，給中醫(yī)藥復(fù)方研究帶來了新的思路和方法。綜上所述，滋腎降糖丸可以提高DOP大鼠的骨密度，改善骨組織形態(tài)，從而發(fā)揮其抗骨質(zhì)疏松作用，對于其可能的機(jī)制需進(jìn)一步研究。

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